專利名稱：吡唑啉衍生物在用于預(yù)防和/或治療細(xì)胞增殖疾病的藥物制備中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通式(I)吡唑啉衍生物以及它們的生理學(xué)上可接受的鹽在藥物制備中的用途，該藥物在人和/或獸醫(yī)療法中可用于預(yù)防或治療細(xì)胞增殖疾病，特別是用于治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、腫瘤性血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為任何能夠從抑制負(fù)責(zé)環(huán)加氧酶(COX-2)合成的基因表達(dá)中獲益的過程，單用或者與其他產(chǎn)物聯(lián)合使用均可，在后者情況下產(chǎn)生協(xié)同性。
背景技術(shù)：
我們的專利申請No.WO 99/62884描述了通式(I)化合物和它們的生理學(xué)上可接受的鹽 它們是環(huán)加氧酶-2(COX-2)的抑制劑，在醫(yī)藥中用作抗炎劑。
人們對于調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)COX-2合成的基因的興趣日益增加，它的應(yīng)用不僅在于抗炎反應(yīng)，而且在于重要的病理學(xué)過程，例如細(xì)胞增殖與癌癥、免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、腦變性性疾病等，這表現(xiàn)在日益增加的相關(guān)文獻(xiàn)中。一組觀察結(jié)果已經(jīng)引起人們考慮COX-2抑制劑作為潛在的結(jié)腸直腸癌(CRC)化學(xué)預(yù)防劑。選擇COX-2作為目標(biāo)是基于它的過度表達(dá)頻率的結(jié)腸中高達(dá)90％的癌和40％的腺瘤顯示有大量的COX-2的mRNA和蛋白質(zhì)(Eberhart等Gastroenterology 19941071183-1188；Du Bois等Gastroenterology 19961101259-1262；Prescott等，Cell199687783-786)。另外，似乎這種過度表達(dá)歸于CRC中的腫瘤表型a)COX-2的過度表達(dá)已經(jīng)涉及編程性細(xì)胞死亡的抑制(Tsujii等Cell199583493-501)；b)COX-2在Apc(-)小鼠中的滅活與被抑制的腫瘤生長有關(guān)；c)結(jié)腸直腸癌中兩種最常見的基因改變、即Apc腫瘤抑制基因突變和ras致癌基因突變都涉及COX-2的過度表達(dá)(Boolbol等CancerRes.1996562556-2560；Sheng H.等J.Biol.Chem.1998273(34)2120-2127)。
我們的專利申請PCT/ES00/00245描述了包含這樣一種DNA構(gòu)建體的細(xì)胞系，它由全部或部分的COX-2基因啟動(dòng)子序列和表征基因組成，它們可有效地彼此連接，以便所述COX-2基因的啟動(dòng)子序列指向所述表征基因響應(yīng)于適合刺激的表達(dá)。試驗(yàn)方法涉及使所述細(xì)胞系與供試化合物接觸，測定表明活性因表征基因而表達(dá)的信號的存在。所要求保護(hù)的這種方法適合于尋找適合的刺激在COX-2轉(zhuǎn)錄水平上的誘導(dǎo)作用的選擇性抑制劑。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通式(I)化合物以及它們的生理學(xué)上可接受的鹽尤其可用于制備藥物，該藥物在人和/或獸醫(yī)療法中用于預(yù)防或治療細(xì)胞增殖疾病，確切地用于治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為任何能夠從抑制負(fù)責(zé)環(huán)加氧酶-2(COX-2)合成的基因表達(dá)中獲益的過程，單用或者與其他產(chǎn)物聯(lián)合使用均可，在后者情況下產(chǎn)生協(xié)同性。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及源于Δ2-吡唑啉的通式(I)吡唑啉在藥物制備中的用途，也已知為4，5-二氫-1H-吡唑
該藥物在人和/或獸醫(yī)療法中用于預(yù)防或治療細(xì)胞增殖疾病，確切地用于治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為任何能夠從抑制負(fù)責(zé)環(huán)加氧酶-2(COX-2)合成的基因表達(dá)中獲益的過程，單用或者與其他產(chǎn)物聯(lián)合使用均可，在后者情況下產(chǎn)生協(xié)同性。
式(I)中，R1代表氫原子、甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羧酸、具有少于1至4個(gè)碳原子的烷基羧酸酯、酰胺或氰基，R2代表氫原子或甲基，R3、R4、R7和R8相同或不同，代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基，R5代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、甲磺?；被酋；蛞阴０被酋；?，R6代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、甲磺?；?、氨基磺酰基或乙酰氨基磺?；?，其條件是取代基R5或R6之一是甲磺酰基、氨基磺酰基或乙酰氨基磺?；?，和其條件是當(dāng)R1代表甲基時(shí)，R2代表氫原子或甲基，
R3和R8相同或不同，代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基或三氟甲基，R4代表氫原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基，R5代表氟原子、三氟甲基、三氟甲氧基、甲磺?；?、氨基磺?；蛞阴０被酋；?，R6代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、甲磺?；?、氨基磺酰基或乙酰氨基磺?；?，其條件是取代基R5或R6之一是甲磺?；?、氨基磺?；蛞阴０被酋；蚏7代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基。
