專利名稱：動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物用免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，尤其是動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物病毒性疾病一直是困擾養(yǎng)殖業(yè)的一大難題，每年由于動(dòng)物病毒性疾病造成的損失觸目驚心。目前獸醫(yī)臨床上除了用抗病毒的藥之外，多采用病毒特異性高免血清治療動(dòng)物病毒性疾病。目前，病毒特異性高免血清的生產(chǎn)方法是按以下步驟進(jìn)行1.量取一定量的動(dòng)物血清，在緩慢攪拌的情況下，徐徐加入等體積的80％過(guò)飽和硫酸銨，每加一滴在混勻后再加第二滴，攪拌均勻后放到4℃靜置1-2小時(shí)，取出后以3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15～20分鐘，棄上清，用與最初血清等體積的生理鹽水溶解沉淀；2.在緩慢攪拌的情況下，緩慢加入等體積的80％過(guò)飽和硫酸銨，攪拌均勻后放到4℃靜置1-2小時(shí)，取出后以3000～5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15～20分鐘，棄上清，用與最初血清等體積的生理鹽水溶解沉淀；3.重復(fù)步驟2；4.將溶液裝透析袋，4℃透析48小時(shí)，每天更換3～4遍透析液(蒸餾水或生理鹽水或PBS緩沖液)；5.將透析好的免疫球蛋白裝入容器中，冷凍保存。
現(xiàn)有的生產(chǎn)方法存在著以下缺點(diǎn)1.此方法所提取主要是IgG免疫球蛋白，免疫品種單一，不能達(dá)到理想的免疫效果；2.硫酸銨鹽易殘留在產(chǎn)品中，產(chǎn)品純度不高，注射后不易吸收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的免疫球蛋白單一、免疫效果不理想及產(chǎn)品純度低的技術(shù)問(wèn)題，提供一種具有三種免疫球蛋白、純度高的動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括如下步驟a.制備免疫血清，將免疫血清分裝于容器內(nèi)貯存于-20℃?zhèn)溆茫籦.用免疫血清分離提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；c.純化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；d.將三種免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；e.用納米級(jí)孔徑膜過(guò)濾。
所述的用免疫血清分離提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具體步驟如下a.將免疫血清與3倍體積的水混合，調(diào)PH值至7.7，將溶液的溫度降至0℃；b.在快速攪拌下，加入-20℃預(yù)冷的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心收集沉淀；c.將沉淀懸于25倍體積的生理鹽水中，加50mmol/L的乙酸溶液，使其形成沉淀，離心分離沉淀、上清；d.將上清調(diào)PH至7.4，加入-20℃預(yù)冷的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心收集沉淀即為IgG；e.將c步驟所獲得沉淀懸浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液調(diào)PH至5.1，離心后取上清，調(diào)整離子強(qiáng)度至0.075～0.01，pH5.5，然后加入已預(yù)冷至-20℃的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心后所得沉淀為IgA與IgM的混合物；f.將混合物溶于2mmol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃條件下透析3次；g.離心，所得沉淀即為IgM，上清即IgA。
所述的純化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具體步驟如下(2)純化IgG①材料蛋白A-瓊脂凝膠；CL4B緩沖液A.0.05M Tris/0.15M NaCl，pH8.6內(nèi)含0.02％疊氮鈉；B.0.05M磷酸鹽/0.15M NaCl，pH7.0；C.0.05M檸檬酸鹽/0.15M NaCl，ph5.5；D.0.05M醋酸鹽/0.15M NaCl，pH4.3；；
E.0.05M甘氨酸/0.15M NaCl，pH2.3；②操作方法A.稱取蛋白A-瓊脂糖凝膠CL4B，用緩沖液A膨脹后裝入柱子底端用尼龍絲團(tuán)堵??；B.用稀的氫氧化鈉調(diào)整，待親和層析的抗體溶液pH至8.6；C.將含量50毫克抗體樣品上層析柱，待樣品進(jìn)入柱床后，用緩沖液A洗脫結(jié)合的蛋白并用紫外光度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫液；D.用緩沖液B、C、D、E連續(xù)洗脫，收集分離物立即予以混和，再透析和濃縮，即得純化的IgG。
