專利名稱：微小rna的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，尤其是微小RNA的新用途，即miR-17-5p和miR-20a 的新用途。
背景技術(shù)：
髓系抑制細胞(MDSCs)作為免疫抑制系統(tǒng)的重要組成部分在免疫應(yīng)答中發(fā)揮廣 泛的免疫抑制作用，尤其是T淋巴細胞。MDSCs在小鼠細胞特征性表達Ly 6C/G和CDllb表 面分子，而在人類細胞特征性的表面分子為⑶llb+CD33+HLA-DR_。小鼠⑶llb+Gr-Γ細胞通 過形態(tài)學、分子組成和功能學三方面分成了兩個亞型單核細胞型(MO-MDSCs)類似炎癥性 的單核細胞，表達Ly6C標記；低密度的多形核白細胞型(PMN-MDSCs)類似不成熟的白細胞， 表達Ly6G標記，它們都對T淋巴細胞有抑制作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)大量積聚 MDSCs,因此清除和改變MDSCs的功能成為近年來的研究熱點。然而調(diào)節(jié)MDSCs功能的合理 機制始終難解，一些研究證實MDSCs調(diào)節(jié)JAK2-STAT3通路。STAT3 (信號傳導子和激活子 3)轉(zhuǎn)錄因子使MDSCs擴增并且增加了小鼠腫瘤的免疫耐受。因此，抑制或沉默STAT3可以 抵抗MDSCs的作用從而促進機體對于腫瘤的免疫應(yīng)答。
小干擾RNAs (MicroRNAs，miRNAs)是一類短小的非編碼RNA。MicroRNAs這種非 編碼調(diào)控RNA，是由機體自我產(chǎn)生，具有18-25個堿基，主要通過與靶基因信使RNA (mRNA) 3’ 非翻譯區(qū)(3’ -UTR)配對結(jié)合來實現(xiàn)對基因的調(diào)控。在生理和病理條件下，MicroRNAs在 細胞增殖、細胞死亡、細胞分化發(fā)育、新陳代謝、病毒感染和腫瘤中均發(fā)揮著重要作用。許 多克隆于小鼠骨髓細胞的MicroRNAs調(diào)節(jié)著造血系統(tǒng)，同時MicroRNAs對于免疫細胞的發(fā) 育，固有免疫和適應(yīng)性免疫起著決定性作用。MicroRNAs選擇性的或高表達于免疫細胞，例 如miR-17 92，miR-155，miR-181和miR-223在骨髓和淋巴細胞的成熟、增殖、分化過程中有 “允許”作用。
腫瘤是危害人類身體健康的首要疾病之一，據(jù)報道癌癥患者的平均生存率僅為5 年，而癌癥治愈率只有20% -30%左右。過去十年我國雖然在腫瘤的防治方面取得了很大 進展，出現(xiàn)了許多新技術(shù)新方法，發(fā)展了多種抗腫瘤免疫治療，但到目前為止，這些方法遠 沒有達到人們的預(yù)期效果，一個重要的原因就是缺少生物治療。目前腫瘤治療中發(fā)展最為 迅速的一個領(lǐng)域是靶向藥物治療，被大家廣泛重視，同時基因治療代表著未來腫瘤防治方 向。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供miR-17_5p和miR-20a的新用途。通過沉默 STAT3，miR-17-5p和miR_20a減輕了 MDSCs的免疫抑制，成為作為制備應(yīng)用miRNA免疫治 療作用的藥物來治療一些疾病特別是腫瘤的切入點。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是
miR-17-5p具有抑制髓系抑制細胞積聚的用途。3
優(yōu)選的，所述miR-17_5p通過阻礙髓系抑制細胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫 瘤生長的用途。
優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。
優(yōu)選的，所述miR-17_5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系抑制細胞積聚 以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點的藥物來抑制腫瘤生長。
優(yōu)選的，所述miR-17-5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生 長的靶向藥物中的用途。
miR-20a具有抑制髓系抑制細胞積聚的用途。
優(yōu)選的，所述miR-20a通過阻礙髓系抑制細胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制腫瘤 生長的用途。
優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。
優(yōu)選的，所述miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系抑制細胞積聚以 抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點的藥物來抑制腫瘤生長。
優(yōu)選的，所述miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長 的靶向藥物中的用途。
