專利名稱：一種姬松茸多糖提取物在制備降血脂藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種姬松茸提取物在制備降血脂藥物中的用途，更具體地本發(fā)明涉及一種姬松茸多糖提取物在制備降血脂藥物中的用途。
背景技術(shù)：
姬松鸞又名小松燕、巴西蘑燕、柏拉氏蘑燕，“Agaricus Blazei Murill”、“Agaricus”、“ABM”*“Himematsutake”,屬擔子菌亞門層菌綱傘菌目蘑燕(黑傘)科蘑燕(黑傘)屬。該菌原產(chǎn)于巴西，1965年日本引入，成功進行了人工栽培，并于1975年開始商業(yè)化生產(chǎn)。1992年我國由福建省農(nóng)科院首次從日本引進姬松茸并栽培成功，目前在福建、江西等省份有大面積的種植。姬松茸含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價 值，在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健食品行業(yè)中具有很高的開發(fā)應(yīng)用前景。姬松茸具有濃郁的杏仁香味，美味可口，含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖，營養(yǎng)價值很高。姬松茸菌蓋嫩,菌柄脆，口感極好,味純鮮香,食用價值頗高。新鮮子實體含水分85% 87% ;可食部分每IOOg干品中含粗蛋白40 45g、可溶性糖類38 45g、粗纖維6 8g、月旨肪3 4g、灰分5 7g ;已測定的17種氨基酸總量為干重的19. 22%，其中50. 18%為人體必需氨基酸，高于其它食用菌，還含有多種維生素和麥角留醇。姬松茸營養(yǎng)極其豐富，而且組配合乎人體健康要求，尤其引人注目的是醫(yī)藥保健價值。姬松茸富含多種活性成分，可作為免疫調(diào)節(jié)劑、抗癌劑、抗突變劑和抗菌物質(zhì)的來源，因而引起全世界的極大關(guān)注，具有廣泛的應(yīng)用價值和前景。多糖類物質(zhì)是姬松茸眾多藥理作用組分中的重要一種，作為姬松茸提高免疫力、抗腫瘤活性的成分，與姬松茸的藥用功能密切相關(guān)。在實際應(yīng)用中，由于姬松茸經(jīng)過水煮提取的粗多糖中含有游離的雜蛋白質(zhì)、色素以及其他一些低分子物質(zhì)(包括寡糖、一些單糖、鹽分等)，其中蛋白質(zhì)含量較高，在藥品開發(fā)過程中必須將其有效去除方能保證藥品的穩(wěn)定性并防止出現(xiàn)不良反應(yīng)。因此在姬松茸相關(guān)藥品開發(fā)的實際過程中粗多糖的分離純化是一個必不可少的步驟。隨著姬松茸多糖功能的深入探索，越來越多人對多糖的提取方法進行了研究。目前對多糖的提取方法主要有熱水浸提法、溶劑提取法、酶提取法等?，F(xiàn)有技術(shù)中提取得到的姬松茸多糖主要有兩個類型，即分子量為50000的多糖和分子量為2000000的多糖。申請人在研究中發(fā)現(xiàn)，上述兩種多糖并不是姬松茸中活性最強的多糖。目前，對姬松茸多糖的藥理研究主要集中于抗腫瘤活性、增強機體免疫力、影響造血功能、保護肝臟的作用及其它的一些功能，如提供機體消化能力等等。需要注意的是，雖然有部分現(xiàn)有技術(shù)指出姬松茸整體具有降血脂作用，但在現(xiàn)有技術(shù)中沒有姬松茸多糖具有降血脂作用的記載，在現(xiàn)有技術(shù)“姬松茸多糖降血糖、降血脂作用的研究”(段縣平，等.姬松茸多糖降血糖、降血脂作用的研究[J].四川畜牧獸醫(yī)，2005，6:34 35)中明確指出，姬松茸多糖沒有降血脂作用，“模型組的甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)含量顯著高于對照組(P〈0. 05)，說明高血脂模型造模成功。各多糖組小鼠的TG、TC含量與模型組相比，差異不顯著，表明姬松茸多糖未顯示出降血脂的作用。有學者認為姬松茸子實體中含有的食物纖維以及以亞油酸為主體的不飽和脂肪酸都具有降低膽固醇、改善動脈硬化的作用。再結(jié)合本試驗結(jié)果，推測姬松茸降血脂作用與其所含的多糖類無關(guān)”。申請人:經(jīng)過大量的研究，發(fā)現(xiàn)了姬松茸中特定分子量范圍的多糖部分，其具有獨特的藥理活性，藥理活性明顯強于其他活性部位。尤其是，其具有非常顯著的降血脂作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種姬松茸多糖在制備降血脂藥物中的用途。本發(fā)明所述的姬松茸多糖提·取物是姬松茸水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。進一步的，本發(fā)明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在70萬 110萬之間的多種多糖復合物。更進一步的，本發(fā)明涉及的姬松茸多糖提取物是分子量在90萬的多糖。更進一步的，本發(fā)明涉及的姬松茸多糖提取物是主要以(1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分(1-6)苷鍵的多糖。更進一步的，所述部分β- (1-6)苷鍵是分布在主鏈上，支鏈上無β- (1-6)苷鍵的分布。進一步的，本發(fā)明所述的姬松茸多糖提取物的制備方法是，取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎，用濃度為95 %乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加水溫浸，期間超聲波輔助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白，然后用sephadex凝膠柱層析分離，收集平均分子量在50萬和150萬之間的組分。