(2)純化IgM①材料2mmol/l磷酸鹽緩沖液pH6.0；Tris緩沖液-TBS；Sepharose6B；用TBS裝柱。
②操作方法A.將IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室溫下用TBS洗脫，收集洗脫物，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)光吸收值；B.第一大峰為含五聚體的IgM，隨后一小峰為大分子的凝聚物。
(3)純化IgA①材料Sephadex G200，用0.1M磷酸鹽緩沖液ApH6.8平衡裝柱，柱長(zhǎng)100厘米，內(nèi)徑3.2厘米；含0.1MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液B，pH7.5；含0.25MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液C，pH7.5；DEAE-纖維素，30毫升濕沉降體積層析柱裝柱。
②操作方法A.將IgA提取物經(jīng)Sephadex G200柱子用緩沖液A洗脫，每10毫升收集1管，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)吸收值，在少量的異物之后，第一個(gè)主要峰為IgA二聚體；B.將收集的IgA用緩沖液B透析，并用同一緩沖液平衡的離子交換劑裝柱，C.用緩沖液B洗脫60毫升后用緩沖液C150毫升洗脫，每5毫升收集一管，加樣，再用同一緩沖液洗脫；在280nm下監(jiān)測(cè)吸收值，收集IgA。
按本發(fā)明所生產(chǎn)的復(fù)合型免疫球蛋白包含有IgA、IgM和IgG三種免疫球蛋白，可同時(shí)具備IgA、IgM和IgG三種免疫功能，免疫效果好，解決了動(dòng)物病毒性疾病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的困擾問(wèn)題；產(chǎn)品中除三種免疫球蛋白外無(wú)其它蛋白，可避免由于硫酸銨鹽等殘留在產(chǎn)品中所造成的注射后不易吸收的現(xiàn)象。
具體實(shí)施例方式a.制備免疫血清(1).選用易感同源動(dòng)物，用一定量的免疫原免疫，免疫次數(shù)根據(jù)不同動(dòng)物、不同免疫原具體制定；(2).免疫血清的分離將裝有血液的容器放在室溫約1小時(shí)，使其充分凝固，然后置4℃過(guò)夜；(3).吸出清朗的血清置于瓶?jī)?nèi)；若血清中含有血細(xì)胞或血塊，以3000g離心20分鐘，收集上部清朗的血清；(4).將免疫血清分裝于適當(dāng)容器內(nèi)貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> b.用免疫血清分離提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM(1).將血清與3倍體積的水混合，調(diào)PH值至7.7，置-5℃～0℃低溫水槽(內(nèi)盛20％的乙醇水溶液)或冰水浴中，將溶液的溫度降至0℃；(2).在快速攪拌下，加入-20℃預(yù)冷的乙醇至終濃度為20％，并保持在冰浴中，使其產(chǎn)生沉淀，沉淀中含有多種類型的免疫球蛋白，4000轉(zhuǎn)30分鐘離心收集沉淀；(3).將沉淀懸于25倍體積的生理鹽水中，加50mmol/L的乙酸溶液調(diào)PH至5.1左右，使其形成沉淀，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，沉淀中含有IgA和IgM，上清中含有IgG；(4).將上清調(diào)PH至7.4左右，加入-20℃預(yù)冷的乙醇至終濃度為25％，并保持在水浴中，使其產(chǎn)生沉淀，離心收集沉淀即為IgG；(5).將(3)中所獲得沉淀懸浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液調(diào)PH至5.1，離心后取上清，調(diào)整離子強(qiáng)度至0.075～0.01，PH5.5。然后加入已預(yù)冷至-20℃的乙醇至終濃度為10％，并保持在冰浴中，離心后所得沉淀主要為IgA、IgM。
(6)將混合物溶于2mmol/L的磷酸鹽緩沖液pH6.0，4℃下透析3次。
(7)離心，所得沉淀即為IgM，IgA則在上清中。
c.純化免疫球蛋白IgG，提純IgA、IgM
(1)IgG的純化蛋白A-瓊脂凝膠親和層析①材料蛋白A-瓊脂凝膠CL4B(Protein A-Sepharose CL4B瑞典phamacia公司出品)緩沖液A.取6.06克Tris加8.76克NaCL溶于800毫升水中，用HCl調(diào)pH8.6，加疊氮鈉液和水至1000毫升，制成0.05M Tris/0.15M NaCL，pH8.6內(nèi)含0.02％疊氮鈉的緩沖液A.
