專(zhuān)利名稱：一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備方法及其相應(yīng)片劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種由貽貝等軟體動(dòng)物酶解制備免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽和相應(yīng)片劑的方法。
背景技術(shù)：
貽貝屬軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、貽貝目、貽貝科，貽貝屬，是海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)，俗稱青口、海紅，素有“海中雞蛋”之稱，其蛋白質(zhì)含有人體需要的 纈氨酸、亮氨酸等8種必需氨基酸，且含量遠(yuǎn)高于雞蛋、雞、鴨、魚(yú)、奸和肉類(lèi)。貽貝優(yōu)良的蛋白組成為貽貝深度開(kāi)發(fā)提供了保證，如新西蘭從貽貝中提取治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)的藥物，俄羅斯專(zhuān)門(mén)用貽貝生產(chǎn)一種防動(dòng)脈粥樣硬化的食品。但是我國(guó)貽貝基本停留在帶殼鮮銷(xiāo)、加工成各種冷凍食品、油炸食品和貽貝油等方面，精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用極少。因此，與其它大宗海產(chǎn)品相比而言，貽貝的加工利用率極低，造成了高營(yíng)養(yǎng)貽貝資源的極大浪費(fèi)，從而限制了我國(guó)貽貝產(chǎn)業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展。因此，高效開(kāi)發(fā)利用貽貝蛋白資源具有廣闊的市場(chǎng)前景和重要的社會(huì)意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)部分學(xué)者對(duì)貽貝酶解多肽的制備工藝進(jìn)行了研究。如中國(guó)專(zhuān)利CN102020709A “一種厚殼貽貝抗菌肽及制備方法和用途”即研究了從厚殼貽貝制備抗菌肽的方法及其在飼料中做為添加劑的應(yīng)用；中國(guó)專(zhuān)利CN 101991840A “抗前列腺癌貽貝酶解提取物的制備方法及應(yīng)用”即研究了利用Alcalase制備抗前列腺癌貽貝酶解提取物的方法及其應(yīng)用沖國(guó)專(zhuān)利CN 101991840A “酶解貽貝蛋白制備降血壓肽的方法”即研究了一種利用堿性蛋白酶酶解貽貝蛋白制備降血壓肽的方法。以上方法利用酶解工藝制備具有特定功效的多肽，但是由于單一酶酶解相對(duì)效率較低，從而具有特定功效的多肽得率極低，難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化需求。另外，中國(guó)專(zhuān)利CN 101991840A “貽貝活性多肽的制備方法”即研究了一種酸性條件下利用真空超聲波反應(yīng)釜制備貽貝活性多肽的方法，該方法雖然具有工藝簡(jiǎn)單，適于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，但是所得酶解產(chǎn)物除含有多肽外，尚含有多糖等多種物質(zhì)，是多種成分的混合物，所得制備物不能直接用于純度要求高的用途中。申請(qǐng)人:在檢索過(guò)程發(fā)現(xiàn)我國(guó)以貽貝為原料，利用酶解技術(shù)制備免疫增強(qiáng)作用多肽的工藝研究處于空白階段，對(duì)于實(shí)際可行的酶解工藝尚沒(méi)有報(bào)道，而以此為原料制備免疫增強(qiáng)型多肽片的制備工藝及配方更是未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備方法，以貽貝為原料，資源豐富，同時(shí)制備工藝簡(jiǎn)單、制得的免疫增強(qiáng)肽純度高、且具有較高的活性。本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種貽貝多肽片的制備方法，以貽貝蛋白免疫增強(qiáng)肽為原料進(jìn)行制備，制得的片劑可作為老年人和體弱多病者的日常保健產(chǎn)品，亦可作為術(shù)后病人的醫(yī)用食品。本發(fā)明解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟I)以貽貝干粉作為原料，將原料與pH為9. 5 10. 5的甘氨酸-NaOH緩沖液按照Ig 20ml Ig 25ml的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9. 5 10，得混合液；2)將混合液溫度升至50 55°C攪拌預(yù)熱15 20分鐘，按原料質(zhì)量的I. 0% I. 5%分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50 55°C，酶解時(shí)間2 4h ; 3)將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得到免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽。 