專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
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小檗胺是從我國(guó)中草藥 小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，小檗胺及其衍生物具有免疫調(diào)節(jié)，對(duì)抗心肌、腦、腎缺血，抗高血壓，抗肝、肺纖維化，降低門(mén)靜脈高壓，抗缺氧性肺動(dòng)脈高壓等多種生理活性。同時(shí)具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、不良反應(yīng)小且長(zhǎng)期毒性低的特點(diǎn)。目前僅有小檗胺片劑上市，用于改善放、化療后的白細(xì)胞減少癥狀，其臨床升白有效率高達(dá)91.3%，相關(guān)作用機(jī)制可能在于提高造血干細(xì)胞集落因子的含量，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞和粒祖細(xì)胞的增殖并向粒系細(xì)胞分化(朱燦陽(yáng).小檗胺藥理作用分析[J]中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2005，5(1):109-110)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺類(lèi)藥物對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞在體外有明顯的增殖抑制作用，例如白血病細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、腹水癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、骨髓瘤、前列腺癌、人鼻咽癌、黑色素瘤細(xì)胞和腦惡性膠質(zhì)瘤，而且它們對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。這種高效低毒的潛在優(yōu)勢(shì)使其逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小檗胺類(lèi)藥物抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，預(yù)防惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制如下:(I)通過(guò)減小線粒體的跨膜電勢(shì)、激活細(xì)胞凋亡蛋白酶、抑制分子伴侶熱休克蛋白90、上調(diào)bax/bcl-2比值,下調(diào)bcr/abl基因、降低survivin基因和/或p210的的表達(dá)水平等調(diào)控介導(dǎo)方式；(2)抑制鈣調(diào)蛋白的活性；(3)抑制端粒酶和端粒的結(jié)合等(1、朱燦陽(yáng).小檗胺藥理作用分析[J]中國(guó)熱帶醫(yī)，2005，5(1):109-110 ;2、吳東.小檗胺抗白血病作用及其機(jī)制的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[D]浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2003 ;3、WANG Guan-yu, HANGJia-wei, Li) Qing-hua et al.Berbamine induces apoptosis in human hepatoma cellline SMMC7721 by loss in mitochondrial transmembrane potential and caspaseactivation [J] Zhejiang Univ Sci B, 2007 8 (4): 248-255 ;4、張金紅，毛啟龍，許乃寒等.小檗胺衍生物EBB體內(nèi)抗腫瘤作用初探[J].中草藥，1998，29(4):243-246 ； 5、張金紅，耿朝暉，段江燕等.小檗胺及其衍生物的結(jié)構(gòu)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響[J]南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))1995，9(2) 159-160 ;6、韓艷秋，武淑蘭.小檗胺下調(diào)MCF7及MCF7/ADR細(xì)胞Suivivin表達(dá)[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2005，7 (5):610-611 ;7、朱陵君.小檗胺與紫杉醇納米微球的構(gòu)建及其體外協(xié)同抑瘤效應(yīng)評(píng)價(jià)[D].南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文，2009 ;8、梁贊.小檗胺和小檗胺衍生物抗骨髓瘤細(xì)胞增殖及其機(jī)制的研究[D].浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2010 ;9、張金紅，段江燕，耿朝暉等.小檗胺及其衍生物對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響[J].《中草藥》1997，28 (8):483-485 ; 10、趙勇.小檗胺誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究[D].山東大學(xué)博士學(xué)位論文，2006 ;11、唐亞林，徐筱杰，李騫等.雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿的新用途101371839A [P], 2009-2-25)。多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是腫瘤化學(xué)治療面臨的一大障礙,系指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物耐藥的同時(shí)也對(duì)同此藥物結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)、作用機(jī)制不同的其它藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。