專利名稱：一種能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物，更具體地說是癌癥治療藥物。
背景技術(shù)：
目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和放化療耐藥的根源，也是腫瘤治療失敗和死亡的最主要原因。ABCG2等跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體能將化療藥有效泵出細(xì)胞以避免細(xì)胞遭受損害，是導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵。尋找并建立能有效殺傷腫瘤干細(xì)胞和克服放化療耐藥對(duì)于控制腫瘤和改善癌癥患者預(yù)后有重要意義，對(duì)此，迄今為止沒有相關(guān)文獻(xiàn)的公開報(bào)導(dǎo)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物，用于多種放化療耐藥或不耐藥實(shí)體瘤的有效治療。本發(fā)明為解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案本發(fā)明能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物的特點(diǎn)是所述藥物組成為每100毫升藥液含無水乙醇2-10毫升、順鉬40-50毫克和滅菌水90-98毫升。本發(fā)明能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物的特點(diǎn)也在于可以用于替代順鉬的是多西紫杉醇、卡莫司汀、奧沙利鉬、卡鉬和吉西他濱中的一種或多種任意組合。本發(fā)明藥物在制備治療肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、腹膜后腫瘤或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、賁門癌、胃腸道惡性腫瘤、軟組織肉瘤和頭頸部腫瘤的各種實(shí)體腫瘤及伴有胸、腹、心包腔惡性積液的耐藥或不耐藥的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明藥物在制備治療耐藥細(xì)菌或真菌或病毒從而使其對(duì)抗感染藥物重新敏感的藥物中的應(yīng)用。治療機(jī)理腫瘤干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和放化療耐藥的根源，也是腫瘤治療失敗和死亡的最主要原因。ABCG2等跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體能將化療藥有效泵出細(xì)胞以避免細(xì)胞遭受損害，是導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵。2-10%乙醇能部分或全部滅活腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞膜上的ABCG2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體從而阻滯腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物被其泵出而使化療藥物積聚在細(xì)胞內(nèi)，從而與化療藥協(xié)同發(fā)揮殺傷化療耐藥腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞的作用。本發(fā)明藥物在體外能高效殺傷腫瘤干細(xì)胞并能使3只荷瘤裸鼠腫瘤消退及余下荷瘤裸鼠腫瘤生長停滯。生存分析表明，本發(fā)明藥物能顯著延長荷瘤裸鼠生存時(shí)間。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在I、本發(fā)明可以克服各種腫瘤的化療藥耐藥和放療耐受，高效殺傷耐藥腫瘤，適用于各種放化療無效的實(shí)體瘤和惡性胸、腹、心包腔積液治療。2、本發(fā)明制備方法操作簡便、成本低，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。
3、本發(fā)明各組分均為國家食品藥品管理局允許的腫瘤治療成分，且各組分間不發(fā)生相互作用，可以即刻進(jìn)入臨床應(yīng)用。


圖I為應(yīng)用流式細(xì)胞儀SP分選法分選獲得A549/DDP細(xì)胞系的SP細(xì)胞并證明其富含并可代表肺癌腫瘤干細(xì)胞。圖2-1和圖2-2為流式細(xì)胞儀分析肺癌腫瘤干細(xì)胞凋亡情況。圖3為本發(fā)明治療荷瘤裸鼠的腫瘤體積變化。圖4為四組動(dòng)物治療后的生存情況，利用發(fā)明治療荷瘤裸鼠后動(dòng)物生存時(shí)間顯著延長。
具體實(shí)施方式
