專利名稱：治療血管相關(guān)疾病的包含肽的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療水腫、缺血和血管相關(guān)疾病的化合物，該化合物通過穩(wěn)定血管壁以形成和維持新血管，從而防止血液滲漏并幫助正常血管生長。更具體地，本發(fā)明涉及能夠用作治療血管相關(guān)疾病治療劑的組合物，該組合物通過利用含有堿性氨基酸-Gly-Asp序列的肽和/或干細胞形成和維持正常血管，從而防止血液滲漏。
背景技術(shù)：
作為血管疾病之一的缺血也被稱為局部缺血，在局部缺血中，供給到組織的血液因血管狹窄、收縮、血栓、栓塞等原因被止住而導(dǎo)致細胞損傷。1961年，據(jù)Majno和I^lade報告，血液滲漏是由于由組織胺、緩激肽和5_羥色胺引起的炎癥導(dǎo)致小靜脈血管的內(nèi)皮細胞之間形成間隙造成的。是(Majno G. ,Palade G. E.， 生物物理學(xué)和生物化學(xué)細胞學(xué)雜志(J. Biophys. Biochem. Cytol.) 11 :571-605(1961)； Majno G. , Palade G. E. , Schoefl G. I. , J. Biophys. Biochem. Cytol. 11 :607-625 (1961)。已知血管內(nèi)皮細胞之間的間隙是在暴露于炎癥誘導(dǎo)劑以及各種細胞因子 (Claudio L.等·，Lab Invest. 70 :850-861(1994) ；Wu N. Ζ. , Baldwin A.L.Am.生理學(xué)雜志(J Physiol). 262 :H1238-1247(1992))、蛋白酶(Volkl K. P.，DierichsR.血栓研究(Thromb. Res.) 42 11-20 (1986))、輕微灼傷(Clough G.等，J. Physiol. 395 99-114(1988))之后產(chǎn)生的。在不同種類的癌癥中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象(HcAbs S. K.等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. ki. USA) 95 :4607-4612(1998) ；Roberts W. G.等，美國病理學(xué)雜志(Am. J Pathol. ) 153 =807-830(1998) ；Nishio S.等，神經(jīng)病理學(xué)學(xué)報(Acta. Neuropathol). (Berl) 59 1-10 (1983)。除癌癥之外，這種現(xiàn)象在人哮喘病(Laitinen A.， Laitiene L. A.過敏進展(Allergy Proc). 15 :323-3 (1994))、色素性蕁麻疹(Ludatscer R.M. Microrasc. Res. 31 :345-355 (1986))、風濕病(Schumacher H. R. Jr.紐約科學(xué)院院報 (Ann. N. Y. Acad. Sci. )256 :39-64(1975))等病癥中也有體現(xiàn)。血管具有各種特征，例如在慢性炎癥的情況下，與血管變化相關(guān)的特征包括血管舒張和血管生成。這時，人們發(fā)現(xiàn)血管的形狀變成畸形，它具有異常特征而非正常特征，以及血管的直徑增加，同時在鼠慢性氣管炎癥模型中，對血管假性血友病因子和P-選擇蛋白 (血小板選擇蛋白)的免疫反應(yīng)提高。如上所述揭示出，與正常小鼠的血管相比，畸形血管對免疫介質(zhì)的反應(yīng)能力較差。為此，為了開發(fā)出能夠抑制或減慢異常血管生長或血液滲漏的物質(zhì)，人們做出了很多努力。據(jù)報道，合成肽麥斯蒂辛斯(mystixins)能夠抑制血漿滲漏不阻止血管內(nèi)皮細胞中的間隙形成(Blauk P.等，藥理學(xué)與實驗治療學(xué)雜志(J. Pharmacol. Exp. Ther.), 284:693-699(1998))。同樣，如果血管內(nèi)皮細胞中的間隙形成得到抑制，β _2_腎上腺素能受體激動劑福莫特羅減少血液滲漏(Blauk P.和McDonald D. Μ. , Am. J. Physiol, 266 L461-468(1994))ο已經(jīng)有很多嘗試來開發(fā)引起血管形態(tài)變化的物質(zhì)，血管生成素是其中關(guān)注的焦點物質(zhì)之一。血管生成素-1具有穩(wěn)定血管的功能(Thurston G.等，天然藥物(Nat. Med). 6 (4) :460-3 (2000))，并能夠使血管內(nèi)皮生長因子的血管生成穩(wěn)定化，因此能抑制血液滲漏。已報道這一機理用于治療包括慢性糖尿病中因外周血管疾病引起的視網(wǎng)膜病、 因血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病等(J0ussen A.M.等，Am. J.Pathol. 160(5) 1683-93(2002))的疾病。然而，重組血管生成素_1因其存在諸如穩(wěn)定性、可溶性等問題而不能直接用于疾病治療，因此，人們已把努力開發(fā)具有血管生成素-1活性的取代物作為另一種選擇(Koh G.Y.等，實驗與分子病理學(xué)(Exp. Mol. Med). 34(1) :1-11 (2002))。近年來， 人們已知通過激活血小板以釋放血管生成素-1可以穩(wěn)定血管形成中新生的血管(Huang 等，血液(Blood)95 =1993-1999 (2000)) 0而且，據(jù)報道，凝血酶與激活血小板以從血小板中釋放血管生成素-1有關(guān)(Li等，血栓與止血學(xué)(Throm. Haemos) t. 85 =204-206 (2001))。然而，凝血酶不僅能釋放出血管生成素-1來穩(wěn)定血管，而且它還是伴隨血小板凝固現(xiàn)象的一部分。所以，使用凝血酶來控制血管生成素-1的釋放是很困難的，并且預(yù)計可能會存在因血液凝固而產(chǎn)生的副作用。此外，人們一直致力于尋找誘導(dǎo)生成血管生成素-1的化合物， 但是現(xiàn)有技術(shù)中卻沒有這種化合物的報道。已經(jīng)已知常規(guī)的含有RGD基序和KGD基序的肽抑制血管形成(Victor I. R.和 Michael S. G.前列腺(Prostate) 39 :108-118 (1999) ；Yohei M.等，生物化學(xué)雜志(J. of Biological Chemistry) 276 :3 :31959-31968 (2001))。據(jù)報道，當含有 RGD 基序和 KGD 基序的肽與血管內(nèi)皮細胞的ον β 3整聯(lián)蛋白結(jié)合時，就會出現(xiàn)上述效應(yīng)(Pasqualini R.