本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學技術(shù)和生物信息學分析對miR-17_5p和miR-20a的功能 進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a具有抑制MDSCs的功能，進而發(fā)現(xiàn)miR-17_5p 和miR-20a具有抑制腫瘤生長的用途，可以將miR-17_5p和miR-20a設(shè)計為靶向藥物來治 療腫瘤，對腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價值，并且為進一步研究miR-17-5p和 miR-20a的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。


圖 1 是miR-17-5p 和 miR_20a 結(jié)合于 STAT3 3，UTR ；
圖 2 是miR-17-5p 和 miR_20a 調(diào)節(jié) STAT3 的表達；
圖3是在體外，miR-17-5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用；
圖4是在體內(nèi)，miR-17_5p和miR_20a減輕MDSCs的抑制作用，其中Al-大小、 A2-重量、A3-體積，Bl-重量、B2-體積；
圖5是腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)miR-17_5p和miR-20a的表達，其中圖5B1顯示的是成 熟miR-17-5p的表達水平，圖5B2顯示的是成熟miR-20a的表達水平，圖5B3顯示的是STAT3 mRNA的表達水平；
圖6是本研究中所用引物。
具體實施方式
為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實 施方式對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進一步的詳細說明。
實施例1
構(gòu)建腫瘤小鼠模型、BMCs的制備以及miRNA基因和3’ -UTR的表達構(gòu)建4
(1)腫瘤鼠模型的建立
使用4-6周的雌性的BALB/C鼠和C57BL/6鼠和裸鼠(北京動物中心)，實驗前一 周將鼠飼養(yǎng)在不存在對鼠致病的病原體的環(huán)境內(nèi)，保證鼠處于病原體免疫狀態(tài)。實驗構(gòu)建 了 s. c.腫瘤模型(靜脈注射腫瘤模型)，包括在BALB/C鼠內(nèi)構(gòu)建CD6結(jié)腸癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠體內(nèi)構(gòu)建Lewis肺癌模型(ATCC)和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大 學)。鼠皮下一次性注射100微升PBS (磷酸鹽緩沖液)，內(nèi)含5 X IO5腫瘤細胞。模型構(gòu)建 時每個模型所注射的腫瘤細胞的數(shù)量是以在注射后3-4周內(nèi)能形成一直徑約為1. 5厘米的 腫瘤為依據(jù)的。
(2)細胞系和髓系抑制細胞的準備。
實驗所需要的人的胚胎腎細胞系HEK493 T細胞，鼠的單核白細胞/巨噬細胞系 RAW264. 7和人的單核白細胞系U937均是從美國型培養(yǎng)菌種集(ATCC)購買的。鼠的髓系 抑制細胞(MDSCs)從骨髓細胞(BMCs)誘導獲得，從模型鼠的股骨中收集BMCs，室溫下懸浮 于aiilACK緩沖液5分鐘，使紅細胞裂解。T細胞和B細胞通過磁力珠進行選擇，選擇完成之 后，⑶4 T細胞，⑶8 T細胞和B細胞與BMCs的比例不超過1%。除非特殊說明，以下實施例 中所使用的BMCs均為經(jīng)過上述選擇獲得的細胞。MDSCs從這些獲得的BMCs誘導獲得。首 先在M孔板內(nèi)，37°C，5% C02的條件下，處理單核白細胞-粒細胞集落刺激因子(GM-CSF ； 20ng/ml)五天，在含有RPMI1640媒介和3% FCS，1 %青霉素和鏈霉素，以及經(jīng)過處理的白 細胞-粒細胞集落刺激因子(GM-CSF ;20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的M孔轉(zhuǎn)染板內(nèi)，再將 5 X IO4的CT-26，Lewis或1D8腫瘤細胞分別與2 X IO6BMCs共培養(yǎng)。收集細胞并用流式細 胞儀進行分析。
鼠的MDSCs同樣按照制造商(Miltenyi Biotech)提供的方法步驟使用Gr-1抗體 和LS柱的免疫磁珠從CD6腫瘤模型鼠的脾臟中分離獲得，再使用抗Gr-I和CDllb抗體染 色后使用流式細胞分選進行分類。具體實現(xiàn)上，殺死CD6結(jié)腸癌模型鼠，以無菌注射器分 別從小鼠的脾臟和血液中獲取細胞，使用水破壞紅細胞，并進行血清封閉。用:3mlPBS懸浮 細胞，首先加入⑶8+T淋巴細胞、⑶4+T淋巴細胞和B淋巴細胞的抗體30 μ 1，在冰上靜置15 分鐘后，用PBS洗一遍；之后加入⑶4+Τ淋巴細胞、⑶8+Τ淋巴細胞和B淋巴細胞的陽性選定 的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上靜置30分鐘，用PBS洗兩遍，得到不含⑶8+淋巴細胞、⑶4+Τ淋巴 細胞和B淋巴細胞的BMCs。提純的脾的MDSCs 90%以上為Grl+⑶Ilb+細胞。
從脾臟制備單細胞懸液，使用ACK緩沖液除去紅細胞。在使用這些單獨的細胞前， 轉(zhuǎn)染這些Grl+細胞并在腫瘤上清液中培養(yǎng)M小時。
(3)miRNA、siRNA 和 3' -UTR 的表達構(gòu)建