以下動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明有益效果作進(jìn)一步說明從A549/DDP分離側(cè)群細(xì)胞作為肺癌腫瘤干細(xì)胞來驗(yàn)證本發(fā)明在體外的殺傷效能。體內(nèi)試驗(yàn)采用耐順鉬肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP皮下接種裸鼠建立荷耐化療藥腫瘤動(dòng)物模型，以研究本發(fā)明殺傷耐藥腫瘤的體內(nèi)藥效。其方法、結(jié)果和結(jié)論如下I.材料與方法I. I細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞(A549/⑶DP)購自中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫。人肺腺癌A549/⑶DP細(xì)胞培養(yǎng)于含2 μ mo I順鉬(齊魯醫(yī)藥公司)和10%滅活胎牛血清(Gibco公司)的高糖DMEM (Gibco公司)培養(yǎng)液，置于37°C含5% CO 2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用O. 25%胰蛋白酶消化傳代。1.2 SP細(xì)胞分選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。自培養(yǎng)皿中以O(shè). 25 %胰酶-EDTA消化、收集細(xì)胞，1000 r/ min低速離心10 min，用含2%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(PBS )重懸。調(diào)整細(xì)胞密度為IO6個(gè)/ml,設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入Hoechst 33342 (Sigma, StLouis, MO, USA)至終濃度為5 μ g/ml,對(duì)照組加入維拉帕米(Sigma, St Louis, MO, USA)至終濃度為50ymol/ml，37°C 5 % C02、95 %濕度孵箱中孵育90 min，I 000 r/ min離心，以含2 %FBS的PBS重懸至I X IO6 / mL，經(jīng)40 μ m濾網(wǎng)過濾后于4 °C下存放至檢測。檢測前，加碘化丙啶(PI)染色標(biāo)記死亡細(xì)胞，然后入流式細(xì)胞儀FACS Vantage SE(BD Bioscience)檢測分選，350 nm波長紫外光激發(fā)Hoechst染色，熒光通過405/BP30(Hoechst藍(lán)色)和570/BP20 (Hoechst紅色)光學(xué)過濾器檢測。(將低Hoechst Red及低Hoechst Blue且維拉帕米缺失區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的門)，計(jì)算百分比，分選出SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞。SP和non-SP的A549/DDP細(xì)胞在經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后加入完全RPMI培養(yǎng)基中，并在2小時(shí)內(nèi)為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)使用。I. 3克隆形成試驗(yàn)用平板克隆形成試驗(yàn)來評(píng)估SP和non-SP A549/⑶DP細(xì)胞的體外成瘤能力。取生長良好的SP和non-SP A549/DDP細(xì)胞用PBS洗I次，O. 1%_0. 2%的胰蛋白酶消化后加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液。1000r/min離心IOmin后收集細(xì)胞，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，使100個(gè)SP和100個(gè)non-SP A549/DDP細(xì)胞分別培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板上，每組各有3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)基每周換2次，10天后每個(gè)孔在顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。按下述公式計(jì)算克隆形成率(%CFE)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))X 100，并計(jì)算了克隆形成率的對(duì)數(shù)形式進(jìn)行比較。I. 4流式細(xì)胞技術(shù)分析肺癌干細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀分離的側(cè)群細(xì)胞經(jīng)對(duì)照、順鉬、2-10%乙醇、2-10%乙醇-順鉬處理3小時(shí)后，用2. 5g/L的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,用Annexin V-FITC apoptosis detectionkit (BioVision, Mountain View, CA, USA)并用 FACScalibur flow cytometer (BDBioscience)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(按試劑盒中說明書操作)。I. 5動(dòng)物和腫瘤生長