等， 天然生物化學(xué)(Nat. Biotechnol). 15(6) :542-6 (1997))。通常，整聯(lián)蛋白是血管內(nèi)皮細胞生長必需的細胞與細胞間或細胞與底物間介質(zhì)(Brian P. Eliceiri，環(huán)境研究(Circ. Res). 89:1104-1100(2001))。所以，與整聯(lián)蛋白結(jié)合以抑制其作用的解聚素含有構(gòu)成纖維蛋白原主要結(jié)構(gòu)基序之一的RGD或KGD基序。為此，出現(xiàn)了很多嘗試關(guān)于有多少含有 RGD和KGD序列的肽的研究，所述肽結(jié)合整聯(lián)蛋白以通過中斷血管內(nèi)皮細胞的生長遷移而抑制血管生成。此外，如在國際專利公開No. WO 95/25543(1995)中所公開的，組織中的血管生成需要整聯(lián)蛋白α ν β 3，并且抑制血管形成的含RGD和KGD基序的肽用于抑制血管形成，因此通過抑制新血管的形成和消滅新形成的血管而阻斷血液供給。美國專利 No. 5，766，591 (1998)揭示了利用包含RGD和KGD基序的肽作為整聯(lián)蛋白α ν β 3的拮抗劑抑制血管形成可以抑制實體癌的生長。近年來，為了治療心臟疾病，已經(jīng)嘗試研發(fā)能夠通過以纖維蛋白原作為配體結(jié)合整聯(lián)蛋白中的α nb β 3并抑制整聯(lián)蛋白的抑制劑(Topol等，Lancet353 :227-231 (1999)； Lefkovits 等，新英格蘭醫(yī)藥雜志(N. Eng. J. Med). 23 :15530-1559 (1995) ；Coller BS 臨床研究雜志(J. Clin. Invest). 99 :1467-1471))。然而，據(jù)報道這些嘗試都沒有獲得成功 (OtNeill 等，N. Eng. J. Med. 342 :1316-1324(2000) ；Cannon 等，循環(huán)(Circulation) 102 149-156(2000))。這也是含有RGD和KGD基序的肽能夠以濃度依賴方式激活整聯(lián)蛋白以誘導(dǎo)激活血小板，以及能和現(xiàn)有的整聯(lián)蛋白結(jié)合以抑制整聯(lián)蛋白活化的原因(Karlheinz 等，Throm. Res. 103 :S21-27 (2001) ；Karlheinz 等，Blood 92(9) :3240-3249 (1998))。整聯(lián)蛋白中存在誘導(dǎo)配體的結(jié)合位點(Ligand-induced binding site，LIBS)。這時，如果所述RGD和K⑶肽與整聯(lián)蛋白結(jié)合，就會誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白構(gòu)象發(fā)生變化并暴露LIBS，接著配體就與暴露的LIBS相結(jié)合從而激活血小板(Leisner等，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem). 274 12945-12949(1999))。據(jù)報道所述血小板的激活能夠在低濃度而非高濃度的條件下得到誘導(dǎo)。如果RGD和KGD基序能夠以這種方式穩(wěn)定血小板，在血小板激活過程中分泌的細胞因子(例如，血管生成素-1)可能有助于增加和穩(wěn)定而非抑制血管形成。本發(fā)明中，得到了非常不同的結(jié)果，含RGD和KGD基序的肽并非如上文所述通過抑制和消滅新生血管來抑制血液供給，而是通過促成正常血管的形成和穩(wěn)定已生成的血管來抑制血液滲漏，因此有利于血液供給。經(jīng)證實，含有RGD和KGD基序的肽不能有效地通過直接與整聯(lián)蛋白反應(yīng)而抑制血管生成，但是它卻能有效地治療和預(yù)防損傷(injury)、燒傷、褥瘡和慢性潰瘍，同時還能預(yù)防血液滲漏以治療眼內(nèi)疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑變性等，它對血管的形成和穩(wěn)定也很有效，同時含RGD和KGD基序的肽在次級反應(yīng)中抑制異常的血管形成。而且，在脫發(fā)或灰發(fā)癥(trichopoliosis)的情況下，與血管接觸的毛囊負責形成組成頭發(fā)的髓質(zhì)、皮質(zhì)、角質(zhì)層。這時，如果由于異常血管中的血液滲漏導(dǎo)致不能促成平穩(wěn)提供給毛囊的血液供給，那么毛囊，即毛發(fā)就不會形成，同樣由于不能在組成毛干的毛根細胞中正常形成黑素體而導(dǎo)致毛色變白的灰發(fā)癥?？梢灶A(yù)料，由于其能夠通過穩(wěn)定血管形成來抑制血液滲漏繼而促進血液供給，本發(fā)明提供的組合物還能夠有效地預(yù)防和治療這些病癥。另外，可以預(yù)料該組合物能夠同樣有效地預(yù)防和治療與肥胖相關(guān)的心血管疾病，同樣也是用于人造皮膚和移植、局部缺血的血管治療劑。作為另外一種選擇，有一種方法能夠促進正常新血管在血管損失階段生成，并能夠預(yù)防隨后階段出現(xiàn)的疾病。在這種方法中，已經(jīng)有使用干細胞治療眼血管疾病的嘗試。已知骨髓包含可以形成新血管內(nèi)皮前體細胞(EPCs)，并且據(jù)報道當為了促進視網(wǎng)膜血管生成而施用骨髓來源的造血干細胞(HSCs)時，其能充當內(nèi)皮前體細胞的角色 (Grant Μ. B.等，Nature Med. 8 =607-612 (2002)) 內(nèi)皮前體細胞可以分化成同血管發(fā)生有關(guān)的循環(huán)EPCs (cEPCs)。另外，據(jù)報道造血干細胞(heamatopoietic stem cells, H(^s)、造血祖細胞(HPCs)等均與新血管的形成和維持有關(guān)(Rafii S.等，Nature Med. 9 7027-712(2003)) 0據(jù)報道為了治療目的通過將骨髓來源的造血干細胞施用至小鼠眼中的玻璃體腔內(nèi)，造血干細胞可以充當祖細胞用于形成視網(wǎng)膜血管(Otani A.等，Nature Med. 9 :1004-1010(2002)).除造血干細胞之外，也報道了各種類型的干細胞，諸如胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞等。在自體移植中，造血干細胞不會引起免疫排異反應(yīng)，但在同種異基因移植或異種移植中，它會引起免疫排異反應(yīng)。因此，上述方法中的問題仍有待解決。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明就是為解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題而設(shè)計的，因此，它的目的就是提供一種能利用含有特定序列的肽誘導(dǎo)正常血管生成的治療劑。