更進一步的，所述姬松茸多糖提取物的制備方法是，取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至60 120目，用2 7倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加3 6倍量水溫浸3次，期間每次超聲波30min輔助提取，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%,沉淀20小時,沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白，然后用sephadex凝膠柱層析分離，收集平均分子量在50萬和150萬之間的組分。更進一步的，所述姬松茸多糖提取物的制備方法是，取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至100目，用5倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加4倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5. 0，40°C下酶解60min，升溫至80°C滅活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用sephadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在50萬和150萬之間的組分。更進一步的，本發(fā)明涉及一種姬松茸多糖提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。更進一步的，本發(fā)明涉及一種姬松茸多糖提取物在制備增強免疫藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。
更進一步的，本發(fā)明涉及一種姬松茸多糖提取物在制備降血糖藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。本發(fā)明中，采用苯酚一硫酸法測定多糖含量，具體測量方法可參考“曲秀梅，樊英麗.姬松茸多糖的含量測定[J].局解手術(shù)學雜志，2004，13 (2) :141”，在此引入作為參考，經(jīng)測量，本發(fā)明的姬松茸多糖提取物含量達到95% 100%。本發(fā)明中,姬松鸞多糖經(jīng)sepharose CL-6B測定分子量分布和純度,使用葡聚糖制備標準曲線。取5mg溶于Iml蒸懼水中，充分混勻，離心除去雜質(zhì),上sepharose CL-6B凝膠柱層析(I. 5X90cm),O. 9% NaCl溶液洗脫，用苯 )—硫酸法測定糖分布，結(jié)果再次顯示，提取物的分子量分布于50萬 150萬之間，或70萬 110萬之間，或90萬。本發(fā)明中采用如下方法分析多糖中的單糖組成，樣品IOmg經(jīng)2mol/L三氟乙酸120°C封管水解3h，蒸干去除三氟乙酸，加Img肌醇和O. ImoI/L的Na2CO3 lml，30°C保溫50min,加KBH4 50mg,室溫放置I. 5h，用25%乙酸中和KBH4,并用陽離子交換樹脂除鹽，加甲醇干燥，重復3次，將干燥物85°C真空加熱2h，加Iml正丙胺和Iml無水吡啶，55°C保溫30min, N2吹干，加O. 5ml無水吡啶和O. 5ml乙酸酐，90°C保溫lh, N2吹干，加Iml無水二氯甲烷，離心，取上清用氣相色譜測定。氣相色譜法(GC):儀器Vavian 3400氣相色譜儀附FID 檢測器，HP3365 化學工作站；色譜柱SE_30 50mmX0. 20mmX0. 25 μ m ;氣化280°C ;檢測280°C ;柱溫從 130。。(2min)，升溫 10°C /min，至 250°C (20min);載氣高純氮氣。結(jié)果顯示，單糖主要為葡萄糖、半乳糖和甘露糖。本發(fā)明中測定多糖的結(jié)構(gòu)采用如下方法，C13NMR ;儀器IN0VA-500 ;工作頻率125MHz ;測試溫度20°C ;累積時間16h ;溶劑重水。以及紅外光譜分析，樣品經(jīng)溴化鉀壓片，4000 400 cm -I區(qū)間掃描紅外吸收，用Nicolet360型傅立葉變換紅外光譜儀記錄紅外光譜。結(jié)果顯示,本發(fā)明的姬松茸多糖提取物主鏈中主要為(1-3)-D葡聚糖為主鏈，并 有部分(1-6)苷鍵。并且進一步的，部分β- (1-6)苷鍵是分布在主鏈上，支鏈上無β- (1-6)苷鍵的分布。本發(fā)明經(jīng)過實驗證實，上述姬松茸多糖具有顯著的抗腫瘤、增強免疫力作用，其較現(xiàn)有技術(shù)中提取的其他多糖作用有顯著增強。更加值得關(guān)注的是，本發(fā)明的多糖具有非常顯著的降血脂作用，而現(xiàn)有技術(shù)中的多糖沒有降血脂作用。進一步的，本發(fā)明的提取物還可以作為活性成分與藥學上可接受的載體制備成具有治療腫瘤、糖尿病、高血脂的藥物。該藥物可以是各種劑型如片劑、顆粒劑、口服液、膠囊齊U、丸劑、注射液等。實施例I