目前嘗試的逆轉(zhuǎn)耐藥措施主要是開(kāi)發(fā)針對(duì)P-糖蛋白等耐藥相關(guān)因子的化療增敏劑。體外研究發(fā)現(xiàn)某些化合物，如維拉帕米、環(huán)孢菌素A等，均可逆轉(zhuǎn)MDR，但由于其嚴(yán)重的心血管不良反應(yīng)、免疫抑制及腎毒性，以及作用靶點(diǎn)單一、選擇性低、可能導(dǎo)致抗腫瘤藥毒副作用加劇等問(wèn)題，致使臨床應(yīng)用受到限制。因此，尋找更安全有效的多藥抗藥逆轉(zhuǎn)劑具有重要的臨床意義。近年的研究表明，小檗胺及其衍生物是一類(lèi)高效低毒的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，同時(shí)具有放療增敏，減輕放、化療毒性反應(yīng)等作用。其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)多藥耐藥基因致使pl70蛋白合成減少或直接抑制pl70蛋白，減少藥物外排，增加細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度而產(chǎn)生作用。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)小檗胺與抗腫瘤藥物如阿霉素、表阿霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、伊馬替尼等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)它們的多藥耐藥性，發(fā)揮協(xié)同增效作用并降低藥物劑量限制性毒性(1、韓艷秋，武淑蘭.小檗胺下調(diào)MCF7 及 MCF7/ADR 細(xì)胞 Suivivin 表達(dá)[J].中國(guó)醫(yī)師雜志，2005，7 (5):610-611 ;2、韓艷秋，袁家穎，石永進(jìn)等.小檗胺逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥性及其機(jī)制[J].《中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志》2003，11(6):604-608 ;3、韓艷秋，袁家穎，石永進(jìn)等.小檗胺逆轉(zhuǎn)MCF7 /ADR細(xì)胞耐藥性及其機(jī)制探討[J].《解剖學(xué)報(bào)》2004，35 (2):161-164 ;4、田暉，潘啟超.雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿粉防己堿與小檗胺逆轉(zhuǎn)多藥抗藥性的比較研究[J].《藥學(xué)學(xué)報(bào)》1997，32
(4):245-250 ;5、董慶華，鄭樹(shù)，徐榮臻.小檗胺對(duì)多藥耐藥K562/ Adr細(xì)胞作用的研究[J].《中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志》2004，24(9):820-822 ;6、張蕾 小檗胺對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562格列衛(wèi)耐藥細(xì)胞株K562/G01細(xì)胞增殖抑制作用及其機(jī)制研究[M]浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008 ;7、魏艷淋.小檗胺對(duì)耐藥的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的體內(nèi)外作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D]浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2009 ;8、齊淑玲，劉杰文，付津.鈣調(diào)素拮抗劑EBB逆轉(zhuǎn)K562/VCR細(xì)胞系多藥耐藥性的研究[J]《實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志》1996，4 (3):294-298 ;9、趙攀.小檗胺與STI571單獨(dú)及聯(lián)合作用誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的研究[M]鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006 ;10、朱陵君.小檗胺與紫杉醇納米微球的構(gòu)建及其體外協(xié)同抑瘤效應(yīng)評(píng)價(jià)[D]京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)。
(0005)綜上可見(jiàn)，小檗胺類(lèi)藥物用于腫瘤的治療前景廣闊，其高效低毒、多作用靶向的優(yōu)點(diǎn)賦予它躋身為化療一線藥物的潛力。但目前小檗胺僅 用于化療后的升白，其主要原因在于此類(lèi)藥物的體內(nèi)抗腫瘤活性不理想，這種體內(nèi)/外間藥效的巨大差別可能源于它們較短的血液循環(huán)半衰期和在肝、腎、肺、脾等器官的集中分布，從而難以發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，開(kāi)發(fā)小檗胺類(lèi)藥物的緩控釋制劑或靶向制劑對(duì)于提高其體內(nèi)抗腫瘤效果、實(shí)現(xiàn)與其他靶向抗腫瘤藥物的聯(lián)合應(yīng)用意義重大。脂質(zhì)體，特別是聚乙二醇脂質(zhì)衍生物修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(又稱(chēng)為PEG化脂質(zhì)體)尤為適合作為靶向藥物載體，并已有Doxil 等極為成功的案例。若將小檗胺類(lèi)藥物也制備為PEG化脂質(zhì)體，則其和同樣裝載于PEG化脂質(zhì)體中的化療藥物均能借助 EPR (enhanced permeability and retention effect)效應(yīng)蓄積于腫瘤組織，并發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。此外，脂質(zhì)體作為藥物載體還具有諸多優(yōu)點(diǎn):(I)脂質(zhì)體的主要成分是磷脂和膽固醇，具有生物相容性，可生物降解、無(wú)毒性和低免疫原性；(2)脂質(zhì)體的大小、磷脂成分、表面電荷等有很大的選擇空間；(3)脂質(zhì)體能包裹親水性和親脂性藥物，將藥物包封入脂質(zhì)體中，可保護(hù)藥物在體內(nèi)不被降解，同時(shí)避免藥物對(duì)受體識(shí)別配體的干擾；(4)易獲得適宜的藥物-載體比，制備簡(jiǎn)單；(5)脂質(zhì)體可提高藥物的療效并降低其毒副作用；