通式(I)化合物具有立體中心，因而可以制備成對映異構(gòu)純的或外消旋物?；衔?I)的外消旋物可以被常規(guī)方法拆分為它們的旋光異構(gòu)體，例如它們的非對映異構(gòu)鹽的手性分離色譜法或分步結(jié)晶法，使化合物(I)與對映異構(gòu)純的酸或堿反應(yīng)可以得到該非對映異構(gòu)鹽。同樣，使用對映異構(gòu)純的手性前體也可以通過對映選擇性合成得到它們。
本發(fā)明還涉及通式(I)化合物的生理學(xué)上可接受的鹽、無機(jī)與有機(jī)酸加成鹽和與堿金屬生成的鹽。
通式(I)化合物以及它們的生理學(xué)上可接受的鹽抑制負(fù)責(zé)環(huán)加氧酶-2(COX-2)合成的基因表達(dá)，這一點(diǎn)可以用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體JURKAT細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)顯示出來，按照我們的專利申請PCT/ES00/00245所述方法，使基因COX-2啟動(dòng)子與熒光素酶基因締合。
通式(I)化合物可以用于哺乳動(dòng)物，包括人，給以治療上的有效量，作為腫瘤形成前或腫瘤形成過程的預(yù)防或治療劑，部分地或完全地抑制腫瘤的生長、擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，以及部分地或完全地破壞腫瘤細(xì)胞。例如，通式(I)化合物可以用在腫瘤形成中，例如胃腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌和乳腺癌，或者用于預(yù)防或治療腺瘤息肉，包括常見的息肉病。
通式(I)化合物可以用于哺乳動(dòng)物，包括人，給以治療上的有效量，作為涉及血管生成的疾病的預(yù)防或治療劑，例如依賴于血管生成過程的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，和其他障礙，例如視網(wǎng)膜病和子宮內(nèi)膜異位。
通式(I)化合物可以用于哺乳動(dòng)物，包括人，給以治療上的有效量，作為惡病質(zhì)和其中有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)參與的其他障礙的預(yù)防或治療劑。
通式(I)衍生物可以按照我們的專利申請WO 99/62884所述方法制備。下面，借助實(shí)施例描述1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑(實(shí)施例3)及其對映異構(gòu)體(實(shí)施例79和80)的制備。表1和2顯示了非常相關(guān)的通式(I)化合物家族，以及它們的特征性物理化學(xué)性質(zhì)。
實(shí)施例3.-1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑的制備
經(jīng)由亞氨代乙?；苽?E)-1，1，1-三氟-4-(2，4-二氟苯基)-3-丁烯-2-酮在干燥惰性氣氛的燒瓶內(nèi)加入260ml無水THF，將其冷卻至-78℃，加入225ml 2M LDA的THF/正庚烷溶液，加入速率保持溫度在-65℃以下。此后，快速滴加二乙基甲基膦酸酯(34.25g，0.225mol)的30ml THF溶液，將其在-78℃下?lián)u動(dòng)30分鐘。然后滴加N-苯基三氟亞氨代乙酰氯(46.7g，0.225mol)的40ml THF溶液，在相同條件下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。加入2，4-二氟苯甲醛(33.6g，0.236mol)的40ml THF溶液，除去冷卻浴，使溫度升至環(huán)境溫度。在這些條件下?lián)u動(dòng)過夜。第二天早上，加入450ml 2NHCl，繼續(xù)搖動(dòng)24小時(shí)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)除去THF，將所得水溶液用AcOEt萃取(2×200ml)，用5％NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌，用硫酸鈉干燥，過濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑。以這種方式得到54.6g紅色液體粗產(chǎn)物，固化。在35mbar壓力下蒸餾粗產(chǎn)物，在107-14℃下收集(E)-1，1，1-三氟-4-(2，4-二氟苯基)-3-丁烯-2-酮的部分(43g，81％)。熔點(diǎn)50-1℃。
IR(KBr，cm-1)1717，1602，1583，1277，1146，1059，7061H-RMN(CDCl3)6,9(m，2H)，7.05(d，J＝16Hz，1H)，7,6(m，1H)，8.0(d，J＝16Hz，1H)13C-RMN(CDCl3)105.1(t，J＝26Hz)，112,6(dd，J＝4，22Hz)，116.4(q，J＝291Hz)，118.2，118.5，131.5(dd，J＝4，11Hz)，141.5，162.5(dd，J＝13，193Hz)，165,7(dd，J＝13，190Hz)，180(q，J＝36Hz)經(jīng)由羥醛縮合制備(E)-1，1，1-三氟-4-(2，4-二氟苯基)-3-丁烯-2-酮在燒瓶內(nèi)將2，4-二氟苯甲醛(250g，1.76mol)、冰乙酸(152.5g，2.54mol)和哌啶(152.5g，1.79mol)溶于3l THF。將溶液冷卻至5-10℃，向其中通入CF3COCH3 1.2mol)。除去冷卻浴，使溫度升至環(huán)境溫度，在所述溫度下?lián)u動(dòng)2小時(shí)。再次加入CF3COCH3 0.36mol)，搖動(dòng)2小時(shí)。加入另外 搖動(dòng)另外2小時(shí)，等等，直至加入總計(jì)約415g(3.7mol)CF3COCH3。加入20％氯化銨溶液(600ml)，在低壓下(50℃，80mbar)除去溶劑。加入300ml水，用AcOEt萃取。將有機(jī)相用水、5％H2SO4、水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥。過濾，蒸發(fā)。蒸餾所得粗產(chǎn)物，收集(30mbar)(E)-1，1，1-三氟-4-(2，4-二氟苯基)-3-丁烯-2-酮的部分(281.4g，68％)，熔點(diǎn)50-1℃。IR、1H-RMN和13C-RMN等同于經(jīng)由亞氨代乙?；卯a(chǎn)物。