從廣東銳博生物公司購買miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics, miR-17-5p 的抑制物，miR-20a的抑制物以及miRNA抑制物的陰性對照。從廣東銳博生物公司購買 STAT3 siRNA和siRNA陰性對照。從hvitrogen公司購買空白iT熒光寡核苷酸。從Open biosystem 公司購買 pCMV-SP0RT6/STAT3 完全編碼序列(cDNA clone ID :3593588 Catalog No :MMM4769_99609717)的表達載體，此編碼序列中包含一個miR-17_5p and miR_20a種子 序列的3’ UTR。使用引物，將鼠的基因組中的Pri-miR-17-5p和Pri_miR-20a基因于Hind III和Xho I位點克隆到pcDNA3. 1表達載體上。獲得的構(gòu)造物稱為pcDNA3. l-miR-17_5p 和 pcDNA3. l-miR-20a。
通過PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))的方法從鼠脾臟細胞的基因組DNA克隆STAT的 3，UTR,并將其在Me I和^CbaI位點連接到pIS2熒光素酶報告載體(Addgene)上。通過 PCR的方法構(gòu)建了 STAT3的3 ‘ UTR的突變體，突變體經(jīng)過質(zhì)粒DNA測序進行確認，在圖六 中列出了實驗中所用的引物。
如圖IAl所示，設(shè)計了 4種不同的引物并通過PCR的方法構(gòu)建STAT的3’-UTR的突 變體(Mut) 1、突變體2。如圖1A2所示，構(gòu)建的熒光報告質(zhì)粒包括種子序列1 (156-162，STAT3 3，UTR1)、種子序歹Ij 2(403-409, STAT3 3，UTR2)、突變種子序列 1 (STAT3 3，UTRl Mut)、突 變種子序列2(STAT3 3，UTR2 Mut)、種子序列1和種子序列2 (STAT3 3，UTR1+2)、突變種 子序列1和種子序列2(STAT3 3，UTRl Mut+2)或者種子序列1和突變種子序列2 (STAT3 3，UTRl+2Mut)。
PCR 條件
IOX擴增緩沖液IOul
4 種 dNTP 混合物各 200umol/L
引物各 10 IOOpmol
模板 DNA 0. 1 2ug
Taq DNA 聚合酶 2. 5u
Mg2+ 1. 5mmol/L
加雙或三蒸水至IOOul
實施例2
驗證miR-17-5p 和 miR_20a 與 STAT3 3，UTR 的綁定關(guān)系
應(yīng)用熒光素酶報告基因來分析驗證miR-17-5p和miR-20a與STAT3 3'UTR的綁定 關(guān)系。對于轉(zhuǎn)染的腎(人胚腎)293T細胞，轉(zhuǎn)染前一天用250毫升細胞密度為4X104的培 養(yǎng)基將細胞在48孔板進行鋪板，按照說明書，將細胞與表達質(zhì)粒、海腎熒光素酶報告質(zhì)粒 和對照質(zhì)粒(ftOmega)用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen公司)進行共轉(zhuǎn)染，通過轉(zhuǎn)染后24小時 使用雙熒光素酶試劑盒測定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動，海腎熒光素酶的活性根據(jù)螢火 蟲熒光素酶活性進行標準化并進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析采用檢定的方法，95%的置信限度 被認為是有意義的，*(單一星號)P < 0. 05，**(雙星號)P < 0. 01。轉(zhuǎn)染了抑制劑陰性對 照的細胞作為對照組(Ctr.)，有pLS2-REP0RT-STAT3 3，UTR和miRNA對照結(jié)構(gòu)物(miRctr) 的活性直接被設(shè)定為1。
具體實現(xiàn)為
1)轉(zhuǎn)染用 STAT3 的 3，UTRU STAT3 的 3，UTRl 突變體，STAT3 的 3，UTR2、STAT3 的 3，UTR2 突變體禾口 STAT3 的 3，UTR1+2、STAT3 的 3，UTR1+2 的突變體分別與 pcDNA3. 1-pr i-miR17-5p(miR-17-5p)、pcDNA3. l-pri_miR-20a 或者對照結(jié)構(gòu)物(miRctr)共轉(zhuǎn)腎(人胚 腎)293T細胞。另外構(gòu)建一組由miR-17-5p和miR-20a抑制劑分別在0. InMUOnM和IOOnM 濃度下轉(zhuǎn)染的細胞。
2)制備被動裂解緩沖液IXPLB 將1倍體積的5XPLB (Passive LysisBuffer)加 到4倍體積的蒸餾水中，混合均勻，在4°C儲存1個月。
3)制備 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目錄號 E1980 105ml)溶解凍 干粉 Luciferase Assay Substrate，_20°C存儲 1 個月。
4)制備 Stop & Glo 試劑加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 緩沖液中，制成IXMop & Glo試劑。
5)按照說明書將細胞與表達質(zhì)粒、海腎熒光素酶報告質(zhì)粒和對照質(zhì)粒(!Iomega) 用脂質(zhì)體2000(InvitrOgen公司)進行共轉(zhuǎn)染。
6)細胞裂解
(1)除去培養(yǎng)細胞中的培養(yǎng)基；
(2)用IXPBS清洗培養(yǎng)細胞，去掉清洗液；
(3)按48孔65ul將1 XPLB加入到培養(yǎng)孔中。
7)被動裂解
在室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15分鐘，把裂解液轉(zhuǎn)移到檢測試管中。
8)轉(zhuǎn)染后M小時測定海腎和螢火蟲熒光素酶的活動