為了完成上述目的，本發(fā)明提供了能夠治療水腫和/或血管相關(guān)疾病的包含含有 Xaa-Gly-Asp序列的肽作為有效成分的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明，所述肽中的氨基酸Xaa優(yōu)選為精氨酸或賴氨酸，并且肽的序列最優(yōu)選是SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所列的序列。根據(jù)本發(fā)明，所述肽序列也包括選自從SEQ ID NO :4，以及SEQ ID NO :6到SEQ ID NO 10所組成的組中的一個肽序列。本發(fā)明中，血管相關(guān)疾病包括但不特別局限于選自下列的疾病所組成的組中糖尿病視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性、青光眼、糖尿病足潰瘍、肺動脈高壓、 缺血性心肌病(ischemic myocardium)、缺血性腦病、皮瓣(skin flap)存活、心力衰竭、急性后肢缺血、損傷、灼傷、褥瘡、慢性潰瘍、脫發(fā)或正常毛細血管形成條件下的灰發(fā)癥、肥胖相關(guān)的心血管疾病、用于人工皮膚和移植的血管治療劑和局部缺血。還可以預(yù)料包含RGD和KGD基序的肽能夠有效治療脫發(fā)或正常毛細血管形成中的灰發(fā)癥或肥胖相關(guān)的心血管疾病，而且還可有效治愈因水腫及局部缺血或燒傷造成的損傷，同時可以治療和預(yù)防褥瘡和慢性潰瘍。另外，本發(fā)明中的肽還可以誘導(dǎo)血管生成素-1的分泌。同樣，據(jù)報道在單側(cè)輸尿管梗塞模型(UUO)中，作為改良的血管生成素-1的 COMP-Angl具有保護腎的血管內(nèi)皮細胞以抑制炎癥，從而阻止單核細胞或巨噬細胞的浸潤作用，而且還具有通過減少組織中TGF-β 1的數(shù)量來抑制Smad2/3磷酸化和激活 Smad7以減輕腎纖維化的作用(Kim等，美國腎病學(xué)會雜志(J. Am. Soc. Nephrol.) 17 ^74-2483(2006))。已經(jīng)揭示血管生成素_1可被用作能特異性地對腎纖維化中的血管內(nèi)皮細胞做出反應(yīng)以治療腎疾病的治療劑。依據(jù)本發(fā)明，認為含有RGD或KGD基序的多肽可以通過間接誘導(dǎo)體內(nèi)血管生成素-1的釋放用于治療腎疾病。本發(fā)明的包含序列Xaa-Gly-Asp的多肽可以單獨使用，但是如果與VEGF(BeneSt 等，微循環(huán)(Microcirculation) 13 :423-437 0006))或 bFGF 聯(lián)合使用，將更有效。此外，本發(fā)明提供了用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，該組合物除了所述肽之外還包含干細胞。根據(jù)本發(fā)明，干細胞優(yōu)選是至少具有分化成血管內(nèi)皮細胞能力的干細胞，例如胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞和造血干細胞。此外，能用本發(fā)明中包含干細胞的組合物治療的血管相關(guān)疾病是但不限于選自由肺動脈高壓、局部缺血心肌病、皮瓣存活、心力衰竭、急性后肢局部缺血、眼部疾病所組成的組中。本發(fā)明中描述的具有治療諸如局部缺血的疾病能力的肽包括含有序列 Xaa-Gly-Asp的肽或其片段或其具有相同功能的衍生物，并且，如果用干細胞來治療所述疾病，那么優(yōu)選所述干細胞和含有序列Xaa-Gly-Asp的多肽一起使用。能夠用本發(fā)明的蛋白質(zhì)和干細胞治療或預(yù)防的血管生成相關(guān)疾病優(yōu)選是利用誘導(dǎo)血管生成素-ι的分泌穩(wěn)定新生血管的治療機制治療的疾病，這些疾病選自由肺動脈高壓(Ann Thorac Surg 20042 月 77 (2) 449-56)、心肌缺血(與 VEGF ;Biochem Biophys Res Commun. 200310 月 24 ；310 (3) :1002-9)、皮瓣存活(顯微外科手術(shù)(Microsurgery.) 2003 ； 23(4) :374-80)、心力衰竭(冷泉港定量生物學(xué)會議錄(Cold Spring Harb Symp Quant Biol) 2002 ;67 :417-27)、急性后肢缺血(與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；生命科學(xué)(Life Sci) 20036月20 ；73 (5) :563-79)等所組成的組中，更優(yōu)選眼部疾病。
適用本發(fā)明治療的眼部疾病具體是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、青光眼等。本發(fā)明藥學(xué)可用的組合物包含例如可用的稀釋液、添加劑或載體。本發(fā)明的藥學(xué)可用的組合物包含所述肽和適于遞送或施用到體內(nèi)或體外的組織或器官中的藥學(xué)可用的組合物。由于肽和/或蛋白質(zhì)可能含有酸性和/或堿性的末端和/或側(cè)鏈，所以本發(fā)明的藥物組合物可以包含以游離酸或游離堿或藥學(xué)上可用的鹽形式存在的肽和/或蛋白質(zhì)。藥學(xué)上可用的鹽可能含有合適的能與本發(fā)明中的肽和/或蛋白質(zhì)形成堿的酸，所述合適的酸選自由無機酸和有機酸所組成的組中，其中無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸及它們的衍生物；有機酸有甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、鄰氨基苯甲酸(anthranilic acid)、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸及它們的衍生物。與目標蛋白質(zhì)形成堿的合適的堿例如包括無機堿和有機堿；所述無機堿諸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀及它們的衍生物；所述有機堿諸如單、二和三烷基胺(例如三乙胺、二異丙胺、甲胺、二甲胺及它們的衍生物)和任選取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺及它們的衍生物)。所述藥物組合物可以以各種途徑給藥，包括但不局限于腸胃外、腸、局部的給藥或吸入。腸胃外給藥是指任何不經(jīng)過消化道的給藥，包括但不局限于注射液(即下文描述的靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和其他注射方式)。