1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑的制備將4-(氨基磺?；?苯基氯水合肼(hidrazine chlorhydrate)(243.8g，1.09mol)與(E)-1，1，1-三氟-4-(2，4-二氟苯基)-3-丁烯-2-酮(281.4g)的1600ml乙酸溶液在氮?dú)夥罩谢亓?4小時(shí)。將其冷卻，緩慢倒在水-冰(10-12l)上，同時(shí)劇烈搖動(dòng)和過濾。將其用甲苯(500ml)洗滌，干燥。得到328g粗產(chǎn)物(純度95.6％)，從二噁烷中結(jié)晶。得到216.7g 1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑，純度98.1％。結(jié)晶母液一旦濃縮，得到另外69.3g，純度97.5％。合并這兩部分，從異丙醇中重結(jié)晶，得到267.8g(61％)微細(xì)產(chǎn)物，粒徑＜100μm，純度99.5％，熔點(diǎn)161-2℃。
元素分析％C％H ％N％F計(jì)算值47.412.9810.3723.43實(shí)測值47.422.7710.3523.57IR(KBr，cm-1)3315，3232，1617，1593，1506，1326，1179，1099，10671H-RMN[300MHz，CDCl3，25℃，δ(ppm)]3.0(dd，J＝6.3和11.4Hz，1H)；3,80(dd，J＝11.4和12,6Hz，1H)；4,79(s寬峰，2H)；5,70(dd，J＝6.3和12,6Hz，1H)；6,8-6,95(m，2H)；7.01-7.09(m，3H)；7,74(d，J＝8,7Hz，2H)1H RMN[300MHz，DMSO-d6，25℃，δ(ppm)]3.13(dd，J＝18，5Hz，1H)；3.89(t，J＝16Hz，1H)；5.96(dd，J＝13，6Hz，1H)；7.03-7.16(m，5H)；7.33(m，2H)；7.64(d，J＝9Hz，2H)13C-RMN[75MHz，CDCl3，25℃，δ(ppm)]40.2，57,9，104,9(t，J＝25Hz)，112.4(dd，J＝4，22Hz)，113.5，120.4(q，J＝269Hz)，122.1(d，J＝17Hz)，128，128.2，133.5，139.5(q，J＝38Hz)，145,8，159,6(dd，J＝12，245Hz)，163(dd，J＝12，248Hz)13C RMN[75MHz，DMSO-d6，25℃，δ(ppm)]39.7，58.8，105.1(t，JC-F＝26Hz)，112.1(dd，JC-F＝22，3Hz)，113.3，120.9(q，JC-F＝268Hz)，123.1(dd，JC-F＝14，4Hz)，127.4，130.0(dd，JC-F＝10，5Hz)，135.9，139.0(q，JC-F＝37Hz)，144.6，160.0(dd，JC-F＝247，13Hz)，162.3(dd，JC-F＝246，13Hz)MS[EI，-70eV，m/z(％)]405(M+，100)，386(4)，341(7)，292(14)，156(26)，139(16)(+)-1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑(實(shí)施例79)和(-)-1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑(實(shí)施例80)的制備外消旋混合物(±)-1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑被高分辨率液相色譜法拆分為它的對映異構(gòu)體，使用CHIRALPAK AS柱，粒徑10μ，尺寸25×2cm(Daicel)，流動(dòng)相為含0.1％二乙胺的甲醇，流速8ml/min。得到保留時(shí)間為7.4分鐘的(+)-1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑，為白色固體，m.p.173-4℃；對映異構(gòu)純度99.9％；[α]D＝+183.9(c＝1 CH3OH)。得到保留時(shí)間為9.2分鐘的(-)-1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑，為白色固體，m.p.173-4℃；對映異構(gòu)純度99.9％；[α]D＝-189.4(c＝1 CH3OH)。
表1
表2
在人類療法中，本發(fā)明化合物的給藥劑量取決于所治療病癥的嚴(yán)重性。通常位于10與500mg/天之間。本發(fā)明化合物可以作為單一的活性成分給藥，或者與另一種產(chǎn)物一起給藥，目的是獲得協(xié)同性。本發(fā)明化合物的適合的藥物制劑可以被口服、透皮、腸胃外、皮下、鼻內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。含有通式(I)化合物的藥物組合物描述在我們的專利申請WO 99/62884中。
生物學(xué)評價(jià)通式(I)化合物可用于治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為能夠從抑制負(fù)責(zé)環(huán)加氧酶(COX-2)合成的基因表達(dá)中獲益的過程。為了證明這些活性，下面借助實(shí)例提供若干藥理試驗(yàn)。