Balb/C裸鼠和N0D/SCID鼠均為雌性，6周齡，體質(zhì)量18_20g，購于中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)(CALAS)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，P B S洗I次，懸浮于生理鹽水，取5 XlO6的A549/DDP 0. 2ml單細(xì)胞懸液分別接種至N0D/SCID鼠(成瘤試驗(yàn))或Balb/C裸鼠(腫瘤生長試驗(yàn))左側(cè)肋部皮下，建立皮下移植瘤模型。荷瘤裸鼠腫瘤體積達(dá)0. 6cm3左右后，將48只Balb/C裸鼠隨機(jī)分為以下4組，對(duì)照組、順鉬組、2-10%乙醇組、2-10%乙醇-順鉬組,每組12只，并開始相應(yīng)治療，治療為0. 2ml相應(yīng)藥液瘤內(nèi)注射，每3天一次，共4周。密切觀察皮下腫瘤生長情況，每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小I次，按公式V= 1/2長徑X短徑2，計(jì)算腫瘤體積，并繪制皮下移植瘤生長曲線。動(dòng)物生存觀察至動(dòng)物死亡或至125天截尾。I. 6體內(nèi)成瘤試驗(yàn)24只5周齡的雌性聯(lián)合免疫缺陷(N0D/SCID)小鼠購于中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)(CALAS，北京)培養(yǎng)在無菌環(huán)境。小鼠分為8組，每組3只，分別于側(cè)肋皮下注射接種100μ I 含 5 X IO5,1 X IO5,5 X IO4,5 X IO3 SP 細(xì)胞，或含 I X IO7,5 X IO6,5 X IO5,5 X IO4 non-SP細(xì)胞懸液。密切觀察皮下腫瘤生長情況，每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，按公式V= 1/2長徑X短徑2，計(jì)算腫瘤體積。成瘤能力比計(jì)算按公式成瘤能力比=成瘤所需的non-SP細(xì)胞數(shù)/成瘤所需的SP細(xì)胞數(shù)。I. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19軟件。生存數(shù)值表達(dá)為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤，分析采用Kaplan-Meier方法計(jì)算。計(jì)量資料數(shù)值表達(dá)為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P〈0.05表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2. I肺癌腫瘤干細(xì)胞的鑒定經(jīng)過Hoechst33342染色后的流失細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)A549/CDDP細(xì)胞中存在10%_17%的SP細(xì)胞。加入維拉帕米的對(duì)照組A549/⑶DP細(xì)胞中SP細(xì)胞消失了(圖I)?？寺⌒纬稍囼?yàn)觀察了 10天。SP細(xì)胞的克隆形成能力較non-SP細(xì)胞明顯高。SP細(xì)胞的LoglO CFE (colony forming efficiency)和non-SP細(xì)胞相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(I. 544 土 0.150 vs 0.301 土 0.082，Ρ〈0· 05，圖 I)。體內(nèi)成瘤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種SP細(xì)胞的小鼠只需要5 XlO3個(gè)SP細(xì)胞便足以成瘤，而接種non-SP細(xì)胞的小鼠卻需要超過5 XlO6個(gè)non-SP細(xì)胞才能在體內(nèi)成瘤(圖I)。A549/CDDP細(xì)胞分選獲得的SP成瘤能力是non-SP細(xì)胞成瘤能力的1，OOO倍。其中，各接種5XlO4或5 XlO5個(gè)SP細(xì)胞的6只小鼠側(cè)肋均有瘤體形成，而各接種5 XlO4或5 XlO5個(gè)non-SP細(xì)胞的6只小鼠側(cè)肋均無瘤體形成。上述結(jié)果表明，F(xiàn)ACS分選獲得的SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的成瘤特性，為富含肺癌腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞群體，可以代表肺癌腫瘤干細(xì)胞用于腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性和干預(yù)研究。圖I中上圖最上方A、B兩圖為應(yīng)用流式細(xì)胞儀SP分選法分選獲得A549/DDP細(xì)胞系的SP細(xì)胞；中左側(cè)圖C、D、E和F為分選獲得的SP細(xì)胞經(jīng)過體外細(xì)胞集落形成試驗(yàn)鑒定SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性；中右側(cè)圖G為SP與non-SP的集落形成能力直觀比較圖，表明SP的集落形成能力顯著高于non-SP細(xì)胞(P〈0. 01);下圖為分選獲得的SP細(xì)胞經(jīng)過NOD/SCID鼠體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)形成的腫瘤，SP細(xì)胞致瘤能力顯著強(qiáng)于non-SP,致瘤能力提高1000倍。這表明流式細(xì)胞儀分選的A549/DDP SP細(xì)胞具有肺癌腫瘤干細(xì)胞的成瘤特性。