腸內(nèi)給藥就是用于腸胃外給藥的任何給藥方式，它包括但不局限于片劑、膠囊、口服溶液、混懸液、噴霧劑及它們的衍生物。為此，腸內(nèi)給藥途徑指經(jīng)直腸和陰道的給藥。局部給藥途徑包括但又不局限于乳劑、軟膏、凝膠劑和腸胃外帖劑(parenteral patches)的任何給藥方式(也可參見雷氏藥學(xué)大全(Remington，s Pharmaceutical kiences)，第18版，Gennaro，等，馬克印刷公司，伊斯頓，賓夕法尼亞 (Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania)，1990)。例如，本發(fā)明的腸胃外藥物組合物例如可以靜脈(靜脈內(nèi)地)給藥、動脈(動脈內(nèi)地)給藥、肌肉(肌內(nèi)注射地)給藥、給藥給皮膚(皮下或植入組合物(depot composition))，通過冠狀動脈的注入或利用遞送入組織或器官的溶液給藥給心包。可注射的組合物可以是適合注射給藥途徑的藥物組合物，其中注射包括但不局限于注射到靜脈、動脈、冠狀血管、血管周圍的間皮瘤、肌肉內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)的給藥?？勺⑸涞乃幬锝M合物可以是能直接給藥至心臟、心包或冠狀動脈的藥物組合物。對于口服給藥，所述藥物組合物可以通過常規(guī)方法制備的片劑或膠囊形式而被攝入，例如利用藥物上可獲得的添加劑制備片劑或膠囊，諸如粘合劑(例如預(yù)凝膠玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可以利用本領(lǐng)域已知的方法進行包衣(見 Remington' sPharmaceutical Sciences，第 18 片反· Gennaro 等，Mack Printing Company, Easton,Pennsylvania,1990)?？诜幬锝M合物可以是以例如溶液、糖漿或懸浮液，或者是使用前與水或其他合適的溶劑混合的干燥制品的形式攝入。制備藥物組合物溶液可以使用常規(guī)方法利用藥學(xué)上可用添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑 (例如卵磷脂或阿拉伯膠)；不溶的載體(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾的植物油) ’防腐劑(例如甲基或?qū)αu基苯甲酸丙酯或已二烯酸)。必要時，藥物組合物還可以包含緩沖鹽、香料、色素和甜味劑。腸內(nèi)給藥的藥物組合物可以是適合口服的形式，例如片劑、含片或錠劑。本發(fā)明中的肽和/或蛋白質(zhì)可以制備成用于經(jīng)過直腸和陰道內(nèi)給藥途徑的溶液(直腸乳劑)、栓劑或軟膏。腸內(nèi)藥物組合物可以是適合全胃腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition, TPN)混合物的混合溶液，或者攝入混合物，諸如通過飼管(intake tube)遞送的溶液(見 Dudrick 等，1998 國際外科技術(shù)(Surg. Technol. Int). VII :174-184 ；Mohandas 等，2003，全國醫(yī)學(xué)雜志(Natl. Med. J. India) 16(1) :2933 ；Bueno 等，2003 胃腸內(nèi)鏡(Gastrointest. Endosc). 57 (4) :536_40Shike 等，1996，Gastrointest. Endosc. 44 (5) :536-40)。吸入式給藥時，本發(fā)明的肽和/或蛋白質(zhì)通常是在氣溶膠噴霧存在下或是以在容器中壓有合適拋射劑的噴霧器遞送的，所述拋射劑例如，諸如二氟二氯甲烷、氟三氯甲烷、 二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在壓力氣溶膠的情況下，其容量可能取決于閥門輸送的重量。例如，可制備膠囊和膠質(zhì)藥筒供包含合適的粉末基質(zhì)，例如乳糖或淀粉，以及這些化合物的粉末混合物的吸入器或吹入器使用。本發(fā)明的滴眼劑可以是可溶解的眼用溶液、不溶的眼用溶液或眼用乳劑。本發(fā)明的滴眼劑可以通過將本發(fā)明中的肽溶解或懸浮在可溶解的溶劑，諸如滅菌的純凈水或生理鹽水，以及不溶的溶劑，諸如包括棉籽油、豆油的植物油等中而制備得到。在這種情況下， 必要時也可向其中添加等滲劑、pH調(diào)節(jié)劑、增稠劑、懸浮劑、乳化劑、防腐劑，以及等量的藥學(xué)上可用添加劑。具體而言，等滲劑包括氯化鈉、硼酸、硝酸鈉、硝酸鉀、D-甘露醇、葡萄糖等。PH調(diào)節(jié)劑的具體實例包括硼酸、無水硫酸鈉、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鉀、碳酸鈉、硼砂等。增稠劑的具體實例包括甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、軟骨素硫酸鈉、聚乙烯基吡咯烷酮等。懸浮劑的具體實例包括聚山梨醇酯80、聚氧化乙烯氫化蓖麻油等。乳化劑的具體實例包括但不局限于蛋黃卵磷脂、聚山梨醇酯80等。防腐劑的具體實例包括但不局限于氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、氯代丁醇、苯乙醇、P-鄰羥基苯甲酸酯等。本發(fā)明的組合物可施用給需要治療血管相關(guān)疾病的受試者。藥物組合物的毒性和治療功效可根據(jù)實驗動物標準藥物操作，例如細胞培養(yǎng)或半數(shù)致死量(LD5tl)(—組中50% 致死量)測量和半數(shù)有效劑量(ED5tl)(—組中50%有效量)測量確定。施用的組合物的毒性效應(yīng)和治療效果的比率稱為治療指數(shù)，而治療指數(shù)可用LD5tZED5tl比值表示。具有高治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。在一個實施方案中，從細胞培養(yǎng)分析和動物研究得到的資料可用來確定應(yīng)用于人的劑量。依據(jù)本發(fā)明的組合物的劑量優(yōu)選在包括ED5tl值的循環(huán)密度范圍以內(nèi)此劑量的組合物無毒或幾乎無毒。劑量也會隨著所使用的成分的范圍和給藥途徑而變化。在本發(fā)明方法中使用的組合物中，有效治療劑量可以在最初通過細胞培養(yǎng)分析計算出來。為了獲得包括 IC5tl值(即試驗材料顯示一半極限抑制的量)的血漿濃度范圍，在動物模型上對劑量進行了設(shè)計，如在細胞培養(yǎng)中測定的那樣。該信息可用于更準確地確定人體用藥的有效劑量。例如可通過高效液相色譜法確定血漿中測試材料的水平。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含肽和/或蛋白質(zhì)的組合物的有效含量優(yōu)選在約 0. Iyg至約10mg/kg病人體重范圍內(nèi)給藥，更優(yōu)選在約1至約1000 μ g/kg病人體重給藥。 