COX-2誘導(dǎo)作用的抑制為了測定對環(huán)加氧酶-2轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用的抑制能力，使用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體JURKAT細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)，并使基因COX-2的啟動(dòng)子與熒光素酶基因締合。使用三種獨(dú)立的克隆C3、C7和F9，它們的基礎(chǔ)熒光素酶活性從4500至180,000RLUs/105細(xì)胞不等，活性響應(yīng)于刺激劑而增加，例如細(xì)胞發(fā)信號途徑的前炎型激活物，例如佛波酯(TPA)和實(shí)電解質(zhì)(離子霉素)。
關(guān)于試驗(yàn)，將細(xì)胞用供試化合物預(yù)處理1小時(shí)，然后用TPA+離子霉素刺激6小時(shí)。然后得到細(xì)胞提取物，其中檢查熒光素酶活性，測定蛋白質(zhì)濃度。把熒光素酶活性的抑制作為COX-2誘導(dǎo)作用的抑制指征。
作為通式(I)化合物的活性實(shí)例，我們在下面顯示利用實(shí)施例10化合物所得結(jié)果，顯示對COX-2誘導(dǎo)作用具有明確的抑制作用。
對人結(jié)腸癌的抗腫瘤活性研究了通式(I)化合物的抗腫瘤活性，測定它們對人結(jié)腸癌細(xì)胞系TD20和NC59的影響。這兩種細(xì)胞系具有野生型蛋白質(zhì)K-Ras。TD20含有p53抑制基因的突變，而NC59具有p53野生型蛋白質(zhì)。
在37℃和5％CO2下，在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Life Technologies)的DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)這兩種細(xì)胞系。
利用XTT試劑盒(Boehringer-Manheim)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測量細(xì)胞將四唑鹽代謝為甲的能力。
作為通式(I)化合物活性的實(shí)例，實(shí)施例3和10化合物對兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞系都顯示細(xì)胞毒活性。它們對細(xì)胞系NC59的IC50分別為30μM和27μM，對細(xì)胞系TD20的IC50分別為34μM和38μM。
為了獲得對這些化合物的作用機(jī)理的深入認(rèn)識，研究了實(shí)施例3化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系TD20編程性細(xì)胞死亡的能力(劑量100μM)。在這些病癥中，在24小時(shí)后見到20％編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞，在48小時(shí)后見到80％，而在用載體處置的細(xì)胞中，編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞不超過1％。用XTT測量的細(xì)胞毒性水平與編程性細(xì)胞死亡水平相似，提示了實(shí)施例3的細(xì)胞毒活性是由它們誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的能力所引起的。
然后研究了與編程性細(xì)胞死亡過程有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。使NC59細(xì)胞暴露于100μM實(shí)施例3化合物達(dá)5小時(shí)和20小時(shí)后，研究關(guān)于p53、FAK與β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平和MAP激酶、JNK與PKB/Akt的活化水平。結(jié)果證明了除p53、JNK或p38以外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，它們是被常規(guī)基因毒性藥物(例如5-FU)所活化的途徑。
總之可以說，實(shí)施例3和10化合物是對人結(jié)腸癌有效的抗腫瘤劑，這提示了使用通式(I)化合物不僅作為化學(xué)預(yù)防劑、而且用于既定結(jié)腸癌的可能性。另外，它們的抗腫瘤作用受編程性細(xì)胞死亡的介導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化受除p53、JNK或p38以外的信號的影響，這提示了這些化合物可以構(gòu)成目前化療方案的一部分補(bǔ)充，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌募?xì)胞毒作用機(jī)理。
對乳腺癌的抗腫瘤活性研究了通式(I)化合物的抗腫瘤活性，測定它們對乳腺癌細(xì)胞系MDAMB 453的影響。在37℃和5％CO2下，在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Life Technologies)的DMEM培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)該細(xì)胞系。
利用XTT試劑盒(Boehringer-Manheim)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測量細(xì)胞將四唑鹽代謝為甲的能力。
作為通式(I)化合物活性的實(shí)例，實(shí)施例3和10化合物顯示了對乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性，IC50為3μM(實(shí)施例3)和18μM(實(shí)施例10)。
總之可以說，實(shí)施例3和10化合物是對乳腺癌有效的抗腫瘤劑，這提示了使用通式(I)化合物不僅作為化學(xué)預(yù)防劑、而且用于既定乳腺癌的可能性。
抗血管生成活性已經(jīng)研究了這種活性，測定對VEGF表達(dá)的誘導(dǎo)作用的抑制。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)增加已經(jīng)涉及腫瘤進(jìn)展和血管生成。VEGF是一種血管生成前因子，促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂發(fā)生、移行和血管滲透性增加。最近研究已經(jīng)顯示，COX-2能夠調(diào)節(jié)由結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成過程，增加血管生成前因子被所述細(xì)胞表達(dá)。
