專利名稱：血小板生成素及其生產工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物制藥領域血小板生成素(Thrombopoietin TPO)是腎細胞產生的一種糖蛋白生長因子，已知是由332氨基酸組成，分子內部有多個糖基化位點，但由于糖基化位點不十分清楚，所以報導的分子量多在30000-50000道爾頓范圍內，等電點為4.4左右。
血小板生成素最初發(fā)現是在患嚴重血小板減少的動物和人的血漿、血清和尿液中存在的一種體液因子。由于血小板生成素對一些不治之癥(如血小板減少癥、再障等)具有肯定的療效，前景非常看好，所以血小板生成素已成為許多國際開發(fā)研制的熱點。目前其它國家多從患有血小板減少癥病人的尿中提??；有的是從血漿及血清中提取純化；有的是從人腎細胞培養(yǎng)提取純化；有的是采用DNA重組技術人工合成。
上述開發(fā)研制血小板生成素的過程中主要存在以下問題為之不足。1.收集患有血小板減少癥病人的尿太困難，由于患病人數太少，因此尿(原料)的缺乏，不能形成工業(yè)化生產，不具有實用性。2.從血漿、血清中分離血小板生成素，因其含量極微，故而收率太低，成本高。又因原料中雜蛋白干擾太大，致使純化度這不到質量要求及使用要求。3.從人腎細胞培養(yǎng)、提取、純化工藝更復雜，成本昂貴。4.應用DNA重組技術人工合成，工藝復雜，成本昂貴。
鑒于上述存在的問題，本發(fā)明的目的就是解決原料來源困難，提取純化工藝復雜，生產成本昂貴等之不足及尋找一種純天然制品。

發(fā)明內容
附生產工藝流程圖收集男性新鮮尿，檢測PH為6-7之間，經檢查無細菌污染后，經微孔濾膜、砂芯及石棉濾器過濾均可，以微孔膜為佳，以除去雜質，濾液按尿液體積1∶1加蒸餾水稀釋或不稀釋后通過離子交換纖維素(DeAe，DeAe-Sephadex，Amberlite 1R-4B)柱層析，柱層析預先用含0.1克分子濃度氯化鈉的0.01克分子濃度PH6.5-6.8的磷酸緩沖液(PBS)平衡后即可上樣。上完樣以0.1克分子濃度氯化鈉磷酸緩沖液洗滌至流出液中無蛋白為止，此液為峰1棄之不用，再用含0.15克分子濃度氯化鈉的磷酸緩沖液沖洗至流出液中無蛋白為止，此液為峰2仍棄之不用，最后用0.35克分子濃度濾氯化鈉的磷酸緩沖液洗脫，此液為峰3，收集峰3液，加入飽和硫酸銨至50-80％飽和度置冷過液，在4-10℃低溫離心，收集沉淀物，將其溶于少量蒸餾水中用透析袋對水透析至無硫酸根(SO4)為止，然后取透析液生物膠通過(Bio-gel P-30)或交聯葡聚糖凝膠(Sephadex G25-100、Sephacry S-100-4000)均可做為分離介質的凝膠過濾柱進行分離，凝膠過濾柱先用0.01克分子濃度PH7.0磷酸緩沖液平衡后上樣，洗脫液在紫外檢測儀上出現三個峰，峰I和峰II棄掉，收集峰III再經一次纖維素層析(P-纖維素，CM-纖維素)用PH6.5-7.0，0.01克分子濃度磷酸緩沖液進行洗脫，該液再經截止分子量3-5萬的超濾膜進行超濾，以除去病毒，最后以速凍干燥即得。本工藝生產的血小板生成素(TPO)具有以下理化性質及藥效一、分子量經SDS-PAGE檢查分子量主要為32000和16000道爾左右的兩種蛋白帶，等電點為4.4-4.5，比活性100000-150000單位/mg蛋白。