專利名稱：假絲酵母對三七的生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母菌對中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對三七皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經(jīng)過朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的三七皂苷可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科植物，以其干燥的根入藥。三七又稱為山膝、田三七、血參、人參三七。三七用于治療疾病已有悠久的歷史，是我國傳統(tǒng)的中藥。三七中皂苷成分是三七主要的生理活性成分。迄今為止，已從三七的不同部位分離得到60余種單體皂苷成分，這些單體皂苷成分大多數(shù)為達(dá)瑪烷型的20 (S)-原人參二醇型[20 (S) -protopanaxadiol]和 20- (S)原人參三醇型[20 (S)-peotopanaxatriol]。三七根中主要有效成分是達(dá)瑪烷型人參皂苷RbpRgpRcURe和三七特有三七皂苷R1,以及少量的稀有人參皂苷Rg2、Rhlt)其中人參皂苷Rb1和Rg1在天然植物中含量較高，而稀有人參皂苷Rg3、Rh2等含量甚微?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，三七總阜苷(Panaxnotoginoside, PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高機(jī)體免疫力等方面的藥理作用顯著優(yōu)于人參總皂苷，且PNS和部分單體皂苷在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好活性。三七皂苷可通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長或轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化使其逆轉(zhuǎn)、增強(qiáng)和刺激機(jī)體免疫功能等多種方式起到抗腫瘤的作用。三七皂苷包括人參皂苷Rbp Rg1等多種活性單體，具有營養(yǎng)局部皮膚、血管和毛囊組織等功能。有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有明顯的抗氧化、抗衰老功能。已有報道，三七皂苷能促進(jìn)皮膚膠原蛋白合成，具有明顯的抗皮膚衰老作用(王麗紅，吳鐵，吳志華，等.人參皂苷抗皮膚衰老作用實驗研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2003，19 (I):25-27.)。某些在三七中含量極低的三七皂苷被稱為次級人參皂苷或稀有人參皂苷。天然的皂苷并不一定是生理活性最高的分子結(jié)構(gòu)，藥理學(xué)研究表明，稀有人參皂苷(如Rh、Rh2, Rg3等)藥效尤為珍貴(李學(xué)哲，樸惠順.人參皂苷Rh2含量測定方法及藥理作用研究現(xiàn)狀.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報,2009,32(2):153-156.；ffang CZ, Xie JT, Fishbein A, etal.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng onSW480human colorectal cancer cells.Phytother Res，2009，23 (I) 6-13)。這些成分在某些難治性疾病如腫瘤治療方面顯示獨特的療效。對皂苷活性的研究還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷的抗腫瘤活性與皂苷糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)系為:苷元>單糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖苷(Don DQ，Jin L，Chen YJ.Advances and prospects of the study on chemical constituents andpharmacological activities of panax ginseng.J Shenyang Pharm Univ，1999，16 (2):151-156;竇德強(qiáng)，靳玲，陳英杰.人參的化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展與展望.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，1999，16 (2):151-156)。稀有人參皂苷1^3是從紅參(栽培人參經(jīng)曬干或烘干再蒸制而成)中微量提取的，其提取率僅為0.003%，人參皂苷Rg3可直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導(dǎo)其分化使其逆轉(zhuǎn)。(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫(yī)結(jié)合雜志2007年增刊，2007，235-236)。以人參皂苷Rg3為主要成分的抗癌新藥參一膠囊已獲國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的中藥一類新藥證書。人參皂苷Rh 2屬微量成分，僅占人參總皂苷含量的萬分之二。人參皂苷Rh 2是一種抗腫瘤天然植物成分，也可由人參皂苷Rg3降解得到。