所述肽和/或蛋白質(zhì)的給藥量是0. 1 μ g,0. 2 μ g,0. 5 μ gU μ g>2 μ g,5 μ gUO μ g,20 μ g,30μ g、40y g、50y g、60y g、70y g、80y g、90y g、100y g、200y g、250y g、300y g、400y g、 500μ g 或 1000 μ go在另一個實施方案中已經(jīng)證實本發(fā)明組合物的有效量在靜脈注射時為Iyg至 10mg/kg體重；眼部注射時為Ing至lmg/kg體重；眼用混懸液為Ing至10mg/ml。配好劑量的本發(fā)明的組合物優(yōu)選使用皮內(nèi)或皮下給藥。可采用單次給藥或多次分開給藥例如采用日服、隔天服用、周服、隔周服用或按月服用的形式施用所述組合物。下文將對本發(fā)明進行描述。本發(fā)明中首次證實含Xaa-Gly-Asp序列的肽用于治療血管疾病，諸如用于治療局部缺血是有效的，同時也首次顯示血管疾病病變中存在血管生成素-1的分泌。已經(jīng)證實在兩個細胞系和小鼠角膜新生血管形成模型中，利用血管生成素-1的分泌可治療與異常血管生成有關(guān)的疾病，同時也證實，含有序列Xaa-Gly-Asp的多肽與干細胞一起用于氧分壓變化誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成小鼠模型時，能有效治療異常血管生成相關(guān)疾病。此外，已經(jīng)證實在創(chuàng)傷-愈合小鼠模型中，當使用該多肽治療傷口時，含有 Xaa-Gly-Asp序列的多肽能有效地治療小鼠皮膚創(chuàng)傷，這表明含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽能用于治療損傷、燒傷，預(yù)防和治療脫發(fā)或正常毛細血管形成條件下的灰發(fā)癥或與肥胖有關(guān)的心血管疾病、以及褥瘡和慢性潰瘍。最新發(fā)現(xiàn)表明當用合成并純化的含有Xaa-Gly-Asp序列的多肽以不同密度處理兩個細胞系時，多肽可以誘導(dǎo)血管生成素-1的分泌。在小鼠角膜新生血管形成模型中，也證實血管生成素-1的誘導(dǎo)分泌能夠促進正常血管的形成，并能通過穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)減少含有異常血管結(jié)構(gòu)的病態(tài)血管原管(angiogenic vessel)的血液滲漏。同時，可以觀察到正常人細胞系的血小板衍生生長因子(PDGF)的分泌被抑制在血小板中，其中血小板衍生生長因子是血管生成的重要因素之一。在使用氧分壓變化的視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成誘導(dǎo)小鼠模型中，同時給藥含有干細胞的單核細胞(MNCs)和含有fea-Gly-Asp序列的多肽時，證實在異常血管生成中發(fā)現(xiàn)的血液滲漏和血管結(jié)構(gòu)變化被抑制，正常血管形成，且血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 所以，本發(fā)明的組合物優(yōu)選用于治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性等。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病是在正常發(fā)育抑制中發(fā)展的眼部疾病之一，而糖尿病性視網(wǎng)膜病和老年性黃斑變性是由正常血管結(jié)構(gòu)損傷而造成的異常血管生成相關(guān)疾病之一。


本發(fā)明最優(yōu)方案的這些及其他特征、方面和優(yōu)點將在下文對照附圖得到詳細說明。在附圖中圖1是顯示在利用血管生成因子誘導(dǎo)小鼠角膜血管生成的動物模型中，形成小鼠角膜袋和將VEGF團粒(pellet)注入小鼠角膜袋的操作的圖像；圖2是顯微鏡圖像，其顯示在利用VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜血管生成的動物模型中，當將含有RGD序列的多肽腹膜內(nèi)給藥至該動物模型中時，含有RGD序列的多肽誘導(dǎo)正常血管生成并抑制異常血管生成；圖3是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜血管生成的動物模型中，當將含有RGD序列的多肽腹膜內(nèi)給藥至該動物模型中時，含有RGD序列的多肽誘導(dǎo)正常血管生成并抑制變異血管生成；
圖4顯示的是在利用VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜血管生成的動物模型中，將含有RGD序列的多肽腹膜內(nèi)給藥時，通過該多肽數(shù)字化(digitalize)的血管生成的產(chǎn)生水平圖表；圖5顯示在利用高壓氧處理(75% )后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當小鼠視網(wǎng)膜暴露于高氧分壓時，不表現(xiàn)正常血管生成的小鼠的視網(wǎng)膜(圖5-A)與在標準氧分壓下正常生長小鼠的視網(wǎng)膜(圖5-B)對比圖像；圖6是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75%)后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當將多肽腹膜內(nèi)給藥時，含有RAD序列的多肽(SEQ ID NO 3)不誘導(dǎo)正常血管生成(圖6A)；但含有RGD序列的多肽 (SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2)誘導(dǎo)正常血管生成，并減少血液滲漏(圖6的B和C)；圖7是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75%)后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當腹膜內(nèi)給藥含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7)時，誘導(dǎo)了正常血管生成，并減少了血液滲漏(圖7 的A和B)；圖8是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75%)后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當腹膜內(nèi)給藥含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 