抑制COX-2可以阻滯這種過程，抑制一些因子的表達(dá)，例如VEGF。
繼而，VEGF也誘導(dǎo)單核細(xì)胞膜、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮中的組織因子(TF)表達(dá)。盡管TF的主要功能是引發(fā)凝血級聯(lián)，不過它也能轉(zhuǎn)導(dǎo)參與與腫瘤有關(guān)的轉(zhuǎn)移和血管生成的細(xì)胞內(nèi)信號。TF使腫瘤的體內(nèi)生長更容易，有利于血管生成。已經(jīng)證明，用TF轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更大的血管形成。
為了研究通式(I)產(chǎn)物的抗血管生成活性，使用被含有人VEGF基因啟動(dòng)子f的載體暫時(shí)轉(zhuǎn)染的Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞系，在基礎(chǔ)的和受刺激的情形中研究VEGF啟動(dòng)子的表達(dá)。一旦建立了試驗(yàn)條件，通過測量啟動(dòng)子的熒光素酶活性，研究所研究的產(chǎn)物抑制VEGF和TF基因表達(dá)的能力。
在試驗(yàn)中，在24孔平板內(nèi)，在500μl DEMEM-10％FCS培養(yǎng)基中使用被t對應(yīng)性DNA暫時(shí)轉(zhuǎn)染的1.25×105Caco-2細(xì)胞。將細(xì)胞用供試化合物預(yù)處理1小時(shí)，然后用TPA刺激16小時(shí)。然后得到細(xì)胞提取物，檢查它們的熒光素酶活性，測定蛋白質(zhì)濃度。
以通式(I)化合物的活性為例，下面提供實(shí)施例3和10化合物所得結(jié)果，顯示具有明確的抗血管生成作用，因?yàn)閂EGF和TF都被抑制了。
對腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種細(xì)胞因子、一種強(qiáng)大的前炎性與免疫調(diào)制劑，參與各種炎性病癥，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、多發(fā)性硬化和與癌癥有關(guān)的惡病質(zhì)，以及與病毒感染有關(guān)的人免疫缺陷。TNF-α之名最初來自它誘導(dǎo)用脂多糖(LPS)處理的動(dòng)物某些腫瘤出血性壞死的能力。它也被稱為惡液質(zhì)素，因?yàn)樗巧婕澳承┘纳x疾病的衰弱綜合征的循環(huán)介質(zhì)。惡病質(zhì)或由TNF導(dǎo)致的衰弱涉及它增加脂蛋白脂酶的性質(zhì)，為此耗盡脂肪細(xì)胞。TNF-α主要是由被多種刺激物活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，例如細(xì)菌或分枝桿菌蛋白、真菌抗原、病毒、C5a補(bǔ)體或γ-干擾素的存在。
TNF-α是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素性休克的介質(zhì)之一，似乎負(fù)責(zé)發(fā)熱、代謝性酸中毒、腹瀉、高血壓、播散性血管內(nèi)凝血，在某些情況下甚至是死亡。另外，TNF-α能夠引起嗜中性白細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)IL-1的基因表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞中的MHC抗原(以I類組織相容性為主)的表達(dá)，參與骨髓的重吸收和滑膜細(xì)胞與人成纖維細(xì)胞的PGE2與膠原酶產(chǎn)生。因而，能夠拮抗這種介質(zhì)活性的產(chǎn)物可能具有臨床價(jià)值，以對抗它們的致命后果(C.A.Mc Intyre等Drugs News and Perspectives19925(4)207-213；A.J.H.Gearing等Nature 1994370555-557；M.A.PahlavaniDrugs of Today 199329(8)525-533)。
已經(jīng)按照P.Klemen等所述方法(Europ.J.Pharmacol.199528169-74)進(jìn)行了對TNF-α的抑制活性研究，測定其中炎癥處于急性期的局部區(qū)域中的TNF-α產(chǎn)生，具體使用小鼠酵母多糖膨脹空氣囊模型。測定在所述囊中產(chǎn)生的炎性滲出物中的TNF-α，作為用酵母多糖刺激的結(jié)果。用ELISA進(jìn)行TNF-α的分析測定。
以通式(I)化合物的活性為例，下面顯示利用實(shí)施例10化合物所得結(jié)果，這顯示了明顯的TNF-α抑制活性，與劑量的相關(guān)性非常良好。
i.p.腹膜內(nèi)
權(quán)利要求
1.通式(I)吡唑啉或它們的生理學(xué)上可接受的鹽之一在藥物制備中的用途 其中R1代表氫原子、甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、羧酸、具有1至4個(gè)碳原子的低級烷基羧酸酯、酰胺或氰基，R2代表氫原子或甲基，R3、R4、R7和R8相同或不同，代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基，R5代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、甲磺?；被酋；蛞阴０被酋；?，R6代表氨基磺酰基或乙酰氨基磺?；錀l件是取代基R5或R6之一是甲磺?；被酋；蛞阴０被酋；?，和其條件是當(dāng)R1代表甲基時(shí)，R2代表氫原子或甲基，R3和R8相同或不同，代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基或三氟甲基，R4代表氫原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基，R5代表氟原子、三氟甲基、三氟甲氧基、甲磺酰基、氨基磺酰基或乙酰氨基磺?