專利名稱：威靈仙總皂苷及其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥威靈仙中提取的威靈仙總皂苷，并經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療作用。
背景技術(shù)：
威靈仙是中醫(yī)臨床上傳統(tǒng)的祛風(fēng)濕要藥，來(lái)源為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetala Pall.或東北鐵線蓮Clematis manshurica Rupr.的干燥根及根莖。性溫，味辛、咸，功能祛風(fēng)除濕，用于治療“痹癥”的歷史悠久，唐朝嵩陽(yáng)子周君巢作《威靈仙傳》記載威靈仙去眾風(fēng)，通十二經(jīng)脈，朝服暮效，疏宣五臟冷膿宿水變滿，微利不瀉人，服此四肢輕健，手足微暖，并得清涼。先時(shí)商州有人病手足不遂，不履地?cái)?shù)十年，良醫(yī)殫技莫能療，所親置之道旁，以求救者，遇一新羅僧見之，告曰此疾一藥可活，但不知此土有否？因?yàn)橹巳肷角蟛?，果得，乃威靈仙也，使服之，數(shù)日能步履。其后鄧思齊知之，遂傳某事?，F(xiàn)代研究表明，威靈仙具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用。但對(duì)其祛風(fēng)除濕、抗炎鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未見報(bào)道。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇缘淖陨砻庖咝约膊?，其病程長(zhǎng)期反復(fù)，致殘率高。臨床上應(yīng)用的化學(xué)合成藥主要有糖皮質(zhì)激素和非甾體抗炎藥，但尚不能確切根治本病，且不良反應(yīng)較多。因此世界各國(guó)致力于對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)藥進(jìn)行深入研究，從中提取分離有效成分和有效部位，尋找療效好，副作用少的抗炎新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從傳統(tǒng)抗風(fēng)濕中藥威靈仙中提取出治療實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分，以便進(jìn)一步研制出安全、有效、可控的中藥抗風(fēng)濕新藥。精制的提取物用于制備各種劑型的藥物具有檢測(cè)方便、服用劑量小、服用方便、療效高的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明中制備威靈仙總皂苷的大孔吸附樹脂方法具有操作簡(jiǎn)單、工藝流程短、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
本發(fā)明應(yīng)用大孔吸附樹脂分離純化技術(shù)從威靈仙中提取出有效部位總皂苷，為三萜皂苷類化學(xué)成分，主要含以下化學(xué)成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
R1R2威靈仙皂苷CP1OH 3-O-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP2H3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP2bH3-O-β-D-木糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP3bOH 3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP3H3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP4H3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP5OH 3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP6OH 3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP7H3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP8OH 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP9H3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP10OH 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)上述威靈仙總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著治療作用，試驗(yàn)方法與結(jié)果如下1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雄性(熱板試驗(yàn)中為雌性)，體重18～22g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心動(dòng)物房，合格證號(hào)皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。Wistar大鼠，雄性，體重180～220g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心動(dòng)物房，合格證號(hào)皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第03號(hào)?？照{(diào)控制室溫20-25℃，濕度40-70％，自由飲水，攝食。
1.2藥品與試劑威靈仙總皂苷(Total Saponins of Clematis)，用時(shí)以純化水配制成所需濃度的混懸液。確定小鼠低、中、高劑量分別為37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg。大鼠低、中、高劑量分別為25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。雷公藤多苷片浙江得恩德制藥有限公司，批號(hào)0311116。確定小鼠劑量為15mg/kg，大鼠劑量為10mg/kg。伊文思藍(lán)、醋酸、二甲苯等均為分析純；雞蛋市售。弗氏完全佐劑，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，批號(hào)020605。
1.3主要儀器設(shè)備8543E紫外-可見分光光度計(jì)；美國(guó)安捷倫公司；BP211D十萬(wàn)分之一電子天平；德國(guó)Sartorius公司；HH-S型恒溫水浴箱河南英峪予華儀器廠；秒表深圳惠波科工貿(mào)公司；大鼠足容積測(cè)定器本室自制。高速離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠；8543E紫外-可見分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫公司。
2.方法與結(jié)果2.1醋酸致小鼠血管通透性增加試驗(yàn)小鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、威靈仙總皂苷38、75、150mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照組(雷公藤多苷片)，每組10只。每天灌胃給藥一次，連續(xù)3天，末次給藥后1h小鼠尾靜脈注射0.5％伊文思藍(lán)5ml/kg，5min后腹腔注射0.5％醋酸10ml/kg，30min后小鼠脫臼處死。用生理鹽水反復(fù)洗出腹腔內(nèi)伊文思藍(lán)液，稀釋為10ml，純水調(diào)零，于分光光度計(jì)上590nm處比色測(cè)吸光度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表1。
表1 對(duì)小鼠腹腔染料滲出的影響(x±s，n＝10)