8)時，誘導(dǎo)了正常血管生成，并減少了血液滲漏；圖9是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75%)后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當腹膜內(nèi)給藥鋸鱗肽 (echistatin)和蝮蛇毒素時，誘導(dǎo)了正常血管生成，并減少了血液滲漏；圖10是H&E染色組織圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75% )后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管生成的動物模型中，當膜內(nèi)給藥含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8)時，同陰性對照相比(圖10B)，內(nèi)部的神經(jīng)節(jié)細胞層保持正常厚度而無任何肥大(圖IOC和D)，其水平與正常小鼠厚度類似(圖10A)；圖11是顯微鏡圖像，其顯示了從小鼠骨髓分離并隨后分別用熒光煙酸己可堿 (Hoechst)-33342(圖11A)、異硫氰酸熒光素(FITC)(圖11B)染色的全部單核細胞(MNC)；圖12是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75% )后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜生成的動物模型中，當將含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 5)和單核細胞單獨(分別為圖12的A和B)或聯(lián)合(圖12的C)腹膜內(nèi)給藥時，出生后20天可分離并觀察到小鼠視網(wǎng)膜，其中單獨給藥單核細胞比它與含有R⑶序列的多肽聯(lián)合給藥時，正常血管生成更容易被誘導(dǎo)同時血液滲漏更少；圖13是使用熒光FITC-葡聚糖的圖像，其顯示在利用高壓氧處理(75% )后將高氧壓降到標準氧分壓來誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜生成的動物模型中，當將含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 5)和單核細胞單獨(分別為圖13的A和B)或聯(lián)合(圖13的C)腹膜內(nèi)給藥時，出生后27天可分離并觀察到小鼠視網(wǎng)膜，其中單獨給藥單核細胞比它與含有RGD序列的多肽聯(lián)合給藥時，正常血管生成更容易被誘導(dǎo)同時血液滲漏更少；圖14是顯示在小鼠創(chuàng)傷-愈合模型中，利用含有RGD序列的多肽治療損傷時，可使小鼠皮膚損傷比對照顯著減輕的圖像；圖15是顯示在小鼠創(chuàng)傷-愈合模型中，利用含有RGD序列的多肽治療損傷時，可使小鼠皮膚損傷比對照顯著減輕的概要圖表；
圖16是H&E染色組織圖像，其顯示在小鼠創(chuàng)傷-愈合模型中，當利用含有RGD序列的多肽治療損傷時，與對照相比，在損傷皮膚組織下形成的精細毛細血管長成如正常小
鼠一樣血管厚；圖17是顯示使用含有R⑶序列的多肽處理的肉瘤細胞系中的血管生成素-1得到分泌的圖像；圖18是顯示使用含有RGD序列的多肽處理的小鼠血漿中的血管生成素_1得到分泌的圖像；圖19是顯示使用含有K⑶序列的多肽處理的肉瘤細胞系中的血管生成素-1得到分泌的圖像；圖20是顯示含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 5)抑制血小板中血小板衍生生長因子(PDGF)產(chǎn)生的圖表。實施本發(fā)明的最佳方式在下文中，將參照附圖詳細說明本發(fā)明中非限定性的優(yōu)選實施方案。實施例1 含有RGD序列的多肽在無血管眼角膜組織中對VEGF誘導(dǎo)的血管生成量的治療效果為了評價含有RGD序列的多肽如何影響眼睛血管發(fā)生，開發(fā)了在小鼠眼角膜中生成微袋(micropocket)的動物模型，然后注入含有300ngVEGF的團粒(pellet)以誘導(dǎo)血管生成(圖1)。此時，為了測定多肽的功效，可以分別腹膜內(nèi)給藥1. 3pmol(0. 75ng/kg)和 130pmol(75ng/kg)的多肽。腹膜內(nèi)給藥5天后，利用外科顯微鏡觀察小鼠眼睛血管生成是否被誘導(dǎo)。結(jié)果顯示在注入無VEGF的團粒時觀察不到血管(圖2和圖3的A)，而在注入 VEGF團粒的陽性對照中觀察到了血管生成(圖2和圖3的B)。然而，已經(jīng)證實，含RGD序列的多肽誘導(dǎo)血管的增殖，而不是抑制它們的生長，因為當分別將1. 3pmol (圖2和圖3的 C)和130pmol (圖2和圖3的D)含RGD序列的多肽腹膜內(nèi)給藥時，觀察到微血管形成和血管網(wǎng)絡(luò)(vascular networks) 0當測量血管長度以量化血管生成時，陽性對照的血管總長度為0. 43 士 0. 02mm ；分別用1. 3pmol和130pmol環(huán)RGD (eye RGD)處理組的總長分別為 0.65士0.01mm和0. 69士0. 03mm，這表明其血管生成顯著增加(圖4)。同時，在所有用于此實驗的小鼠中都沒有觀察到副作用，例如含RGD序列的多肽引起的角膜混濁。實施例2 含RGD序列的多肽(SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型中的效果氧分壓差異誘導(dǎo)的人工眼血管生成顯示出與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病及糖尿病性視網(wǎng)膜病相同的特征。實施該實驗使用的原理即出生早期階段暴露在高氧環(huán)境(75%)中的小鼠回復(fù)到正常氧分壓環(huán)境中時可自發(fā)地誘導(dǎo)異常血管生成(Higgins RD.等，現(xiàn)有眼研究(Curr.Eye Res) · 18 :20-27 (1999) ； Bhart N.等，兒科研究(Pediatric Res). 46 184188(1999) ；Gebarowska D.等，美國病理雜志(Am. J. Pathol.) 160 :307313 (2002))。出于此目的，在一個可調(diào)整氧分壓的儀器中，將一只出生7天的小鼠留在氧分壓恒為75%的高氧環(huán)境5天后，再將其留在氧分壓為20%的標準氧分壓環(huán)境中。這時，每5天腹膜內(nèi)給藥含R⑶的肽(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2)，觀察小鼠眼內(nèi)的血管生成是否被誘導(dǎo)。