B.取2.17克Na2HPO4加1.35克NaH2PO4加8.76克NaCL依次溶于1000毫升水中，pH7.0，制成0.05M磷酸鹽/0.15M NaCL，pH7.0的緩沖液B。
C.取2.68克檸檬酸(含一分子水)加10.96克檸檬酸三鈉(含二分子水)加8.76克NaCL加水1000毫升，pH5.5，制成0.05M檸檬酸鹽/0.15M NaCL，ph5.5的緩沖液C.
D.取6.8克醋酸鈉加8.76克NaCL加水800毫升，加醋酸調(diào)pH4.3用水加至1000毫升，制成0.05M醋酸鹽/0.15M NaCL，pH4.3的緩沖液DE.取5.6克甘氨酸加8.76克NaCL加水800毫升，用強(qiáng)酸調(diào)pH2.3，加水至1000毫升，制成0.05M甘氨酸/0.15M NaCL，pH2.3的緩沖液E.
②操作方法A.稱取蛋白A-瓊脂糖凝膠CL4B用緩沖液A膨脹后裝入柱子底端用尼龍絲團(tuán)堵住。
B.用稀的氫氧化鈉調(diào)整待親和層析的抗體溶液pH至8.6。
C.降含量約50毫克抗體樣品上層析柱，待樣品進(jìn)入柱床后，用緩沖液A洗脫結(jié)合的蛋白(用紫外光度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫液)。
D.用緩沖液B、C、D、E連續(xù)洗脫，，收集適合的分餾物立即予以中和，再透析和濃縮。
E.柱的再生，用緩沖液D洗柱，然后再用緩沖液A平衡柱子可完成柱的再生。
(2)IgM的純化①材料2mM磷酸鹽緩沖液pH6.0；；Tris緩沖液(TBS)；Sepharose6B；用TBS裝柱，柱層析裝置。
②操作方法
A.將IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室溫下用TBS洗脫，收集洗脫物，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)光吸收值；B.第一大峰為含五聚體的IgM，隨后一小峰為大分子的凝聚物。
(3)IgA純化①材料Sephadex G200，用0.1M磷酸鹽緩沖液ApH6.8平衡裝柱，柱長(zhǎng)100厘米，內(nèi)經(jīng)3.2厘米；0.1MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液B，pH7.5；0.25MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液C，pH7.5；DEAE-纖維素，30毫升濕沉降體積層析柱裝柱。
②操作方法A.將提取液經(jīng)Sephadex G200柱子用pH6.8 0.1M磷酸鹽緩沖液洗脫，每10毫升收集1管，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)吸收值，在少量的異物(凝聚蛋白)之后，第一個(gè)主要峰為IgA二聚體；B.將收集的IgA用緩沖溶液A透析，并用同一緩沖液平衡的離子交換劑裝柱，加樣，再用同一緩沖液洗脫；C.洗脫大約60毫升緩沖液時(shí)，則280nm波長(zhǎng)的吸收值返回基線，然后用的緩沖液C150毫升洗脫，每5毫升收集一管，在280nm下監(jiān)測(cè)吸收值；D.游離的分泌成分可被開始的緩沖液洗掉，IgA則被較高濃度鹽的緩沖液洗脫出。
含量測(cè)定、半成品檢、成品檢驗(yàn)蛋白質(zhì)含量測(cè)定紫外光吸收法，利用下面的公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量單位為mg/mlPr＝(1.45*OD280-0.74*OD260)d.將三種免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；e.用納米級(jí)孔徑膜過(guò)濾。
半成品檢定液體制劑于除菌過(guò)濾和除病毒后應(yīng)做理化檢查及熱原質(zhì)試驗(yàn)，并抽樣做無(wú)菌試驗(yàn)，結(jié)果符合要求。
成品檢驗(yàn)抽樣每批成品分別做物理檢查、化學(xué)檢定、蛋白質(zhì)含量、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、無(wú)菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)和安全試驗(yàn)等全面的質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果符合要求。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括如下步驟a.制備免疫血清，將免疫血清分裝于容器內(nèi)貯存于-20℃?zhèn)溆茫籦.用免疫血清分離提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；c.純化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；d.將三種免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；e.用納米級(jí)孔徑膜過(guò)濾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的用免疫血清分離提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具體步驟如下a.