設(shè)置自動進樣器1和2分別分裝IOOul的LARII和Mop&Glo試劑。測量時，使用 1-2秒延遲和5-10秒讀數(shù)，在螢光發(fā)光儀上(Luminometer)
(1)加入 20ulPLB 裂解液
(2)加入 lOOulLARII
(3)檢測螢火蟲螢光素酶
(4)加入 100uBtop&Glo 試劑
(5)檢測海腎螢光素酶的活性
(6)其它孔如此循環(huán)操作。
如圖IB所示，通過熒光素酶活性的比較可以看出，miR-17_5p和miR-20a都能夠 直接的與STAT3 3，UTR的位置156-162 (Bi)和位置403-409 (B2)相互作用進而抑制報告 基因的表達。而STAT的3，UTR種子序列的突變體解除了 miR-17-5p和miR-20a的抑制活性。
如圖IC 所示，顯示了轉(zhuǎn)染了 STAT3 3，UTR1+2 和 pcDNA3. l-pri-miR17-5p 或者 pcDNA3. l-pri-miR-20a以及濃度上升的miR-17_5p抑制劑(Cl)或者miR_20a抑制劑(C2) 的四31~細胞的熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染了抑制劑陰性對照的細胞作為對照組(Ctr.)。我們可以 看出miR-17-5p的抑制劑和miR-20a的抑制劑也能分別明顯的阻塞miR-17_5p和miR_20a 對熒光素酶活性的負調(diào)控。
實施例3
STAT3 的表達被 miR-17_5p 和 miR_20a 調(diào)控
用空白iT熒光寡核苷酸轉(zhuǎn)染單核白細胞/巨噬細胞系RA\^64.7。轉(zhuǎn)染后M小時 用熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2A所示。
使用Western印跡分析的方法和定時定量PCR的方法觀察miR-17_5p和miR_20a 對STAT表達水平的影響。
(1)在室溫下封閉液中與抗鼠STAT3和抗鼠p47phaX分別反應(yīng)一個小時，通過用 過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(試劑盒)和增強化學發(fā)光劑(Amersham公司)對這種蛋白質(zhì)抗體 復(fù)合物進行檢測，其中抗鼠STAT3和抗鼠p47phax從SantaCruz Biotechnology公司獲得。 具體實現(xiàn)為
1)轉(zhuǎn)染按照說明書的步驟，通過核轉(zhuǎn)染的方法，用miR-17-5pmimicS、miR-20a7mimics,STAT3 siRNA或者由miRNA mimics、miRNA抑制劑和siRNA陰性對照寡核苷酸混合 組成的陰性對照(Ctr.)分別轉(zhuǎn)染7細胞，共轉(zhuǎn)48小時后進行Western蛋白印跡分 析以檢測STAT3，gp91和P47在各種共轉(zhuǎn)條件下mRNA和蛋白表達。
2)蛋白樣品的制備
1>倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液；
2>每瓶細胞加:3ml4°C預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動1分鐘洗滌細胞，然后棄去洗液， 重復(fù)以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液，然后把培養(yǎng)瓶置于冰上；
3>按Iml裂解液加IOyL苯甲基磺酰氟(PMSF) (IOOmM)，搖勻置于冰上；
4>每瓶細胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分鐘，為使細胞裂解充分 培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動；
5>裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用加樣器將細胞碎片 和裂解液移至1. 5ml離心管中；
6>4°C 12000rpm 離心 5 分鐘；
7>將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0. 5ml的離心管中放平_20°C保存。
3)電泳
DSDS-PAGE 凝膠配制
SDS-PAGE凝膠使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒進行配置；
2>樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中加 熱4分鐘，以充分變性蛋白；
3>上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀 察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標準，70V電壓 至分離膠與濃縮膠界面，后120V電壓至底。
4)轉(zhuǎn)膜
1>取一塊PAGE膠，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，同時把兩張同樣大小的濾紙和兩張海綿 也浸泡于緩沖液中；
2>剪一塊同樣大小的PVDF膜，做如下處理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去離子水中3分鐘，最后浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中3分鐘；
3>電轉(zhuǎn)三明治順序如下正極(白色)海綿
濾紙
PVDF 膜
蛋白膠
濾紙
海綿
負極(黑色)。