；?，R6代表氨基磺?；蛞阴０被酋；?，其條件是取代基R5或R6之一是甲磺?；被酋；蛞阴０被酋；蚏7代表氫原子、氯原子、氟原子、甲基、三氟甲基或甲氧基，該藥物用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物、包括人的細(xì)胞增殖疾病，尤其是用于預(yù)防或治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、腫瘤性血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為能夠從抑制負(fù)責(zé)合成環(huán)加氧酶-2(COX-2)的基因表達(dá)中獲益的過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的通式(I)化合物或它們的生理學(xué)上可接受的鹽之一在藥物制備中的用途，該化合物選自下組[1]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[2]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-甲基-5-苯基-3-三氟甲基-1H-吡唑[3]1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[5]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-苯基-3-三氟甲基-1H-吡唑[8]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-氟苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[11]1-(4-氨基磺?；交?-5-(3，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[13]1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-(2，4-二氯苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[14]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-(2-甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[15]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(3-甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[16]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-(2-氟苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[18]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(3-氟苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[20]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[21]1-(4-氨基磺?；交?-5-(3-氯-4-氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[22]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-3-三氟甲基-5-(4-三氟甲氧基苯基)-1H-吡唑[23]1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，3-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[24]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2，4-二甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[26]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-(4-氟苯基)-3-甲基-1H-吡唑[28]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-3-甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-吡唑[30]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-3-甲基-5-(4-三氟甲基苯基)-1H-吡唑[31]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-苯基-1H-吡唑[34]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸[35]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-苯基-1H-吡唑-3-羧酸[37]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-3-甲基羧酸酯[38]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-苯基-1H-吡唑-3-甲基羧酸酯[40]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-苯基-1H-吡唑-3-羧酰胺[41]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-3-羧酰胺[44]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(3，4-二甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