(6)與固體聚合物載體系統(tǒng)(如微粒、納米粒)不同，脂質(zhì)膜具有較好的柔性，允許表面結(jié)合的靶向分子有更大的自由度，因此靶向分子能以最優(yōu)構(gòu)型與靶部位受體結(jié)合；(7)脂質(zhì)體可為所包裹藥物的靶向性提供了新的可能，包括細(xì)胞外釋放、細(xì)胞膜融合和內(nèi)吞，提高了藥物的靶向范圍；(8)脂質(zhì)體與藥物間無(wú)共價(jià)鍵連接，利于藥物在溶酶體內(nèi)釋放；(9)在載藥脂質(zhì)體表面結(jié)合不同的配基如抗體、糖酯等可將藥物遞送到特定靶組織和靶細(xì)胞；(10)脂質(zhì)體適合多種途徑給藥。除商業(yè)化可獲得的片劑之外，目前關(guān)于小檗胺類(lèi)藥物的制劑專(zhuān)利中僅有殼聚糖-瓊脂納米粒(201010603372.5)，但試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示其僅能提升藥物的體外藥效。此外，未見(jiàn)此類(lèi)藥物的脂質(zhì)體專(zhuān)利或文獻(xiàn)。我們將小檗胺類(lèi)藥物制備成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，以期提高藥物的體內(nèi)抗腫瘤活性，或在與其他化療藥物合用時(shí)體現(xiàn)出協(xié)同增效，降低毒副作用的效用。發(fā)明內(nèi)容:
本發(fā)明的目的是提供一種載有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體的處方，同時(shí)提供一種簡(jiǎn)單易行、質(zhì)量可控，便于工業(yè)化生產(chǎn)的脂質(zhì)體制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種載有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體的處方組成: 一種小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體，其含有小檗胺類(lèi)藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質(zhì)衍生物和
建立梯度物質(zhì)；其中藥物和磷脂的質(zhì)量比為1:5 1:100，優(yōu)選為l:l(Tl:20，最優(yōu)選為1:10 ;膽固醇和磷脂的質(zhì)量比為1:2 1:4，優(yōu)選為1:3 ;親水性脂質(zhì)衍生物與磷脂的質(zhì)量比為1:2 1:6。

此處所述的小檗胺類(lèi)藥物為小檗胺、0-乙基-小檗胺、0- 丁基-小檗胺、0-辛基-小檗胺、0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺、0-苯基-小檗胺、0-乙?；?小檗胺或0-丹磺?；￠薨返柠}酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、草酸鹽、重酒石酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或幾種。作為優(yōu)選，選擇鹽酸小檗胺、0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽、0-丹磺酰基小檗胺的鹽酸鹽。小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體處方中的磷脂可以是天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂或它們的衍生物及上述物質(zhì)氫化產(chǎn)物中的一種或多種，包括大豆卵磷脂(SPC)、蛋黃卵磷脂(EPC)、氫化大豆卵磷脂(HSPC)、氫化蛋黃卵磷脂(HEPC)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)及其鈉鹽或磷脂酰肌醇(PI)、心磷脂(雙磷脂酰甘油，cardiolipin)、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)等中的一種或多種的組
八
口 o磷脂酰膽堿選自但不限于二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、硬脂酰油酰磷脂酰膽堿、硬脂酰亞油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、棕櫚酰亞油酰磷脂酰膽堿、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、二癸酰磷脂酰膽堿、二辛酰磷脂酰膽堿、二己酰磷脂酰膽堿或硬脂?；ㄉ南Ａ字Ｄ憠A等中的一種或多種。磷脂酰乙醇胺選自但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、硬脂酰油酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰亞油酰磷脂酰乙醇胺、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕櫚酰亞油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二癸酰磷脂酰乙醇胺、二辛酰磷脂酰乙醇胺或二己酰磷脂酰乙醇胺等中的一種或多種