5)將三明治夾子放入預(yù)裝有電轉(zhuǎn)緩沖液的電泳槽中，加蓋，接通電源恒壓200V， 120分鐘；
6)將完成后的PVDF膜用去離子水沖洗，放入5%脫脂奶粉中，室溫60分鐘；
7)分別加入一抗(抗鼠STAT3和抗鼠p47phax)，室溫一小時，用TBST洗膜3次， 每次5分鐘；
8)加入酶標二抗(試劑盒)，室溫一小時，用TBST洗膜3次，每次5分鐘；
9)ECL顯色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室壓片，顯影液1分鐘，定影液 1分鐘。
(2) RNA 分離和定時定量 PCR(qRT-PCR)
對于基因和miRNA前體，qRT_PCR使用BIO-RAD熒光定量PCR設(shè)備，設(shè)計特異性的 引物。對于成熟的miR-17-5p和miR-20a，qRT-PCR使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的7900的一羥 色胺的序列檢測系統(tǒng)的標準熒光定量PCR試劑盒。擴增U6的小RNA(用于成熟miRNA的， 應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和GAPDH mRNA (用于基因和miRNA前體，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)作為每 一個實驗樣品的內(nèi)源性對照。所有的反應(yīng)都平行進行三組。因為折疊產(chǎn)生的變化按照制造 商的說明(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)采用-Δ ACt的方法進行計算。
結(jié)果如圖2B1所示，miR-17-5p和miR_20a均能影響gp91，p47and STAT3的轉(zhuǎn)錄 和表達。miR-17-5p和miR-20a降低gp91和p47的轉(zhuǎn)錄但是對STAT3的轉(zhuǎn)錄影響不大。然 而與此同時,如圖2B2所示，miR-17-5p和miR_20a降低了 STAT3 and p47的表達水平。
在RAW264. 7中，STAT3，gp91 and p47的轉(zhuǎn)錄和表達的相關(guān)水平通過用不用濃度的 miR-17-5p或miR-20a mimic轉(zhuǎn)染進行檢測。圖2C1. 1和Cl. 2顯示了在轉(zhuǎn)染了 miR-17_5p mimics或miR-20a mimics的7中成熟的miR-17_5p和miR_20a各自的表達水平。圖 2 的 C2. 1 和 C2. 2，C3. 1 和 C3. 2 以及 C4. 1 和 C4. 2 則分別顯示了轉(zhuǎn)錄了 miR-17_5p mimics 或 miR-20a mimics 的 RAW264. 7 中 STAT3, gp91 和 p47 的轉(zhuǎn)錄水平。圖 2 的 C5. 1 和 C5. 2 則顯示了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics 或miR_20a mimics 的7 中 STAT3 的蛋白水平。 由定時定量PCR的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)隨著miR-17-5p和miR-20a表達水平的升高，對于轉(zhuǎn) 錄了 miR-17-5p mimics 或 miR_20a mimics 的 7，細胞內(nèi)的 STAT3 轉(zhuǎn)錄水平并無明 顯的變化，gp91和p47的轉(zhuǎn)錄水平均逐漸下調(diào)；而由Western Blot的結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)隨 著轉(zhuǎn)錄的miR-17-5p和miR-20a濃度的升高，STAT3的蛋白水平明顯下調(diào)。
實施例4
miR-17-5p和miR_20a對于MDSCs的潛在抑制作用的體外實驗
(1)轉(zhuǎn)染
用miR-17-5p mimics,miR-20a mimics, STAT3 siRNA或混合陰性對照(混合miRNA mimics陰性對照寡核苷酸和siRNA陰性對照寡核苷酸)轉(zhuǎn)染7細胞。為了調(diào)查 腫瘤相關(guān)的Gr-Γ⑶Ilb+MDSC上在抗原特異性反應(yīng)中的抑制作用，用miR-17_5p mimics和 miR-20a mimics, miR-17_5p抑制劑和miR_20a抑制劑，STAT3 siRNA或者它們的陰性對照 (miRNA mimics對照，抑制劑對照和siRNA對照的混合物)轉(zhuǎn)染MDSCs (除非特殊說明每孔 5X IO5) ,Grl+CDlIb+MDSCs是從CD6腫瘤鼠的脾分離獲得的。VLP(25 μ g/ml)刺激下，將轉(zhuǎn) 染的MDSCs加入培養(yǎng)的脾的⑶4或⑶8 T細胞(1X106)。用miRNA、miRNA抑制劑或s iRNA 轉(zhuǎn)染MDSCs，用人類乳頭瘤病毒16的病毒樣粒子(VLPs)免疫鼠脾內(nèi)的單獨的CD4和CD8T 細胞，兩天后收取上層清液。VLPs分別的作為抑制因子、應(yīng)答因子和刺激因子，所有的陰性 對照都不能影響STAT3的表達。使用ELISA檢測上層清液中的IFN- y。VLPs特異性的⑶4 或CD8T細胞是與實施例1步驟O)的方法相同，使用CD4和CD8的陽性選擇磁珠和LS柱子(Mitenyi Biotech)篩選獲得的。
(2)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