2.2 2-10%乙醇-順鉬誘導(dǎo)肺癌腫瘤干細(xì)胞凋亡與對(duì)照組凋亡率(2. 56%±0. 007)相比，2-10%乙醇-順鉬(97. 69%±0. 06)能顯著誘導(dǎo)肺癌腫瘤干細(xì)胞凋亡(p〈0.01 )，而化療藥順鉬則不能。圖2-1散點(diǎn)圖為Annexin V染色細(xì)胞后流式細(xì)胞儀分析凋亡的直接結(jié)果圖，其中，a為對(duì)照肺癌腫瘤干細(xì)胞；b為順鉬治療后的肺癌腫瘤干細(xì)胞；c為2-10%的乙醇治療后肺癌腫瘤干細(xì)胞；d為2-10%的乙醇-順鉬治療后的肺癌腫瘤干細(xì)胞。圖2-2為四個(gè)處理組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后凋亡率直觀比較圖。從圖中可以看出，2-10%乙醇-順鉬能顯著誘導(dǎo)肺癌腫瘤干細(xì)胞凋亡(P〈0. 01)。2. 3 2-10%乙醇-順鉬能誘導(dǎo)荷化療耐藥腫瘤裸鼠腫瘤消退荷瘤動(dòng)物治療四周后，2-10%乙醇-順鉬組動(dòng)物腫瘤體積(0. 081 + 0. 06 cm3)低于2-10% 乙醇(3. 72±0· 83 cm3)、順鉬(2. 13±0· 31 cm3)和對(duì)照組動(dòng)物(4. 18±0· 48 cm3)，差異均有顯著性(P〈0.01)，見圖3。其中，2-10%乙醇-順鉬組3只裸鼠腫瘤完全消退，表明2-10%乙醇-順鉬能克服化療耐藥并高效殺傷腫瘤。圖3中，處最上方線為對(duì)照組動(dòng)物腫瘤體積隨時(shí)間增加后的變化線，稍下方為2-10%乙醇治療后動(dòng)物腫瘤大小變化線，再下方線為順鉬治療組動(dòng)物腫瘤大小變化線，最下方線為2-10%乙醇-順鉬治療后動(dòng)物腫瘤大小變化線。從上圖可以看出，2-10%乙醇-順鉬治療后動(dòng)物腫瘤體積顯著縮小(P〈0. 01)。2. 4 2-10%乙醇-順鉬顯著延長荷瘤裸鼠生存荷瘤動(dòng)物經(jīng)2-10%乙醇-順鉬治療后，生存時(shí)間顯著延長。2-10%乙醇-順鉬組動(dòng)物估計(jì)平均生存時(shí)間(123. 67±1. 11天)顯著長于順鉬組(100. 25±4. 41天)、2_10%乙醇組(91. 08±5· 15天)和對(duì)照組(88. 92±7· 52天)，差異均具有顯著性(P〈0. 01)。圖4中a線為2-10%乙醇-順鉬治療組生存曲線，b線為順鉬組生存曲線，c線為2-10%乙醇治療組生存曲線，d線為對(duì)照組動(dòng)物生存曲線。從上圖4可以看出，2-10%乙醇-順鉬治療組動(dòng)物生存時(shí)間顯著延長(P〈0. 01)。3.結(jié)論綜上所述，2-10%乙醇-順鉬可以高效殺傷肺癌腫瘤干細(xì)胞和誘導(dǎo)荷瘤裸鼠耐藥腫瘤消退并顯著延長荷耐藥腫瘤動(dòng)物生存時(shí)間。
本發(fā)明藥物使用方法和用量通過加入2-10毫升無水乙醇、40-50毫克順鉬和90_98毫升的滅菌水制備成100毫升藥液。每位實(shí)體瘤患者可用上述藥液20-30毫升進(jìn)行腫瘤內(nèi)局部注射或10 — 20毫升霧化吸入(治療肺癌)，每周1-2次，連續(xù)2-3周治療為一療程。對(duì)于胸、腹、心包腔惡性積液患者，每例病人取100-500毫升含2-25毫升無水乙醇和10-30毫克順鉬的滅菌水溶液用于惡性胸腹腔和心包腔積液的灌注治療，每周2-3次，連續(xù)2-3周治 療為一療程。
權(quán)利要求
1.一種能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物，其特征是所述藥物組成為每100毫升藥液含無水乙醇2-10毫升、順鉬40-50毫克和滅菌水90-98毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物，其特征是可以用于替代順鉬的是多西紫杉醇、卡莫司汀、奧沙利鉬、卡鉬和吉西他濱中的一種或多種任意組合。
3.權(quán)利要求I所述的藥物在制備治療肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、腹膜后腫瘤或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、賁門癌、胃腸道惡性腫瘤、軟組織肉瘤和頭頸部腫瘤的各種實(shí)體腫瘤及伴有胸、腹、心包腔惡性積液的耐藥或不耐藥的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的藥物在制備治療耐藥細(xì)菌或真菌或病毒從而使其對(duì)抗感染藥物重新敏感的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能殺傷放化療耐藥腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的癌癥治療藥物及其應(yīng)用，其特征是藥物組成為每100毫升藥液含無水乙醇2-10毫升、順鉑40-50毫克和滅菌水90-98毫升。本發(fā)明藥物主要用于腫瘤局部注射或胸、腹、心包腔惡性積液的灌注治療或肺部腫瘤的霧化吸入治療，適用于肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、腹膜后腫瘤或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、賁門癌、胃腸道惡性腫瘤、軟組織肉瘤、膠質(zhì)瘤和頭頸部腫瘤等各種實(shí)體腫瘤及伴有胸、腹、心包腔惡性積液的耐藥或不耐藥的腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102772429SQ20121027236
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者李倩 申請(qǐng)人:李倩