通過HPLC凝膠柱檢查分子量為30000-50000道爾頓占總蛋白的80％以上。二、藥效學試驗1.小白鼠試驗小鼠經環(huán)磷酸胺注射后造成血小板降低約50％，注射5000單位/kg，1500單位/kg，500單位/kg三個劑量的TPO后，血小板均有十分明顯的升高，高劑量組可恢復到起始血小板數的85％，而對照組只有42％，血小板的升高與TPO劑量呈正比關系。2.大鼠分(1)組經4.0GY60鈷照射后造成血小板嚴重下降經TPO500單位/kg，1000單位/kg，2000單位/kg兩周治療后，血小板回升到照射前的65％，而對照組只回升30％。3.人體治療研究用血小板治療四例慢性再障礙性貧血，肌肉注射血小板生成素，每日一次，每次40000單位，結果血色素及血小板比治療前分別平均上升42.75克/升及50.28克/升，用藥前后對比，具有顯著性差異(P＜0.01)，治療八周后，骨髓象基本正常(粒紅比為1.24∶1，巨核細胞12只，血小板散在可見)。三、藥理及毒理學試驗1.一般藥理結果表明TPO對大鼠心血管呼吸系統(tǒng)精神系統(tǒng)均未發(fā)現有明顯影響。
2.急性毒理小鼠靜脈注射相當臨床擬用量10000倍，肌肉注射相當于臨床擬用量的15000倍，觀察14天，小鼠健存，因而測不出LD50(半數致死量)。
3.長期毒性大鼠注射給藥三個月，每日一，次劑量為5000單位/kg，1250單位/kg為臨床擬用劑量的71倍和178倍，結果表明體重、行為、心電圖、血尿常規(guī)、血液生化及重要臟器均未發(fā)現器質性變化，僅有可逆性變化。4.過敏及安全試驗TPO對豚鼠的試驗證明，無過敏反應而且安全合格。四、穩(wěn)定性保存在0-10℃18個月TPO的活性無變化。本發(fā)明與現有技術相比其優(yōu)點和積極效果1.本發(fā)明為純天然產品，具有肯定的治療效果，無毒付反應。2.原料非常充足，不用投資可得到。3.生產工藝簡單，能源消耗低，成本低。五、實施例例1，批號為941026新鮮人尿38升，檢查PH為6.5左右，過濾待用，按照尿液體積1∶1加入無熱源水，通過直徑10cm，高12cm的離子交換纖維素柱進行層析，柱子預先用含0.1克分子濃度氯化鈉的0.01克分子濃度6.8的磷酸緩沖液(PBS)平衡，樣品上完后，以平衡緩沖液洗至流出液無蛋白質為止，改用含0.15克分子濃度氯化鈉的PBS洗至流出液中無蛋白質，改用含0.35克分子濃度氯化鈉的PBS洗脫，收集洗脫峰，得1200ml，濃度為0.056mg/ml總蛋白67.2mg。加入硫酸銨至80％飽和度，0℃放置過夜，次日在4-10℃低溫離心收集沉淀，溶于少量蒸餾水中，對水透析至無SO4，得87ml。蛋白質濃度為0.48mg/ml，總蛋白為42mg。取Bio-gel P30，加水，沸水浴中溶脹3分鐘，用蒸餾水洗凈，裝柱，柱直徑2.5cm，高100cm，用0.01克分子濃度PH7.0磷酸緩沖液平衡，將透析濃縮后溶液上樣，每次70ml左右，以平衡緩沖液分離，可得三個峰，取第III峰，得64ml，蛋白濃度為0.108mg/ml，總蛋白量為6.9mg。經超濾除去病毒熱源，再經纖維素層析用PH6.5-7.0，0.01濃度克分子磷酸緩沖液沖洗進行洗脫，收集洗脫液，最后速凍干燥即得，實得蛋白質3.8mg，此為TPO。例2.批號941102.