ELISA夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒(Pierce Endogen)用于IFN-γ的定量檢測。使用 SpectraMax190ELISA檢測儀測定450nm時每個樣品(上述步驟(1)中獲取的上層清液)的 吸光度，細胞因子的水平通過標準曲線的三次滴定進行量化，單位為pg/ml。
(3) ROS 和 H2A 檢測
按照說明書，使用氧化敏感染料DCFDA(分子探針/Invitrogen)測定7 或 MDSC 產(chǎn)生的 ROS (活性氧)。單個的 CDllb+Gr-I+MDSCs 在 2. 5 μ MDCFDA 和 30ng/ml PMA(Sigma-Aldrich公司購買)中處理30分鐘，然后使用流式細胞分析進行分析；在冰 上，PBS收集細胞，使用以下的抗體(均從BD生物公司購買)異硫氰酸熒光素、聚乙烯和 與抗原呈遞細胞結(jié)合的抗 CD4 (L3T4)、抗 CD8 α (Ly-2)、抗 CD 19 (1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、 抗Gr-l(RB6-8(^)、抗Ly6G(lA^和抗Ly6C(AL21)抗體。清洗細胞兩次并在含有4% 多聚甲醛和1 % FCS(胎牛血清)的PBS溶液中再懸浮，在進行流氏細胞分析(FAkan， BectonDickson)前將懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對照作 為負對照。
H2O2的檢測使用過氧化氫檢測試劑盒(Invitrogen)，將IX IO4個細胞懸浮于PBS， 加入PMA(30ng/ml) 30分鐘后，使用熒光分光光度計(Bio-Rad)測量37°C、560nm的吸光度。 吸光度的結(jié)果使用連續(xù)稀釋20mM H2O2所做的標準曲線進行標準化。
如圖3々所示，1^1 -17-5 和1^1 -2(^均能降低在1^^^64.7細胞中1 05仏1)的表達 和H202 (A2)的產(chǎn)生；如圖;3B所示，miR-17-5p和miR-20a同樣能夠降低在腫瘤相關(guān)的MDSCs 中ROS的表達和H2O2的產(chǎn)生，其中圖3的Bi. 1和B2. LBL 2和B2. 2以及Bi. 3和B2. 3分別顯 不了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics (miR-17_5p. mi),miR-20a mimics (miR-20a. mi)，miR-17_5p 抑制劑(miR-17-5p. inh)和 miR_20a 抑制劑(miR-20a. inh)和陰性對照(Ctr.)的 MDSCs 中成熟miR-17-5p和miR-20a的表達水平、ROS的表達水平和H2A的產(chǎn)生，Geo代表幾何平 均數(shù)；如圖3C所示，miR-17-5p和miR-20a降低了腫瘤相關(guān)MDSCs的抑制潛能。miR-17_5p 和miR-20a阻塞了腫瘤相關(guān)MDSCs對于VUs特異性的CD4(C1，C2)和CD8T淋巴細胞(C3， C4)的影響效果。然而，miR17-5p和miR-20a抑制劑促進了腫瘤相關(guān)MDSCs對于VLPs特異 性的CD4(C1，C3)和CD8T淋巴細胞(C2，C4)的抑制效果。抑制率(Inhibition% )=在共 培養(yǎng)的T細胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上MDSCs的抗原除以在共培養(yǎng)的T細胞 中上清液所含有的IFN- γ的濃度加上沒有MDSCs的抗原，即
在共培養(yǎng)的τ細胞中上清液所含有的IFN- Y的濃度+MDSCs的抗原抑制率=_在共培養(yǎng)的T細胞中上清液所含有的IFN- γ的濃度+沒有MDSCs的抗原
統(tǒng)計分析時采用了檢定的方法，95%的置信限度被認為是有意義的，*(單個星 號)P < 0. 05，**(雙星號)P < 0. 01。
實施例5
miR-17-5p和miR_20a對于MDSCs的潛在抑制作用的體內(nèi)實驗
在MDSC抑制的體內(nèi)實驗中，在接種了 CT46腫瘤細胞之后的第一天到第七天，將miR-17-5p mimics 和 miR_20a mimics、miR-17_5p 抑制劑和 miR_20a 抑制劑、STAT3 siRNA 或STAT3的陰性對照轉(zhuǎn)染的MDSCs注射進入鼠的腫瘤內(nèi)。對于miRNA mimics、miRNA抑 制劑、siRNA或者siRNA陰性對照的轉(zhuǎn)染，在IOOnM的指示寡核苷酸濃度下，按照生產(chǎn)協(xié)議 (Amaxa，Germany)，運用核轉(zhuǎn)染(nucleofection)的方法對BALB/C鼠的BMC進行轉(zhuǎn)染，即殺 死小鼠取骨髓細胞，用1640培養(yǎng)基將BMC吹下來，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1 個細胞，加質(zhì)粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入電轉(zhuǎn)儀；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Stemcell程序進行電轉(zhuǎn)， 每次加樣100 μ 1，電轉(zhuǎn)后打入老鼠體內(nèi)即可。5周齡小鼠首先皮下注射5*105CT46細胞，一 周左右后至腫瘤長至米粒般大小，每只鼠分別注射2X IO6個預(yù)先處理好的BMCs，在7、11、 15、19、23、27天后殺死小鼠。測量腫瘤的大小、重量、體積，腫瘤的測量使用卡尺，每組6只 鼠去平均值，誤差線代表平均值士SD。統(tǒng)計分析時采用了檢定的方法，95%的置信限度被認 為是有意義的，單個星號P < 0. 05，雙星號P < 0. 01。