磷脂酰甘油及其鈉鹽選自但不限于二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)及其鈉鹽、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)及其鈉鹽、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)及其鈉鹽、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油(DMPG)及其鈉鹽、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二癸酰磷脂酰甘油、二辛酰磷脂酰甘油、二己酰磷脂酰甘油、雙二硬脂酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二棕櫚酰磷脂酰甘油及其鈉鹽、雙二肉豆蘧酰磷脂酰甘油及其鈉鹽或雙二月桂酰磷脂酰甘油等中的一種或多種。磷脂酰肌醇選自但不限于二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二油酰磷脂酰肌醇(DOPI)、二肉豆蘧酰磷脂酰肌醇(DMPI)或二月桂酰磷脂酰肌醇(DLPI)等中的一種或多種。作為優(yōu)選，本發(fā)明中的磷脂使用SPC、EPC、HEPC, HSPC, DSPC、DPPC, DSPE, DPPE 或DSPG中的一種或多種。本發(fā)明中所述的親水性脂質(zhì)衍生物選自聚乙二醇與磷脂或聚乙二醇與膽固醇連接所得的聚乙二醇脂質(zhì)衍生物、吐溫80、吐溫20、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)或神經(jīng)節(jié)苷脂中的一種或多種。聚乙二醇脂質(zhì)衍生物選自但不限于聚乙二醇-留醇類(lèi)衍生物如聚乙二醇-膽固醇、聚乙二醇-膽固醇琥珀酸酯(PEG-CHEMS)、聚乙二醇-膽固醇碳酸甲酯等，聚乙二醇-磷脂類(lèi)衍生物如聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺等，聚乙二醇-二酸甘油酯或單酯如聚乙二醇-二硬脂酰甘油、聚乙二醇-二棕櫚酰甘油、聚乙二醇-二肉豆蘧酰甘油等，聚乙二醇-脂肪酸或脂肪酸酯衍生物等如聚乙二醇-硬脂酸、聚乙二醇-棕櫚酸、芐澤、賣(mài)澤等中的一種或多種，其中聚乙二醇的分子量為10(T10000，PEG與脂質(zhì)部分的連接鍵為但不限于二硫鍵、酯鍵、釀鍵、酸胺鍵等，PEG端基為但不限于輕基、竣基、氣基或含氣基團(tuán)、燒氧基等。作為優(yōu)選，親水性脂質(zhì)衍生物選自PEG-DSPE、PEG-CHEMS、TPGS、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)或吐溫80中的一種或多種。
親水性脂質(zhì)衍生物，特別是聚乙二醇脂質(zhì)衍生物修飾脂質(zhì)體時(shí)，親水鏈(以PEG鏈為代表)在膜表面形成的水化層可以阻止脂質(zhì)體之間的相互融合聚集，降低脂質(zhì)體粒徑的同時(shí)使粒徑分布趨向均一；而且PEG層的脫水作用使磷脂分子排列的更加緊密，增加藥物在脂質(zhì)體內(nèi)水相的滯留穩(wěn)定性，提高脂質(zhì)體的物理化學(xué)穩(wěn)定性；PEG層的空間位阻效應(yīng)亦可減弱血漿成分對(duì)脂質(zhì)體的破壞或識(shí)別與吸附作用，降低單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的攝取量，延長(zhǎng)載藥脂質(zhì)體的血液循環(huán)半衰期，提高腫瘤靶向效率，增強(qiáng)藥物療效并降低其毒副作用(AGabizonj D Gorenj AT Horowitz.Long-circulating liposomes for drug delivery incancer therapy:a review of biodistribution studies in tumor-bearing animals[J].Advanced Drug elivery Review.1997, 24(17):337-344) 0 但是當(dāng)聚乙二醇-脂質(zhì)衍生物的濃度較大時(shí)，脂質(zhì)體內(nèi)外膜表面致密的PEG層可能影響藥物的包封速度和程度，同時(shí)PEG分子間的相互作用可能在一定程度上限制了 PEG分子的高柔順性而影響其長(zhǎng)循環(huán)特性，甚至有可能破壞磷脂雙分子層的穩(wěn)定性(DE.0wens, N.Peppas.0psonization,biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles [J].1nt JPharm 2006, 307: 93-102)。所以親水性脂質(zhì)衍生物在脂質(zhì)體表面的修飾比例對(duì)制劑的體內(nèi)療效和穩(wěn)定性影響重大。
作為優(yōu)選方案，所述親水性脂質(zhì)衍生物和磷脂的質(zhì)量比為1: 2^1: 6，此時(shí)脂質(zhì)體的粒徑較小且粒度分布均勻，包封率高達(dá)90%以上，制劑穩(wěn)定性良好。本發(fā)明中所述建立梯度物質(zhì)選自乙二胺四乙酸銨、硫酸銨、乙二胺四乙酸三乙胺、乙二胺四乙酸二乙胺、乙二胺四乙酸乙醇胺或枸櫞酸銨；優(yōu)選為乙二胺四乙酸銨或硫酸銨。脂質(zhì)體中的膽固醇具有雙向調(diào)節(jié)磷脂雙分子層流動(dòng)性的作用，因此磷脂和膽固醇的比例會(huì)顯著影響脂質(zhì)體的膜穩(wěn)定性和藥物的裝載速度與程度。Patel等發(fā)現(xiàn)增加脂質(zhì)體中膽固醇的含量可顯著降低肝臟的攝取，并提高骨髓的攝取(Harish M.Patel, Nilden
S.Tuzel, Brenda E.Ryman.1nhibitory effect of cholesterol on the uptake ofliposomes by liver and spleen.Biochim Biophys Acta，1983，761:142-151.)。作為優(yōu)選方案，小檗胺類(lèi)藥物的處方組成中膽固醇和磷脂的質(zhì)量比為1:2 1:4，此時(shí)脂質(zhì)體的粒徑較小且粒度分布均勻，包封率高達(dá)90%以上，制劑穩(wěn)定性良好。本發(fā)明的小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體中還可以含有生育酚及其衍生物、蔗糖、木糖醇、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇中的一種或多種。本發(fā)明所述的小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體的制備工藝，包括以下步驟:
(a)將建立梯度物質(zhì)配制為0.1(T0.30 mo I/L的水溶液，即水化介質(zhì)，將水化介質(zhì)加熱至50飛5 °C保溫待用；作為優(yōu)選，水化介質(zhì)中建立梯度物質(zhì)的濃度選擇為0.15、.25 mol/L ;作為最優(yōu)選，水化介質(zhì)中建立梯度物質(zhì)的濃度選擇為0.20 mol/L ;同時(shí),水化介質(zhì)的pH在5.5^7.5間均能獲得良好的載藥結(jié)果；
(b)以適量乙醇于5(T651:下將磷脂、膽固醇、親水性脂質(zhì)衍生物以及可以選擇性加入的生育酚及其衍生物溶解，之后揮除乙醇，加入步驟(a)的水化介質(zhì)，攪拌分散，得到脂質(zhì)體初品，其中磷脂濃度為KTlOO g/L ；
(c)將脂質(zhì)體初品過(guò)微射流儀、過(guò)擠出儀或通過(guò)探頭超聲降低粒徑，得空白脂質(zhì)體；作為優(yōu)選方案，特別是用于工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，選擇過(guò)微射流儀或過(guò)擠出儀的方式降低脂質(zhì)體的粒徑，探頭超聲的方式適合于小批量的實(shí)驗(yàn)室研究；
(d)使用透析、切向流過(guò)濾、凝膠過(guò)濾或離子交換劑處理的方法處理空白脂質(zhì)體，得到梯度脂質(zhì)體；作為優(yōu)選的方案，使用切向流過(guò)濾或離子交換劑處理空白脂質(zhì)體，以獲得梯度脂質(zhì)體；這里所述的切向流設(shè)備如中空纖維透析器(膜孔徑30KD，大連化學(xué)物理研究所)，或是A/G Technology公司的中空纖維膜組件UFP-30-C-6A，30000NM, 4800 cm2 ;而離子交換劑處理是指使用離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維、離子交換膜或電滲析裝置(EDI)將脂質(zhì)體外水相的離子或分子除去。(e)將小檗胺類(lèi)藥物溶液與梯度脂質(zhì)體混合，于50 65°C孵育1(T30 min，得到含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑。由于工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中各項(xiàng)參數(shù)出現(xiàn)±10%的波動(dòng)是難以避免的，所以在本專(zhuān)利所述的處方組成和工藝參數(shù)的上限值或下限值的±10%范圍內(nèi)仍將認(rèn)為是本專(zhuān)利的保護(hù)范圍。本發(fā)明的小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體可以制成注射液、凍干粉針劑或其它劑型如但不限于口服液、膠囊劑 、氣霧劑、滴鼻劑、凝膠劑。
部分實(shí)施例中采用陰陽(yáng)混合離子交換樹(shù)脂或交換纖維微柱離心法建立離子梯度，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、操作方便、脂質(zhì)體體積變化小等優(yōu)點(diǎn)。所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂選自含強(qiáng)酸性反應(yīng)基團(tuán)如磺酸基-SO3H的強(qiáng)酸型樹(shù)脂、含較弱反應(yīng)基團(tuán)如羧基-COOH或酚羥基-OH的弱酸型樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂中的一種。所述陰離子交換樹(shù)脂選自含較強(qiáng)反應(yīng)基團(tuán)如具有四面體銨鹽官能基團(tuán)之一一 N+(CH3)3的強(qiáng)堿型樹(shù)脂、含弱酸性基團(tuán)如羧基-COOH的弱堿型樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂中的一種，兩者的體積比為0.r2.5。作為優(yōu)選方案，選擇強(qiáng)酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如國(guó)產(chǎn)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂與強(qiáng)堿型的陰離子交換樹(shù)脂如國(guó)產(chǎn)717型陰離子交換樹(shù)脂混合除鹽建立脂質(zhì)體內(nèi)外水相的離子跨膜梯度，兩者的體積比為0.2 2。本發(fā)明帶來(lái)的有益結(jié)果
制備方法切實(shí)可行、質(zhì)量可控，便于工業(yè)化生產(chǎn)；
所得小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體的粒徑小且分布均一、包封率高、穩(wěn)定性良好； 將小檗胺類(lèi)藥物制備為脂質(zhì)體后可有效延長(zhǎng)藥物的血液循環(huán)時(shí)間，提高腫瘤組織的靶向效率，增強(qiáng)藥物體內(nèi)抗腫瘤效果，或在與其他化療藥物合用時(shí)發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)及降毒并提高機(jī)體免疫力。
具體實(shí)施方式
:
所用各成分的簡(jiǎn)稱(chēng)如下:
HSPC:氫化大豆卵磷脂 DSPC: 二硬脂酰磷脂酰膽堿 EPC:蛋黃卵磷脂 SPC:大豆卵磷脂 CHOL:膽固醇
mPEG2_-CHEMS:聚乙二醇單甲醚(2000)-膽固醇琥珀酸酯 mPEG2_-DSPE:聚乙二醇單甲醚(2000)- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (NH4)2SO4:硫酸銨 NH4EDTA:乙二胺四乙酸銨