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至100目，用5倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加4倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，40°C下酶解60min，升溫至80°C滅活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在50萬和150萬之間的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為100%;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。實施例2
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至100目，用5倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加4倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，40°C下酶解60min，升溫至80°C滅活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Se vag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在70萬和110萬之間的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為100%;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。實施例3
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至100目，用5倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加4倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，40°C下酶解60min，升溫至80°C滅活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在90萬的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為100% ;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。實施例4
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至60目，用7倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加3倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為80%，沉淀15小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，40°C下酶解60min,升溫至80°C滅活酶活性,然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在50萬和150萬之間的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為99% ;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。實施例5
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至120目，用2倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加6倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取2次，水提液合并后，加乙醇至濃度為60%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5. 0，40°C下酶解60min，升溫至80°C滅活酶活性，然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在50萬和150萬之間的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為959%;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。實施例6
取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎至70目，用5倍量濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加5倍量水60°C溫浸，期間每次超聲波30min輔助提取，重復提取3次，水提液合并后，加乙醇至濃度為75%，沉淀20小時，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白(5%姬松茸粗提物溶液，按多糖濃度的2%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為5.0，40°C下酶解60min,升溫至80°C滅活酶活性,然后以Sevag法除去蛋白，再加中性蛋白酶水解、Sevag除去蛋白，重復2次)，然后用s印hadex G200凝膠柱層析分離，以O(shè). 5mol/L的NaCl溶液洗脫，收集平均分子量在50萬和150萬之間的部分，濃縮、干燥，即得姬松茸多糖提取物。經(jīng)測定，其多糖含量為99% ;主鏈中主要為β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵。效果試驗例I本發(fā)明提取物對小鼠NK細胞殺傷活性的影響。 