[45]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(3-甲基-4-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[46]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[47]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2-氟-4-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑；[48]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-(2，4-二甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[49]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-氟-2-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[50]1-(4-氨基磺?；交?-3-二氟甲基-4，5-二氫-5-(2，4-二甲基苯基)-1H-吡唑[51]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2，3，4-三氟苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[52]1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-(2-氯-4-氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[53]1-(4-氨基磺酰基苯基)-4，5-二氫-5-(2-氟-4-三氟甲基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[54]1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-[2，4-(雙三氟甲基)苯基]-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[55]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2-甲基-3-氟苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[56]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2-甲基-4-甲氧基苯基)-3-三氟甲基-1H-吡唑[57]1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-3-二氟甲基-4，5-二氫-1H-吡唑[58]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-氟-2-三氟甲基苯基]-3-三氟甲基-1H-吡唑[60]1-(4-氨基磺?；交?-5-(2-氯苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[61]1-(4-氨基磺?；交?-5-(4-氯-2-氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[62]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(4-氟-2-甲基苯基]-3-三氟甲基-1H-吡唑[63]1-(4-氨基磺?；交?-4，5-二氫-5-(2-氟-4-甲基苯基]-3-三氟甲基-1H-吡唑[64]1-(4-乙酰氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[79](+)-1-(4-氨基磺?；交?-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑[80](-)-1-(4-氨基磺酰基苯基)-5-(2，4-二氟苯基)-4，5-二氫-3-三氟甲基-1H-吡唑該藥物用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物、包括人的細(xì)胞增殖疾病，尤其是用于預(yù)防或治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、腫瘤性血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為能夠從抑制負(fù)責(zé)合成環(huán)加氧酶-2(COX-2)的基因表達(dá)中獲益的過程。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的通式(I)化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽之一以及其它常用于治療腫瘤形成的產(chǎn)物——在這種情況下產(chǎn)生協(xié)同性——在藥物制備中的用途，該藥物用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物、包括人的細(xì)胞增殖疾病，尤其是用于預(yù)防或治療腫瘤形成前或腫瘤形成過程、腫瘤性血管生成、惡病質(zhì)和涉及腫瘤壞死因子(TNF)的過程，一般為能夠從抑制負(fù)責(zé)合成環(huán)加氧酶-2(COX-2)的基因表達(dá)中獲益的過程。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)吡唑啉衍生物，其中R
文檔編號A61P27/02GK1698602SQ200510071309
公開日2005年11月23日 申請日期2002年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月6日
發(fā)明者M·R·庫貝雷斯－阿爾蒂森特, J·M·貝羅卡爾－羅梅羅, M·M·孔蒂約赫－洛貝特, J·弗里戈拉－康斯坦薩 申請人:埃斯蒂文博士實(shí)驗(yàn)室股份有限公司