鹽酸小檗胺購(gòu)買(mǎi)自成都龍泉高科天然藥業(yè)有限公司，純度約為96.2%。0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽和0-丹磺?；￠薨符}酸鹽按照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行合成及表征(謝進(jìn)文，浙江大學(xué)博士論文，2009，吲哚啉-2-酮和小檗胺衍生物的設(shè)計(jì)、合成及其生物活性研究)，兩者純度均約為95%。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但這些實(shí)施例不能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書(shū)所限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上的改動(dòng)都是本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中的水化介質(zhì)為乙二胺四乙酸銨溶液、乙二胺四乙酸三乙胺溶液、乙二胺四乙酸二乙胺溶液或乙二胺四乙酸乙醇胺溶液時(shí)，水化介質(zhì)的濃度代表其中乙二胺四乙酸根的濃度，水化介質(zhì)的PH值通過(guò)其中加入的氨水、三乙胺、二乙胺或乙醇胺的量進(jìn)行控制。本發(fā)明的部分實(shí)施例采用離子交換的方法建立脂質(zhì)體的跨膜梯度，具體實(shí)施手段是采用陰陽(yáng)混合離子交換樹(shù)脂或交換纖維微柱離心法建立離子梯度，此方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、操作方便、脂質(zhì)體體積變化小等優(yōu)點(diǎn)。所用的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂選自含強(qiáng)酸性反應(yīng)基團(tuán)如磺酸基-SO3H的強(qiáng)酸型樹(shù)脂、含較弱反應(yīng)基團(tuán)如羧基-COOH或酚羥基-OH的弱酸型樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂中的一種。所用的陰離子交換樹(shù)脂選自含較強(qiáng)反應(yīng)基團(tuán)如具有四面體銨鹽官能基團(tuán)之一一 N+(CH3)3的強(qiáng)堿型樹(shù)脂、含弱酸性基團(tuán)如羧基-COOH的弱堿型樹(shù)脂或大孔樹(shù)脂中的一種。在某些具體方案中，選擇強(qiáng)酸型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如國(guó)產(chǎn)732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂與強(qiáng)堿型的陰離子交換樹(shù)脂如國(guó)產(chǎn)717型陰離子交換樹(shù)脂混合除鹽建立脂質(zhì)體內(nèi)外水相的離子跨膜梯度。本發(fā)明中小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法如下:
取已制備好的小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體100 μ L各兩份。一份加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的Tween-80或Triton X-100溶液破乳(檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm)，用流動(dòng)相稀釋至10 mL，或直接用甲醇破乳并稀釋定容至10 mL(檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm)，搖勻，以HPLC法測(cè)定峰面積，計(jì)算總藥量(CtJ。另一份上樣于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱(使用732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或ZB-1陽(yáng)離子交換纖維，柱高均約為1.5 cm), 2000 r.mirT1離心4 min ;繼續(xù)加400 μ L重蒸水于柱的頂端，2000 r.mirT1離心4 min洗脫，連續(xù)操作4次，合并洗脫液，加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的Tween-80或Triton X-100溶液破乳(檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm)，用流動(dòng)相稀釋至10 mL，或直接用甲醇破乳并稀釋定容至10 mL (檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm)，搖勻，以HPLC法測(cè)定峰面積，計(jì)算脂質(zhì)體內(nèi)藥量(Clip)。包封率根據(jù)公式EE%=Clip/CtotX 100%計(jì)算。
實(shí)施例1被動(dòng)載藥法制備鹽酸小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體 HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-CHEMS:66.7 mg
將上述脂質(zhì)體膜材以適量無(wú)水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入預(yù)熱至相同溫度的5 mg.ml/1的鹽酸小檗胺溶液4 mL(藥脂比為1:10, w/w)水化2(T30 min,得脂質(zhì)體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時(shí)間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過(guò)0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3 5遍，即得。脂質(zhì)體粒徑約100 nm，包封率小于20%。同時(shí)進(jìn)行了下列處方的被動(dòng)載藥試驗(yàn):
處方I
SPC:200 mg
CHOL:30 mg
mPEG2_-CHEMS:50 mg
處方2
DSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方3
DPPC:200 mg
CHOL:100 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方4 HEPC:200 mgCHOL:20 mg
mPEG2000-CHEMS:65 mg
處方5
DSPG:200 mg
CHOL:66.7 mg mPEG2_-DSPE:66.7 mg
脂質(zhì)體膜材組成見(jiàn)處方I至處方5，并按照本實(shí)施例的前述方法制備鹽酸小檗胺脂質(zhì)體(藥脂比為1:10，w/w)，所得載藥粒徑均在95 110 nm之間，但包封率均未超過(guò)30%。使用0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，包封率也未超過(guò)30%。可見(jiàn)釆用被動(dòng)載藥法難以制得高包封率的小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體。實(shí)施例2 pH梯度法制備鹽酸小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體 處方:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
按處方將脂質(zhì)體膜材以適量無(wú)水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預(yù)熱至相同溫度的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(300 mmol L'pH4.0)水化20 30 min,得到空白脂質(zhì)體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時(shí)間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過(guò)0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3飛遍，得空白脂質(zhì)體混懸液。取空白脂質(zhì)體混懸液1.0 mL，加入500 mmol L—1的磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)外水相pH為
6.5，按藥脂比為1:10 (w/w)加入鹽酸小檗胺溶液，50 60 °〇恒溫孵育1(T20 min，冰水浴終止載藥，所得包封率為94.20%±1.13%、平均粒徑為142.0 nm。將藥物更換為0-丹磺酰基小檗胺鹽酸鹽，使用相同膜材和制備工藝，包封率為83.10%，粒徑 155.0 nm?？梢?jiàn)使用pH梯度法裝載小檗胺類(lèi)藥物可以取得較好的包封率，但脂質(zhì)體粒徑較大。而且采用枸櫞酸梯度法制備的的脂質(zhì)體粒徑較大且放置穩(wěn)定性不好(脂質(zhì)體在4 ± 2 °C下充氮密封放置30 d后出現(xiàn)混濁、絮凝沉淀和長(zhǎng)菌等現(xiàn)象)。實(shí)施例3枸櫞酸銨梯度法制備鹽酸小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體 處方1:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
按處方將脂質(zhì)體膜材以適量無(wú)水乙醇在50 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預(yù)熱至相同溫度的枸櫞酸銨溶液(300 mmol -T1, pH 6.5)水化20 30 min，得空白脂質(zhì)體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時(shí)間為200 wX2 min +400 wX6 min，然后依次通過(guò)0.8,0.45,0.22 Mm微孔濾膜各3飛遍，得空白脂質(zhì)體混懸液。精密移取0.2 mL空白脂質(zhì)體于3 mL的陰陽(yáng)混合離子交換樹(shù)脂柱上(陰:陽(yáng)=2:1，v/v),同時(shí)加入0.2 mL重蒸水,停留10 30 min后,2000 rpm離心4 min,再于柱頂端加入0.1 mL重蒸水2000 rpm離心4 min,合并洗脫液,混勻,得最終磷脂濃度約為20 mg mL-1的梯度脂質(zhì)體。精密移取一定量的枸櫞酸銨梯度脂質(zhì)體，按藥脂比為1:10 (w/w)加入BBM溶液，50°〇恒溫孵育20 min，冰水浴終止載藥，所得脂質(zhì)體的包封率為91.63%±1.17%、平均粒徑為149.2 nm。當(dāng)使用相同方法裝載0- (4-乙氧基-丁基)小檗胺鹽酸鹽時(shí)，包封率為86.97%，脂質(zhì)體粒徑為134 nm。實(shí)施例4硫酸銨梯度法制備鹽酸小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體 處方1:
SPC:200 mg
CHOL:20 mg
mPEG2000- CHEMS:100 mg 處方2:
HSPC:200 mg
CHOL:100 mg
mPEG2_- DSPE:70 mg 處方3:
HSPC:200 mg` CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方4:
HSPC:200 mg
CHOL:50 mg
mPEG2000-CHEMS:20 mg 處方5:
HSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:30 mg 處方6:
DSPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方7:
HSPE:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg 處方8:
DPPC:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg處方9:
DSPG:200 mg
CHOL:66.7 mg
mPEG2_-DSPE:66.7 mg
處方10:
DSPC:100 mg
DPPC100 mg
CHOL:66.7 mg
TPGS:30 mg
處方11:
HSPC:180 mg