對小鼠的肺癌細(xì)胞、B16黑色素瘤細(xì)胞、大鼠Morris肝癌細(xì)胞的增殖具有明顯的特異性抑瘤作用，是配合放療、化療增效減毒的首選藥物(陳業(yè)高，黃榮，桂世鴻，等，三七葉苷制備抗癌活性成分20 (R)-人參皂苷-Rh2和人參皂苷Rg 3，化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16 (I):69-70 ;蔣磊，趙壽經(jīng)，梁彥龍，李軍華，HPLC法測定酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷Rh 2的含量，特產(chǎn)研究，2004，I，41-44)。由于次級人參皂苷含量極低，故很難通過傳統(tǒng)的提取方法得到。但如果對天然皂苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向的改變，就會得到生理活性更高、應(yīng)用價值更大稀有皂苷。通常是先從三七提取含量豐富的人參皂苷，然后再將提取得到的人參皂苷降解，由此獲得稀有的次級人參皂苷。人參皂苷的降解就是將人參皂苷分子上的部分或全部糖基水解，得到含糖基較少的次級人參皂苷或皂苷元。常規(guī)使用的人參皂苷降解方法包括酸降解法、堿降解法和酶降解法等。本發(fā)明提供了一種用于將三七中人參皂苷轉(zhuǎn)化為次級人參皂苷或者稀有人參皂苷的微生物學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用本發(fā)明的方法可以有效地改變皂苷的糖鏈結(jié)構(gòu)，獲得較大量的稀有人參皂苷，因此本發(fā)明的方法具有重要科研意義和產(chǎn)業(yè)上的巨大價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及利用酵母菌對`中藥三七之主要成分人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化，特別涉及利用朗比可假絲酵母對三七中人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。三七皂苷各種單體的分離純化和藥理活性的研究發(fā)現(xiàn)，許多稀有皂苷、特別是許多天然來源有限的人參皂苷，例如人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷生理活性更高、應(yīng)用價值更大，具有很好的開發(fā)前景。對多種稀有皂苷獲得方法的比較研究可以發(fā)現(xiàn)，微生物轉(zhuǎn)化方法獲得的稀有皂苷具有很多特有的優(yōu)點。本發(fā)明的目的是利用酵母菌對中藥三七中的人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化，以獲得具有更高活性的稀有皂苷。其中所說的酵母菌是假絲酵母，特別是朗比可假絲酵母(AS2.1763，Candida lambica,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC,中國北京)。一般說來，制備酵母菌轉(zhuǎn)化三七中人參皂苷的轉(zhuǎn)化物，通常采用粉碎技術(shù)將三七粉碎，過100目網(wǎng)篩，可使三七的轉(zhuǎn)化濃度為轉(zhuǎn)化總體積的2.5% 7.5% (重量/體積)?？梢栽谝呀?jīng)粉碎的三七粉0100目)中加入適量飲用水，浸泡I 3小時后，然后于大約115 121°C滅菌40分鐘，即得到繼后用于酵母菌轉(zhuǎn)化三七的底物。當(dāng)按上述方法制備的用于酵母菌轉(zhuǎn)化的三七底物滅菌后，溫度降至30°C左右時，接種預(yù)培養(yǎng)的朗比可假絲酵母菌液(占轉(zhuǎn)化總體積的20% 50%，體積/體積)，于大約25°C 35°C培養(yǎng)2 6天。三七加入朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的溫度一般是25°C 35°C，搖床培養(yǎng)或者發(fā)酵罐
好氧培養(yǎng)。為了篩選出朗比可假絲酵母對三七中人參皂苷的最佳轉(zhuǎn)化條件，我們利用正交試驗(三因素三水平)方法，采用薄層色譜法(中國藥典2010版一部附錄VIB)以稀有人參皂苷Rg3峰面積為指標(biāo)，結(jié)果顯示，三七濃度為轉(zhuǎn)化總體積的5% (重量/體積)接種量占轉(zhuǎn)化總體積的50% (體積/體積)、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化時間為96小時條件下，假絲酵母轉(zhuǎn)化三七皂苷的稀有人參皂苷Rg3含量最高。朗比可假絲 酵母對三七中人參皂苷的轉(zhuǎn)化正交試驗的薄層色譜圖參見附圖1。利用分光光度法(保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范:保健食品中總皂苷的測定)檢測了朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化前后三七總皂苷的變化，其含量提高了 66.10%。假絲酵母轉(zhuǎn)化前后三七總皂苷的變化薄層色譜圖參見附圖2。我們的實驗研究表明，經(jīng)過利用本發(fā)明的方法生物轉(zhuǎn)化的三七，明顯地增加了三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3等稀有人參皂苷的含量。經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化的三七可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。某些在三七中含量極低的人參皂苷即次級人參皂苷或稀有人參皂苷，具有很強(qiáng)的藥理活性。例如稀有人參皂苷Rg3可直接作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，抑制腫瘤的生長或誘導(dǎo)其分化使其逆轉(zhuǎn)。人參皂苷Rg3還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)作用(余新建，20 (R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤活性研究近況，世界中西醫(yī)結(jié)合雜志2007年增刊，2007，235-236)。本發(fā)明的意義在于為中藥三七的轉(zhuǎn)化提供了一種新的、簡便易行的微生物學(xué)方法，和用于轉(zhuǎn)化的無害微生物。從而，為中藥三七在更廣泛的領(lǐng)域內(nèi)更有效地利用提供了前提條件。