將免疫血清與3倍體積的水混合，調(diào)PH值至7.7，將溶液的溫度降至0℃；b.在快速攪拌下，加入-20℃預(yù)冷的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心收集沉淀；c.將沉淀懸于25倍體積的生理鹽水中，加50mmol/L的乙酸溶液，使其形成沉淀，離心分離沉淀、上清；d.將上清調(diào)PH至7.4，加入-20℃預(yù)冷的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心收集沉淀即為IgG；e.將c步驟所獲得沉淀懸浮于0℃水中，加50mmol/L的乙酸溶液調(diào)PH至5.1，離心后取上清，調(diào)整離子強(qiáng)度至0.075～0.01，pH5.5，然后加入已預(yù)冷至-20℃的乙醇，使其產(chǎn)生沉淀，離心后所得沉淀為IgA與IgM的混合物；f.將混合物溶于2mmol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃條件下透析3次；g.離心，所得沉淀即為IgM，上清即IgA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，所述的純化免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的具體步驟如下(1)純化IgG①材料蛋白A-瓊脂凝膠；CL4B緩沖液A.0.05M Tris/0.15M NaCl，pH8.6內(nèi)含0.02％疊氮鈉；B.0.05M磷酸鹽/0.15M NaCl，pH7.0；C.0.05M檸檬酸鹽/0.15M NaCl，ph5.5；D.0.05M醋酸鹽/0.15M NaCl，pH4.3；；E.0.05M甘氨酸/0.15M NaCl，pH2.3；②操作方法A.稱取蛋白A-瓊脂糖凝膠CL4B，用緩沖液A膨脹后裝入柱子底端用尼龍絲團(tuán)堵??；B.用稀的氫氧化鈉調(diào)整，待親和層析的抗體溶液pH至8.6；C.將含量50毫克抗體樣品上層析柱，待樣品進(jìn)入柱床后，用緩沖液A洗脫結(jié)合的蛋白并用紫外光度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫液；D.用緩沖液B、C、D、E連續(xù)洗脫，收集分離物立即予以混和，再透析和濃縮，即得純化的IgG。(2)純化IgM①材料2mmol/l磷酸鹽緩沖液pH6.0；Tris緩沖液-TBS；Sepharose6B；用TBS裝柱。②操作方法A.將IgM的提取物加到Sepharose6B柱上，室溫下用TBS洗脫，收集洗脫物，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)光吸收值；B.第一大峰為含五聚體的IgM，隨后一小峰為大分子的凝聚物。(3)純化IgA①材料Sephadex G200，用0.1M磷酸鹽緩沖液ApH6.8平衡裝柱，柱長(zhǎng)100厘米，內(nèi)徑3.2厘米；含0.1MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液B，pH7.5；含0.25MNaCl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液C，pH7.5；DEAE-纖維素，30毫升濕沉降體積層析柱裝柱。②操作方法A.將IgA提取物經(jīng)Sephadex G200柱子用緩沖液A洗脫，每10毫升收集1管，在280nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)吸收值，在少量的異物之后，第一個(gè)主要峰為IgA二聚體；B.將收集的IgA用緩沖液B透析，并用同一緩沖液平衡的離子交換劑裝柱，加樣，再用同一緩沖液洗脫；C.用緩沖液B洗脫60毫升后用緩沖液C150毫升洗脫，每5毫升收集一管，在280nm下監(jiān)測(cè)吸收值，收集IgA。
全文摘要
本發(fā)明公開一種動(dòng)物用復(fù)合型免疫球蛋白的生產(chǎn)方法，包括如下步驟制備免疫血清，將免疫血清分裝于適當(dāng)容器內(nèi)貯存于－20℃?zhèn)溆茫挥妹庖哐宸蛛x提取免疫球蛋白IgG、IgA及IgM；純化免疫球蛋白IgG、IgA、IgM；將三種免疫球蛋白IgG、IgA、IgM按8～10∶1∶1～2比例混合；用納米級(jí)孔徑膜過(guò)濾。按本發(fā)明所生產(chǎn)的復(fù)合型免疫球蛋白包含有IgA、IgM和IgG三種免疫球蛋白，可同時(shí)具備IgA、IgM和IgG三種免疫功能，免疫效果好，解決了動(dòng)物病毒性疾病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的困擾問(wèn)題；產(chǎn)品中除三種免疫球蛋白外無(wú)其它蛋白，可避免由于硫酸銨鹽等殘留在產(chǎn)品中所造成的注射后不易吸收的現(xiàn)象。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1763096SQ20051004720
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
發(fā)明者江國(guó)托 申請(qǐng)人:大連三儀動(dòng)物藥品有限公司