(與對(duì)照組比較，*示P＜0.05，**示P＜0.01，下同)表1顯示威靈仙總皂苷能明顯減少小鼠腹腔伊文思藍(lán)滲出量，與對(duì)照組比較，高、中劑量組均有非常顯著性差異(p＜0.01)，表明威靈仙總皂苷能抑制醋酸致小鼠血管通透性增加。
2.2二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹試驗(yàn)小鼠50只，分組及給藥同2.2.1，于末次給藥后1h于小鼠右耳前后兩面涂抹二甲苯0.02ml，左耳作對(duì)照，2h后將小鼠脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片，稱重，以左右耳片重量之差為腫脹度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表2。
表2 對(duì)小鼠耳腫脹度的影響(x±s，n＝10)

表2顯示威靈仙總皂苷能減輕小鼠耳腫脹程度，與對(duì)照組比較，低、高劑量組均有顯著差異(p＜0.05)，中劑量組有非常顯著性差異(p＜0.01)，表明威靈仙總皂苷能抑制小鼠急性炎癥。
2.3蛋清誘導(dǎo)大鼠足腫脹試驗(yàn)大鼠30只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、威靈仙總皂苷25、50、100mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照組(雷公藤多苷片)，每組6只。灌胃給藥，每天一次，連續(xù)3天，末次給藥后1h每鼠右足趾皮下注射1％蛋清0.1ml致炎，分別在致炎前和致炎后0.5h，測(cè)量致炎側(cè)足容積，以各鼠致炎前、后容積的差值為腫脹度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表3。
表3 對(duì)大鼠足腫脹度的影響(x±s，n＝6)

表3顯示威靈仙總皂苷能減輕大鼠足腫脹程度，與對(duì)照組比較，高、中、低劑量組均有顯著差異(p＜0.05)，表明威靈仙總皂苷能抑制大鼠急性炎癥。
2.4棉球誘導(dǎo)的大鼠肉芽腫模型大鼠30只，隨機(jī)分為5組，分組與給藥同上，乙醚淺麻醉，在無(wú)菌條件下操作，將棉球(每個(gè)重50mg±1mg，高壓滅菌后每個(gè)棉球加氨芐西林1mg·0.1mL-1，50℃烘干)分別植入大鼠兩側(cè)腹股溝皮下，手術(shù)當(dāng)天開始ig給藥，連續(xù)7d，d8頸椎脫臼致死，取出棉球，置60℃烤箱烤至恒重，減去原棉球重量，即為肉芽腫凈重。比較各組肉芽腫重量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表4。
表4 對(duì)大鼠棉球肉芽腫重量的影響(x±s，n＝6)

表4顯示威靈仙總皂苷對(duì)棉球誘導(dǎo)的大鼠肉芽腫有顯著的抑制作用，與對(duì)照組比較，高劑量組有顯著性差異(p＜0.05)，中劑量組有非常顯著性差異(p＜0.01)，表明威靈仙總皂苷能抑制大鼠慢性炎癥反應(yīng)。
2.5小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)預(yù)選痛閾合格小鼠50只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、威靈仙總皂苷38、75、150mg·kg-1組和陽(yáng)性對(duì)照組(雷公藤多苷片)，每組10只。連續(xù)灌胃給藥3天，末次給藥后1h小鼠按熱板法測(cè)定舔足時(shí)間。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表5。
表5 對(duì)小鼠舔足時(shí)間的影響(x±s，n＝10)

表5顯示威靈仙總皂苷能明顯延長(zhǎng)小鼠舔足時(shí)間，與對(duì)照組比較，高劑量組有顯著性差異(p＜0.05)，中劑量組有非常顯著性差異(p＜0.01)，說(shuō)明威靈仙總皂苷有明顯鎮(zhèn)痛作用。
2.6小鼠扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)小鼠50只，分組及給藥同2.5。末次給藥后0.5h小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液，觀察并記錄15分鐘內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表6。
表6 對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響(x±s，n＝10)