附圖1是實施例1的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉(zhuǎn)化正交試驗的結(jié)果。從圖中可以看出，三七經(jīng)過朗比可假絲酵母的轉(zhuǎn)化后，稀有皂苷斑點明顯增力口。其中上面的圖是日光下的觀察結(jié)果；下面的圖是365nm熒光下觀察結(jié)果。圖中O為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)前的樣品；1 9為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)后的樣品；S為RbpRejgpRg^Rh2對照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。附圖2是實施例2的色譜圖。顯示中藥三七在使用朗比可假絲酵母生物轉(zhuǎn)化(加朗比可假絲酵母發(fā)酵)前和后，三七皂苷薄層色譜圖的變化。色譜圖顯示，三七中的稀有皂苷斑點明顯增加。其中左邊的圖是日光下的觀察結(jié)果；右邊的圖是365nm熒光下觀察結(jié)果。圖中O為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)前的樣品；1為發(fā)酵(轉(zhuǎn)化)后的樣品JSRbpRhRgpRg^Rhji照樣品。展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15: 40: 22: 10)。
具體實施例方式實施例1:三七轉(zhuǎn)化濃度、轉(zhuǎn)化時間、接種量轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化效果的影響利用正交試驗，設(shè)計了三個因素包括發(fā)酵轉(zhuǎn)化時間、三七的轉(zhuǎn)化濃度和朗比可假絲酵母的接種量，每個因素取三個水平(具體參見表I)。取干燥的三七，粉碎后，過100目篩，根據(jù)正交試驗的設(shè)計組合的9個樣品，稱量如表I所示不同重量的三七粉。各樣品加適量飲用水浸泡3小時后，115°C、40分鐘滅菌。得到不同濃度的三七轉(zhuǎn)化底物，當(dāng)溫度降至30°C左右時，按照表I中的接種量，接入預(yù)培養(yǎng)的朗比可假絲酵母菌液，30°C搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速IOrpm。不同轉(zhuǎn)化時間、不同的三七轉(zhuǎn)化濃度和不同朗比可假絲酵母接種量的各實驗樣品稀有人參皂苷Rg3峰面積的數(shù)值參見表2。表I轉(zhuǎn)化因素水平表
權(quán)利要求
1.利用假絲酵母對三七皂苷的進(jìn)行生物學(xué)轉(zhuǎn)化，以獲得具有更高含量次級或稀有人參皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法包括首先將三七粉碎，過100目網(wǎng)篩后，在已經(jīng)粉碎的三七粉中加入適量的飲用水，浸泡I 3小時后，然后于大約115°C 121°C滅菌40分鐘，即得到用于假絲酵母菌轉(zhuǎn)化三七的底物，當(dāng)三七底物的溫度降至30°C左右時，接種預(yù)培養(yǎng)的假絲酵母菌轉(zhuǎn)化三七中人參皂苷，于25V 35°C下培養(yǎng)2 6天，以完成三七人參皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的假絲酵母是朗比可假絲酵母菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的發(fā)酵培養(yǎng)是搖床培養(yǎng)或者發(fā)酵罐好氧培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的被轉(zhuǎn)化的三七中稀有人參皂苷可用于生產(chǎn)醫(yī)藥、保健品和化妝品的 原料。
全文摘要
本發(fā)明涉及酵母菌對中藥三七之主要成分三七皂苷的生物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用假絲酵母，特別是利用朗比可假絲酵母對三七皂苷的生物學(xué)轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)過酵母菌的轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的含量，特別是人參皂苷Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量得以顯著增加。經(jīng)過朗比可假絲酵母轉(zhuǎn)化的三七皂苷可作為原料，用于醫(yī)藥、保健品或者化妝品的生產(chǎn)。
文檔編號A61P25/00GK103099832SQ20111035293
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青 申請人:馮淑琴, 馮淑霞, 馮淑青