圖4A顯示了在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，用對照組(天然鼠)與分別移植了 轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics,miR-20a mimics 或者 STAT3 siRNA(STAT3siRNA)的 MDSCs 的鼠 體內(nèi)腫瘤的大小(Al)、重量(A2)、體積(A3)進行比較。與移植了用對照轉(zhuǎn)染的MDSCs(Ctr.) 接種過疫苗的CT-沈腫瘤鼠相比，在移植了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p mimics, miR-20a mimics或 者STAT3 siRNA的MDSCs的鼠體內(nèi)，腫瘤生長速度減慢。因此miR-17_5p，miR_20a或者 STAT3siRNA能夠減輕MDSCs的抑制潛能。
圖4B顯示了腫瘤的重量(Bi)和在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，移植了用對 照、miR-17-5p 抑制劑(miR-17_5p. inh)、miR_20a 抑制劑(miR_20a. inh)轉(zhuǎn)染的 MDSCs 的 鼠體內(nèi)腫瘤的體積(B2)，與移植了用對照轉(zhuǎn)染的MDSCs(Ctr.)接種過疫苗的CT46腫瘤鼠 相比，在移植了轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p抑制劑(miR-17-5p. inh)，miR_20a抑制劑(miR_20a. inh) 的MDSCs的鼠體內(nèi)，腫瘤生長加快，因此miR-20a抑制劑和miR-17_5p抑制劑加強MDSCs的 抑制潛能。
實施例6
腫瘤相關(guān)因素調(diào)節(jié)miR-17_5p和mir-20a的表達
(1)流式細胞分析對MDSCs分群
使用研磨法分別從患有CD6結(jié)腸癌、Lewis肺癌和1D8卵巢癌的小鼠的脾臟中取 細胞制備單細胞懸液
1)小鼠用C02處死，立即無菌取脾；
2)將脾浸入裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中，用鈍頭剪刀剪去白色的結(jié)締組織，換入另一 個裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中以清洗脾臟；
3)再次換入一個裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中；
4)用小的彎頭手術(shù)剪剪切脾臟成3mm左右的小塊；
5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓研磨脾臟小塊，此時會看到很 多脾單細胞進入PBS中；
6)使用Falcon(BD生物公司)過濾獲得單細胞懸液，用冷PBS洗滌2次，每次 1000r/min，離心 10 分鐘；
7)將細胞懸浮于RPMI 1640(含10%熱滅活胎牛血清)中，用臺酚蘭染色計數(shù)活 細胞數(shù)(在95%上)；11
8)調(diào)節(jié)細胞濃度為2 X IO6細胞/ml。
從BD生物公司購買異硫氰酸熒光素、聚乙烯和與抗原呈遞細胞結(jié)合的抗 CD4(L3T4)、抗 CD8a(Ly-2)、抗 CD19(1D8)、抗 CDllb (Ml/70)、抗 Gr-1 (RB6-8C5)、抗 Ly6G(lA8)和抗Ly6C(AL21)抗體。細胞染色后在含有4%多聚甲醛和FCS (胎牛血清) 的PBS溶液中再懸浮，得到MDSCs。在進行流氏細胞分析(FAkan，Becton Dickson)前將 懸液在4°C條件下保存，每組分析過程都用同型的單克隆抗體對照作為負對照。
如5A1所示，通過流式細胞分析，可以對MDSCs進行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ細 胞)及它的兩個亞群P2 (Ly6C+ly6G+細胞)和P3 (ly6G 口 ly6C+細胞)。
(2) qRT-PCR
使用qRT-PCR 的方法檢測腫瘤相關(guān)的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a， STAT3 和 GAPDH 的表達水平。腫瘤相關(guān)的 MDSCs 中 pri-miR-17_5p，pri_miR-20a，STAT3 和GAPDH的表達水平如圖5A2所示；從CT26腫瘤鼠(CT26)、Lewis腫瘤鼠(Lewis)和 1D8腫瘤鼠(1D8)的脾獲得的MDSCs中，成熟miR-17_5p，成熟miR_20a和STAT3在 Grl+CDlIb+MDSCs (A3) ,LyeG+LyeC+MDSCs (A4)和 LyeGl^eC+MDSCs (A5)的表達水平如圖 5A3、 A4、A5所示，從CT26結(jié)腸癌鼠、Lewis肺癌鼠和1D8卵巢癌鼠體內(nèi)的MDSCs內(nèi)，miR-17_5p 和miR-20a的表達水平降低。