為了觀察血管，將50毫克分子量為2X106的FITC-葡聚糖溶于Iml生理鹽水中，然后將得到的溶液經(jīng)左心室注入。注射后，立即取出小鼠眼球。用生理鹽水清洗取出的眼球后，接著用濃度為 4%的多聚甲醛固定4-M小時，然后從眼球上取出晶狀體。最后，將得到的小鼠視網(wǎng)膜平坦地鋪展在載玻片上并用甘油-明膠密封載玻片，接下來使用熒光顯微鏡進行觀察。觀察到在正常氧分壓下生長的小鼠的血管均勻分布在整個視網(wǎng)膜上(圖5的B)， 而經(jīng)高壓氧和然后鹽水處理的小鼠中大多數(shù)血管生成是異常的，并且產(chǎn)生了局部缺血(圖 5的A)。此外，還觀察到與正常小鼠相比，利用高壓氧處理的小鼠視網(wǎng)膜在發(fā)育階段不能形成正常的血管組織；而且在作為對照的使用含RAD序列的多肽處理的小鼠中，視網(wǎng)膜血管也不能正常形成(圖6的A)。然而，顯示出每日用lyg/kg的含有R⑶序列的多肽處理的小鼠中未觀察到異常血管生成(圖6的B和C)，并且能觀察到正常血管而無任何異常血管生成。含有R⑶序列的多肽起著幫助正常血管生長的作用，這是一個非常有意思的結(jié)果， 這表明此多肽可能可用于治療如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病之類的眼部疾病，因為在利用氧分壓變化誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管生成的小鼠模型中，含RGD序列的多肽能夠通過減少缺氧區(qū)而抑制病態(tài)的血管生成(morbid angiogenesis)，從而排除了血管生成的潛在病因。同樣，從利用熒光 FITC-葡聚糖的滲漏試驗可以觀察到血液沒有發(fā)生滲漏，因為使用含RGD序列的多肽治療后血管結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定。例如FITC照片中熒光滲漏和播散的區(qū)域代表血液通過血管小孔出現(xiàn)滲漏的區(qū)域。因此，可以理解，本發(fā)明的肽減少了熒光擴散的事實意味著血管損傷的防止與熒光擴散的減少一樣多。由于視網(wǎng)膜血管中存在與腦血管的血腦屏障(BBBs)相同的血液視網(wǎng)膜屏障 (BRBs)，因此大分子不容易通過視網(wǎng)膜血管。實驗證明以下事實，諸如FITC-葡聚糖的分子量較大的分子滲入視網(wǎng)膜意味著視網(wǎng)膜血管的微觀結(jié)構(gòu)受到極大的損害，而含有RGD序列的多肽引起血管生成素的分泌則能防止視網(wǎng)膜血管的損害。因此，含有R⑶序列的多肽可被用作為治療如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性的疾病的治療劑，因為即使是由于血管中血液滲漏發(fā)展的疾病，所述多肽也能夠在疾病早期維持血管結(jié)構(gòu)(在疾病早期，血管生成不被誘導(dǎo))。實施例3 含RGD序列的多肽(SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型中的效果在實施例3中，采用實施例2中描述的氧分壓誘導(dǎo)的人工視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型證實了含RGD序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7)的效果。已經(jīng)證實，如實施例 6(圖5的B)中描述的一樣，在標準氧分壓環(huán)境中生長的小鼠中血管均勻地分布在整個視網(wǎng)膜上，而經(jīng)高壓氧及然后鹽水處理后的小鼠中絕大多數(shù)血管生成發(fā)生異常并且形成局部缺血(圖5的A)。顯示出每日用lyg/kg含有R⑶序列的多肽處理的小鼠中，未觀察到異常血管生成(圖7的A和B)，并且能觀察到正常血管而無任何異常血管生成。正如實施例2 描述的一樣，這意味著含RGD序列的多肽具有幫助正常血管生長的功能。因此，含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 7)可被用作為治療如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性的疾病的治療劑，因為即使是由于血管中血液滲漏發(fā)展的疾病，所述多肽也能夠在疾病早期維持血管結(jié)構(gòu)(在疾病早期，血管生成不被誘導(dǎo))。實施例4 含RGD序列的多肽(SEQ ID NO :8)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型中的效果在實施例4中，采用實施例2中描述的氧分壓誘導(dǎo)的人工視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型證實了含R⑶序列的多肽(SEQ ID NO 8)的效果。顯示出每日用1 μ g/kg含有R⑶序列的多肽處理的小鼠中，未觀察到異常血管生成，并且能觀察到正常血管而無任何異常血管 (圖8)。正如實施例2描述的一樣，這意味著含RGD序列的多肽具有幫助正常血管生長的功能。因此，含有RGD序列的多肽可被用作為治療如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性的疾病的治療劑，因為即使是由于血管中血液滲漏發(fā)展的疾病，所述多肽也能夠在疾病早期維持血管結(jié)構(gòu)(在疾病早期，血管生成不被誘導(dǎo))。實施例5 鋸鱗肽(SEQ ID NO 9)和蝮蛇毒素(SEQ ID NO 10)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型中的效果在實施例5中，采用實施例2描述的氧分壓誘導(dǎo)的人工視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型證實了含RGD序列的多肽鋸鱗肽和蝮蛇毒素的效果。已經(jīng)證實，正如實施例2所述(圖5的 B)，在標準氧分壓下生長的小鼠中血管均勻分布在整個視網(wǎng)膜上，而經(jīng)高壓氧后又經(jīng)鹽水處理的小鼠的大多數(shù)血管生成發(fā)生異常并產(chǎn)生局部缺血(圖5的A)。顯示出每日用Iyg/ kg鋸鱗肽和蝮蛇毒素處理的小鼠中，未觀察到異常血管生成，并且能觀察到正常血管而無任何異常血管(圖9)。正如實例2描述的一樣，這意味著含RGD序列的多肽具有幫助正常血管生長的功能。實施例6 含RGD序列的多肽(SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型的組織學(xué)照片中的效果在實施例6中，采用實施例2中描述的氧分壓誘導(dǎo)的人工視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型通過利用組織染色證實了含R⑶序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 8)的效果。