DSPG20 mg
CHOL:66.7 mg
吐溫 80:30 mg
按上述各處方將脂質(zhì)體膜材以適量無(wú)水乙醇在65 1:水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加入4 mL預(yù)熱至相同溫度的硫酸銨溶液(200 mmol. ΛρΗ5.5)水化25 min，得到空白脂質(zhì)體初品。將初品探頭超聲，超聲功率和時(shí)間為200 wX2 min+400 wX6 min，然后依次通過(guò)0.8、
0.45,0.22 Mm微孔濾膜各:Γ5遍，得空白脂質(zhì)體混懸液。精密移取0.2 mL空白脂質(zhì)體于3 mL的陰陽(yáng)混合離子交換樹(shù)脂柱上(陰:陽(yáng)=2:1，v/v),同時(shí)加入0.2 mL重蒸水,停留10 30 min后,2000 rpm離心4 min,再于柱頂端加入
0.1 mL重蒸水2000 rpm離心4 min,合并洗脫液,混勻,得最終磷脂濃度約為20 mg.ml/1的梯度脂質(zhì)體。
精密移取一定量的硫酸銨梯度脂質(zhì)體，按藥脂比為1:10 (w/w)加入鹽酸小檗胺溶液，65 1:恒溫孵育10 min，冰水浴終止載藥，所得脂質(zhì)體包封率及粒徑測(cè)定結(jié)果如表I。
權(quán)利要求
1.一種含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征是含有小檗胺類(lèi)藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質(zhì)衍生物和建立梯度物質(zhì)；其中藥物和磷脂的質(zhì)量比為1:5 1:100，膽固醇和磷脂的質(zhì)量比為1:2 1:4，親水性脂質(zhì)衍生物與磷脂的質(zhì)量比為1:2 1:6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的小檗胺類(lèi)藥物為小檗胺、O-乙基-小檗胺、0-丁基-小檗胺、0-辛基-小檗胺、0-(4-乙氧基-丁基)小檗胺、0-苯基-小檗胺、0-乙酰基-小檗胺或0-丹磺?；￠薨返柠}酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、草酸鹽、重酒石酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油及其鈉鹽、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸或磷脂酸中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的親水性脂質(zhì)衍生物選自聚乙二醇與磷脂或聚乙二醇與膽固醇連接所得的聚乙二醇脂質(zhì)衍生物、吐溫80、吐溫20、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯或神經(jīng)節(jié)苷脂中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述建立梯度物質(zhì)選自乙二胺四乙酸銨、硫酸銨、乙二胺四乙酸三乙胺、乙二胺四乙酸乙醇胺、乙二胺四乙酸二乙胺或枸櫞酸銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，其中還含有生育酚及其衍生物、蔗糖、木糖醇、海藻糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇中的一種或多種。
7.制備權(quán)利要求1所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)將建立梯度物質(zhì)配制為0.1(T0.30 mo I/L的水溶液，即水化介質(zhì)，將水化介質(zhì)加熱至50 65 1:保溫待用； (b)以適量乙醇于5(T651:下將磷脂、膽固醇、親水性脂質(zhì)衍生物以及可以選擇性加入的生育酚及其衍生物溶解，之后揮除乙醇，加入步驟(a)的水化介質(zhì)，攪拌分散，得到脂質(zhì)體初品，其中磷脂濃度為KTlOO g/L ； (c)將脂質(zhì)體初品過(guò)微射流儀、過(guò)擠出儀或通過(guò)探頭超聲降低粒徑，得空白脂質(zhì)體； (d)使用透析、切向流過(guò)濾、凝膠過(guò)濾或離子交換劑處理的方法處理空白脂質(zhì)體，得到梯度脂質(zhì)體； (e)將小檗胺類(lèi)藥物溶液與梯度脂質(zhì)體混合，于50 65°C孵育1(T30min，得到含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑，其特征在于:所述的脂質(zhì)體與藥學(xué)上接受的賦形劑制成注射液、凍干粉針劑、口服液、膠囊劑、氣霧劑、滴鼻劑、凝膠劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種含有小檗胺類(lèi)藥物的脂質(zhì)體制劑及其制備方法。所述的脂質(zhì)體中，含有小檗胺類(lèi)藥物、磷脂、膽固醇、親水性脂質(zhì)衍生物和建立梯度物質(zhì)；其中藥物和磷脂的質(zhì)量比為1:5~1:100，膽固醇和磷脂的質(zhì)量比為1:2~1:4，親水性脂質(zhì)衍生物與磷脂的質(zhì)量比為1:2~1:6。本發(fā)明的制備方法切實(shí)可行、質(zhì)量可控，便于工業(yè)化生產(chǎn)；所得小檗胺類(lèi)藥物脂質(zhì)體的粒徑小且分布均一、包封率高、穩(wěn)定性良好；將小檗胺類(lèi)藥物制備為脂質(zhì)體后可有效延長(zhǎng)藥物的血液循環(huán)時(shí)間，提高腫瘤組織的靶向效率，增強(qiáng)藥物體內(nèi)抗腫瘤效果，或在與其他化療藥物合用時(shí)發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)及降毒并提高機(jī)體免疫力。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103181896SQ20111045357
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者鄧意輝, 徐洋, 佘振南 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)