表6顯示威靈仙總皂苷能明顯減少小鼠扭體次數(shù)，與對(duì)照組比較，中劑量組有顯著性差異(p＜0.05)，高劑量組有非常顯著性差異(p＜0.01)，說(shuō)明威靈仙總皂苷有明顯鎮(zhèn)痛作用。
2.7對(duì)免疫性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響2.7.1大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的模型制備于每鼠左后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎。
2.7.2藥物對(duì)原發(fā)性病變影響大鼠48只，隨機(jī)分為空白組、模型組、TSC組(高、中、低劑量)用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組(雷公藤多苷)，每組8只，致炎前3d ig給藥，分別于致炎前、后3h，6h及24h，檢測(cè)致炎前、后大鼠致炎側(cè)足腫脹，以觀察AA大鼠原發(fā)性病變(見表7)。
表7 TSC對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性病變的影響(x±s)

注vs.空白組，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；vs.模型組，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001，下同表7結(jié)果表明與模型組比較，TSC高、中、低各劑量組均有顯著性差異，表明TSC各劑量組對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性病變均有顯著性差異。
2.7.3藥物對(duì)繼發(fā)性病變影響致炎后第4d開始ig給藥，每天一次，于第7、11天分別檢測(cè)非致炎側(cè)足容積。同時(shí)采用關(guān)節(jié)評(píng)分(0-4)(0無(wú)紅腫，1足小趾關(guān)節(jié)紅腫，2趾關(guān)節(jié)紅腫、足跖均紅腫，3踝關(guān)節(jié)以下均紅腫，4包括踝關(guān)節(jié)，全部紅腫；除致炎側(cè)外，三足的積分之和為關(guān)節(jié)總積分，最高為12分)，采用Ridit值法對(duì)AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行評(píng)估，以觀察AA大鼠繼發(fā)性病變(見表2、3)。
TSC對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變的影響表8 大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分


表8結(jié)果表明TSC能有效改善關(guān)節(jié)炎癥狀。
表9 TSC對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變的影響(x±s)

表9結(jié)果表明與模型組比較，TSC中、高劑量組對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變均有顯著性差異(p＜0.05)，表明TSC對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變有顯著性作用。
結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的威靈仙總皂苷對(duì)各種炎癥模型均有顯著的抗炎作用，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)性病變和繼發(fā)性病變有不同程度的防治作用，同時(shí)還具有顯著鎮(zhèn)痛作用。說(shuō)明威靈仙總皂苷用于臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有重要的治療價(jià)值?？梢?，用威靈仙總皂苷可制成對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有治療作用的藥品。
本發(fā)明中，威靈仙總皂苷的提取方法如下以中藥威靈仙為原料，粉碎后用70％乙醇回流提取2-3次，合并提取液，減壓回收乙醇，得濃縮浸膏。浸膏以適量水稀釋，上D101大孔吸附樹脂柱吸附，先用水洗去水溶性雜質(zhì)，再以50％乙醇洗脫，收集50％乙醇洗脫液，濃縮干燥得含多種皂苷成分的威靈仙總皂苷。
權(quán)利要求
1.一種以中藥威靈仙為原料提取的有效部位威靈仙總皂苷，其特征在于具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu) R1R2威靈仙皂苷CP1OH3-O-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP2H 3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP2bH 3-O-β-D-木糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP3bOH3-O-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP3H 3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP4H 3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP5OH3-O-β-D-木糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP6OH3-O-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP7H 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP8OH3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP9H 3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖威靈仙皂苷CP10OH3-O-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-葡萄糖-(1-4)-β-D-核糖-(1-3)-α-L-鼠李糖-(1-2)-α-L-阿拉伯糖
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的威靈仙總皂苷，其特征在于用它制成對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有治療作用的藥品。
全文摘要
一種以中藥威靈仙為原料提取的有效部位威靈仙總皂苷，含有威靈仙皂苷CP
文檔編號(hào)A61K31/704GK1927878SQ200510094339
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月9日
發(fā)明者徐先祥, 夏倫祝, 邵旭 申請(qǐng)人:徐先祥, 夏倫祝, 邵旭