取新鮮人尿25.6升方法同前，經過離子交換纖維素層析得到1070ml洗脫液，硫酸銨沉淀離心、透析后得到73ml，蛋白濃度為0.52mg/ml，總蛋白為38mg，經Bio-gel凝膠柱過濾，收得活性峰56ml，蛋白濃度為0.12mg/ml，總蛋白為6.72mg，經超濾除去病毒，再經纖維素層析，實得蛋白質3.1mg，比活為103,0000u/mg為TPO成品。例3.批號941110。
取新鮮人尿24.6升，方法同例1，經過離子交換纖維素層析得到1200ml洗脫液，經硫酸銨沉淀，離心透析后得到42ml，蛋白濃度為0.565mg/ml，總蛋白為31.64mg，經過Bio-gel凝膠過濾，得到活性峰74ml，蛋白濃度為0.104mg/ml，總蛋白7.696mg，經超濾除去病毒再經纖維素層析實得蛋白質3.3mg，比活為112,000u/mg，為TPO成品。
權利要求
1.一種血小板生成素及其制備工藝，其特征在于以人尿為原料，經過過濾、層析、鹽析、透析、凝膠過濾、超濾膜超濾、纖維素層析及冷凍干燥即得。
2.根據權利要求1所述的人尿為原料，其特征在于PH為6-7的無細菌污染男性新鮮尿(不超過10小時)。
3.根據權利要求1所述的過濾，其特征在于將尿液經微孔濾膜、砂芯、石棉濾器過濾均可，以微孔膜為最佳。
4.根據權利要求1所述的層析，其特征在于將過濾尿液按體積1∶1加蒸溜水稀釋后通過，離子交換纖維素柱進行層析(DEAE-Sephadex.Amberlite 1R-4B)。分別用0.1和0.15克分子濃度氯化鈉的0.01克分子濃度PH6.5-6.8磷酸緩沖液洗脫液，得峰1和2棄掉，然后用0.35克分子濃度氯化鈉的磷酸緩沖液洗脫得峰3層析液。
5.根據權利要求1所述的鹽析，其特征在于將峰3層析液加入飽和硫酸銨至飽和度為50-80％，冷放過夜，在4-10℃離心收巢沉淀物。
6.根據權利要求1所述的透析，其特征在于將沉淀物加少許蒸餾水溶解，用透析袋對水透析至無硫酸根為止。
7.根據權利要求1所述的凝膠過濾，其特征在于將透析物通過以生物膠(Bio-gel-p30)交聯葡聚糖凝膠(Sephadex G25-100，Sephaciryl S-100-400)+作為分離介質進行凝膠過濾柱分離，用0.01克分子濃度PH6-7磷酸緩沖液平衡后上樣，洗脫液在紫外檢測儀上出現三個峰，峰I和II棄掉，收集峰III。
8.根據權利要求1所述的纖維素層析，其特征在于將峰III經纖維素(P-纖維素，CM-纖維素)層析，用PH6.5-7.0，0.01克分子濃度磷酸緩沖液進行洗脫，并收集洗脫液。
9.根據權利要求1所述的超濾膜超濾，其特征將峰III用截止分子量在3-5萬的超濾膜進行超濾，然后速凍干燥即得。
全文摘要
本發(fā)明是從男性尿中經過濾、纖維素層析、鹽析、透析、凝膠過濾、纖維素層析、超濾膜超濾、速凍干燥獲得的血小板生成素(TPO)產品。經動物試驗模型及人體臨床觀察，現對血小板減少性紫癜、骨髓增生異常綜合癥、再生障礙性貧血及放療、化療、骨髓移植及藥物引起的血小板減少癥均獲得滿意的療效，且未發(fā)現明顯毒副作用。產品的原料充足，生產工藝簡單，成本低，為其最大特點。
文檔編號A61K35/22GK1146995SQ9511655
公開日1997年4月9日 申請日期1995年10月5日 優(yōu)先權日1995年10月5日
發(fā)明者張鶴云, 張?zhí)? 李敏意, 王石泉, 金以豐, 湯國枝, 祖林 申請人:南京康星生物醫(yī)學發(fā)展公司