如實施例2所述，在一個可調(diào)整氧分壓的儀器中，將一只出生7天的小鼠C57BL/6留在氧分壓恒為75%的高氧環(huán)境5天后，再將其留在氧分壓為20%的正常氧分壓環(huán)境中5天。這時，每五天分別腹膜內(nèi)給藥含有R⑶序列的多肽(SEQ ID NO :6或SEQ ID NO 8) 一次，然后從所述C57BL/6小鼠的眼睛中取出視網(wǎng)膜，用石蠟固定，切成6-μπι的石蠟橫切片，用H&E染色劑對其進行組織學(xué)染色，接下來使用顯微鏡觀察染色的石蠟橫切片。結(jié)果顯示正常小鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)部神經(jīng)節(jié)細胞層維持正常細胞厚度而沒有任何肥大(圖10的Α)。而在陰性對照中，氧分壓差異導(dǎo)致視網(wǎng)膜的內(nèi)部神經(jīng)節(jié)細胞層異常肥大(圖10的B)。與陰性對照相比， 用含有R⑶序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :8)治療的小鼠的內(nèi)部神經(jīng)節(jié)細胞層的厚度維持在與正常小鼠一樣的正常水平而無任何肥大(圖10的C和D)。正如實施例3和實施例4所述，這意味著含R⑶序列的多肽具有幫助正常血管生長的功能，同時也能通過維持內(nèi)部神經(jīng)節(jié)細胞層厚度在正常水平且無任何肥大而使視網(wǎng)膜保持在正常水平。作為另外一個結(jié)果，其表明含有R⑶序列的多肽(SEQ ID NO :6和SEQ ID NO 8)可被用作為治療如糖尿病性視網(wǎng)膜病、老年性黃斑變性的疾病的治療劑，因為即使是由于血管中血液滲漏發(fā)展的疾病，所述多肽也能夠在疾病早期保持血管結(jié)構(gòu)(在疾病早期，血管生成不被誘導(dǎo))。實施例7 含RGD序列的多肽和單核細胞(MNC)在使用氧分壓誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型中的效果單核細胞群的制備為了分離單核細胞群，先從C57BL/6小鼠的兩條腿中分離股骨和脛骨，再將其放入到含50單位肝素的DMEM培養(yǎng)基中。為了從分離的股骨和脛骨中獲得骨髓細胞，將分離骨的頭部和骺Epiphyses)切下以暴露髓腔，使用針22G向暴露的髓腔中注入IOml的DMEM培養(yǎng)基以分離骨髓細胞。為使脂肪和肌肉組織從分離到的骨髓細胞中分離，使用70μπι尼龍網(wǎng)眼細胞過濾器過濾骨髓細胞懸液。向骨髓細胞混懸液中加入其體積1. 5倍的菲科帕克 (Fic0Il-Paque)Plus (密度為1. 077mg/ml)，并在室溫條件下以3，OOOrpm的速度離心處理 20分鐘，進而分離處于Ficoll-Paque和培養(yǎng)基分界面的單核細胞群。將分離的單核細胞群用DMEM培養(yǎng)基洗滌兩次，然后使之懸浮在Iml含2%胎牛血清和ImM HEPES的DMEM培養(yǎng)基中。分離的單核細胞群具有1. 1-3. 2X106細胞/小鼠的密度，使用Hoechst 33342對單核細胞進行染色，然后進行觀察(圖11的A)。誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管牛成的試騎在實施例7中，采用了實施例2中描述的氧分壓誘導(dǎo)的人工視網(wǎng)膜血管生成小鼠模型，在下表1中列出的條件下，在出生20天(PN20)和27天(PN27)的小鼠中證實了單核細胞群和/或含有RGD序列的多肽(SEQ ID NO 5)的效果。ffl刊秀測_草血餅成JH式亥麵_胞麗
權(quán)利要求
1.一種用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含具有Xaa-Gly-Asp序列的肽作為有效成分，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸或賴氨酸，所述血管相關(guān)疾病是選自由以下疾病所組成的組中的一種或多種疾病(i)血管壁血液滲漏，(ii)血管損傷，(iii)由于血管壁血液滲漏或血管損傷引起的局部缺血性血管相關(guān)疾病，(iv)由于血管壁血液滲漏或血管損傷引起的水腫，其中，所述由于血管壁血液滲漏或血管損傷引起的局部缺血性血管相關(guān)疾病是選自由以下疾病所組成的組中的一種或多種疾病與糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)的血管壁血液滲漏或血管損傷、與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病有關(guān)的血管壁血液滲漏或血管損傷、與老年性黃斑變性有關(guān)的血管壁血液滲漏或血管損傷、與青光眼有關(guān)的血管壁血液滲漏或血管損傷、糖尿病足潰瘍、損傷、灼傷、褥瘡、慢性潰瘍、脫發(fā)或正常毛細血管形成下的灰發(fā)癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述肽的劑量范圍是0. 1 μ g 10mg/kg的總組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述肽由3 73個氨基酸組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其中，所述肽包括選自由SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 10所列出的肽序列所組成的組中的一個肽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，所述組合物還進一步包含干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療血管相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含具有Xaa-Gly-Asp序列的肽作為有效成分，其中，所述肽的氨基酸Xaa是精氨酸或賴氨酸，所述血管相關(guān)疾病是選自由以下疾病所組成的組中的一種或多種疾病(i)血管壁血液滲漏，(ii)血管損傷，(iii)由于血管壁血液滲漏或血管損傷引起的局部缺血性血管相關(guān)疾病，(iv)由于血管壁血液滲漏或血管損傷引起的水腫。
文檔編號A61K38/18GK102294016SQ20111023566
公開日2011年12月28日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日
發(fā)明者俞元一, 張鎮(zhèn)旭, 權(quán)五雄, 權(quán)垂美, 林亨駿, 趙良濟, 金斗植 申請人:愛吉恩公司