將BMCs細胞和CD6腫瘤細胞在一個培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。使用qRT-PCR的方法檢測成 熟miR-17-5p(圖Bi)和成熟miR_20a(圖B2)和STAT3 mRNA(圖B3)的表達水平，圖5B1 顯示的是成熟miR-17-5p的表達水平，圖5B2顯示的是成熟miR_20a的表達水平，圖5B3 顯示的是STAT3 mRNA的表達水平。由結(jié)果我們可以得出結(jié)論腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)骨髓細胞 (BMCs)中 miR-17-5p、miR-20a 和 STAT3 的轉(zhuǎn)錄。
(3) Western蛋白印記分析
將BMCs細胞和CD6腫瘤細胞在一個培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，使用western blot檢測 STAT3的蛋白水平，方法如前所述。如圖5C所示，腫瘤相關(guān)因子調(diào)節(jié)STAT3和p47在BMCs 中的水平。
可見，miR-17-5p和miR-20a為具有減緩髓系抑制細胞(MDSCs)抑制作用等功能 的新分子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。通過本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a功能 之一就是調(diào)節(jié)STAT3表達量，而STAT3與腫瘤等疾病有著很密切的聯(lián)系。
在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)MDSCs的大量積聚，參與腫瘤細胞的免疫編輯，包括免疫清 除，免疫對抗，免疫逃逸三個過程，因此抑制MDSCs的表達則很可能成為有效治療腫瘤的手 段，本發(fā)明中miR-17-5p和miR-20a則通過調(diào)節(jié)STAT3表達來降低MDSCs的積聚，因此本發(fā) 明具有積極的效果和意義。
STAT3 表達量可以被 miR-17-5p 和 miR_20a 調(diào)節(jié)，通過 miR-17_5p 和 miR_20a 結(jié)合 STAT3 3，UTR結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR_20a后，由STAT3調(diào)節(jié)的ROS和H2O2的表 達量顯著下降。miR-17-5p和miR-20a轉(zhuǎn)染MDSCs后，降低了抗原特異性⑶4和⑶8陽性T 淋巴細胞的免疫抑制。重要的是，miR-17-5p和miR-20a降低了 MDSCs的抑制性，在小鼠腫 瘤MDSCs中轉(zhuǎn)染了 miR-17-5p和miR_20a之后腫瘤的生長速度要比未轉(zhuǎn)染的慢，然而作為 對照組，在小鼠腫瘤MDSCs中轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR-20a的抑制物之后腫瘤的生長速度明 顯加快。在腫瘤鼠中miR-17-5p和miR-20a的表達水平比未患病小鼠低，腫瘤相關(guān)因子下調(diào)miR-17-5p和miR_20a的表達量?？梢灶A(yù)見，在腫瘤患者體內(nèi)，miR-17_5p和miR_20a發(fā) 揮著打破腫瘤免疫耐受的重要作用，從而揭示了 miR-17-5p和miR-20a可以作為免疫治療 腫瘤的靶向分子。
上述參照具體實施方式
對該微小RNA的新用途進行的詳細描述，是說明性的而不 是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的 變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.miR-17"5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤 生長的靶向藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的miR-17-5p的新用途，其特征在于所述miR-17_5p在制備 通過調(diào)節(jié)免疫細胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長的靶向藥物中的用途。
3.miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生 長的靶向藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的miR-20a的新用途，其特征在于優(yōu)選的，所述miR_20a在制 備通過調(diào)節(jié)免疫細胞抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長的靶向藥物中的用途。
全文摘要
miR-17-5p在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-17-5p為靶點的藥物來抑制腫瘤生長；miR-20a在制備通過調(diào)節(jié)免疫細胞的表達抑制髓系來源抑制細胞積聚以抑制腫瘤生長的靶向藥物中的用途，即制備以miR-20a為靶點的藥物來抑制腫瘤生長，對腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價值，并且為進一步研究miR-17-5p和miR-20a的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P35/00GK102038703SQ20101055165
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者劉喬飛, 張園, 張苗苗, 楊榮存, 王萌萌, 陳穎瑩 申請人:南開大學