將細胞濃度為I X IO7 · mr'SlSO瘤株，給6周齡BALB/c雄性小鼠每只右后側(cè)腋窩皮下接種O. 2ml (2X IO6Cell)復制動物模型，從模型復制后第2天起，實施例I低劑量組按50mg · kg-1 · d-1、中劑量組按100 mg · kg-1 · d_l和高劑量組按200mg · kg-1 · d_l腹腔注射給藥，模型對照組和空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。另外，按實施例I的制備方法，分別制備包含從O 220萬分子量的全多糖、分子量5 30萬的低分子量多糖和分子量從180 220萬的高分子量多糖,分別按100 mg · kg-1 · d-1給藥。給藥共7天。給藥結(jié)束后24h，脫頸椎處死小鼠。75%酒精浸泡消毒后，在無菌條件下取出脾臟并制成單個脾細胞懸液，O. 83% Tris-MMCl破壞紅細胞，洗滌脾細胞后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)脾細胞濃度為1X106 ·ι 1-1。將lX106cell · ml_l脾細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，將Yac-1細胞(調(diào)細胞濃度為1X105 ·πι1-1)取50μ I分別加于測試孔內(nèi)，使效靶比為10 1，加1640培養(yǎng)液100 μ I。另外3孔為效應(yīng)細胞對照孔，每孔加入脾細胞為50 μ 1，1640培養(yǎng)液150 μ I。同時另設(shè)3孔為靶細胞對照孔，濃度為I X 105 il-lYac-l細胞懸液50 μ I/孔，完全1 ^1-1640培養(yǎng)液15(^1/孔?；靹?，在5% C02、37°C條件下培養(yǎng)20h后，每孔加入濃度為5mg · ml-ΙΜΤΤ 10 μ 1，在5%、37°C中繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心，棄上清，每孔加入二甲亞砜ΙΟΟμΙ，微型振蕩器震蕩數(shù)分鐘，使顆粒完全溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處檢測各孔吸光度。自然殺傷率％=[1_(實驗孔OD57tl-效應(yīng)細胞孔OD57tl)/靶細胞OD57J X 100%，NK細胞活性實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Tamhane檢驗結(jié)果見表I。表I對NK細胞活性的影響(X土 s)
權(quán)利要求
1.一種姬松茸多糖提取物在制備降血脂藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。
2.如權(quán)利要求I所述的姬松茸多糖提取物在制備降血脂藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是采用如下方法制備得到的取姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體粉碎，用濃度為95%乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加水溫浸，期間超聲波輔助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白，然后用sephadex凝膠柱層析分離，收集需要分子量范圍內(nèi)的組分，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是分子量在70萬 110萬之間的多種多糖復合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是分子量在90萬的多糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是主要以β- (1-3)-D葡聚糖為主鏈，并有部分β- (1-6)苷鍵的多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是所述部分β- (1-6)苷鍵是分布在主鏈上，支鏈上無β- (1-6)苷鍵的分布。
7.—種姬松茸多糖提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。
8.—種姬松茸多糖提取物在制備增強免疫藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。
9.一種姬松茸多糖提取物在制備降血糖藥物中的用途，其特征在于所述姬松茸多糖提取物是水溶性多糖，是從姬松茸子實體或人工培養(yǎng)的菌絲體中提取得到，分子量在50萬 150萬之間的多種多糖復合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從姬松茸中提取得到的多糖提取物的制藥用途，其分子量在50萬至150萬之間，制備方法為，用濃度為95％乙醇提取后，棄去提取液，殘渣加水溫浸，期間超聲波輔助提取，水提液醇沉，沉淀用sevag法加胰蛋白酶法脫蛋白，然后用sephadex凝膠柱層析分離，其具有顯著的藥理活性，具有顯著的降血脂作用，以及抗腫瘤、增強免疫力和降血糖作用。
文檔編號A61P3/06GK102920730SQ20121044642
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者于驚濤 申請人:中海科創(chuàng)(北京)生物醫(yī)藥科技有限公司