作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的貽貝為紫貽貝、厚殼貽貝或者翡翠貽貝。作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的緩沖液的pH為10。再優(yōu)選，所述的步驟2)中的堿性蛋白酶的酶活力彡1.9X104U/g，中性蛋白酶的酶活力彡 4.9X104U/g/g。最后，所述步驟3)中的滅酶處理為將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至0 10°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，得酶解液；所述步驟3)中脫鹽、濃縮和噴霧干燥的具體過(guò)程為將酶解液制成濃度IOmg/ml 20mg/ml的溶液，進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在彡40°C的低溫下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮酶解液的比重為I. 05 I. 15g/cm3 ;濃縮酶解液在進(jìn)行溫度為160 200°C下進(jìn)行噴霧干燥，出口溫度為65 110°C。獲得的貽貝酶解多肽經(jīng)SEC-HPLC試驗(yàn)表明酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9kDa，分子量(80 2500u)含量為90. 89%。本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽片劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟I)以貽貝干粉作為原料，采用上述的酶解技術(shù)制備免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽；2)將制得的酶解多肽與稀釋劑混合均勻，過(guò)60 80目篩，加入適量乙醇，將混合物制成軟材，過(guò)20 24目篩，制成顆粒狀，再在50 60°C條件下通風(fēng)干燥，再過(guò)18 22目篩，得到制片顆粒；3)在所得制片顆粒中加入適量的崩解劑和潤(rùn)滑劑，混合均勻，最后在壓片機(jī)上壓成片劑，包薄膜衣，即得免疫增強(qiáng)型貽貝多肽片。作為優(yōu)選，所述稀釋劑為微晶纖維和淀粉，所述酶解多肽與微晶纖維和淀粉按照質(zhì)量比I : 0.8 I : 0.3 0.6混合均勻。再優(yōu)選，所述崩解劑為干淀粉，所述潤(rùn)滑劑為滑石粉；所用干淀粉的量為制片顆粒重量的2. 5% 3. 5%，所用滑石粉的量為制片顆粒重量的1% 2%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于I、本發(fā)明工藝科學(xué)合理，操作簡(jiǎn)單，選用堿性蛋白酶和中性蛋白酶作為酶解用酶，通過(guò)生物酶解法同時(shí)融合大孔樹(shù)脂脫鹽和噴霧干燥等手段進(jìn)行制備，酶解過(guò)程易監(jiān)控，使免疫增強(qiáng)肽最大程度地釋放出來(lái)，提高原料的利用率，同時(shí)制得的免疫增強(qiáng)肽及其片劑具有較高的活性；
2、本發(fā)明采用的原料是貽貝，資源豐富，成本較低，同時(shí)可以有效提高貽貝的附加值，對(duì)貽貝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義；3、本發(fā)明所制備的免疫增強(qiáng)肽是貽貝蛋白經(jīng)酶水解制得，安全、無(wú)毒副作用，并且免疫增強(qiáng)作用顯著，對(duì)老年人、體弱多病者和術(shù)后病人具有良好的保健作用，免疫增強(qiáng)肽可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑等，本發(fā)明的免疫增強(qiáng)肽片劑可作為老年人和體弱多病者的日常保健產(chǎn)品，亦可作為術(shù)后病人的醫(yī)用食品。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備工藝及其片劑制備方法，制備工藝流程如下貽貝干粉一酶解一大孔樹(shù)脂脫鹽一噴霧干燥一免疫增強(qiáng)肽一片劑。 具體步驟為I、稱取貽貝脫脂干粉5. Og,加入pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液125mL，于組織搗碎機(jī)內(nèi)均質(zhì)5min，用lmol/L HCl將該混和物調(diào)pH值為9. 5，得混和液。2、將混合液溫度升至55°C攪拌預(yù)熱，并于攪拌狀態(tài)下保溫20min;然后加入0. 075g堿性蛋白酶(酶活力彡1.9X104U/g)和0. 050g中性蛋白酶(酶活力彡4. 9X IO4U/g)啟動(dòng)酶解反應(yīng)，酶解溫度為53 55°C，連續(xù)攪拌，保持反應(yīng)體系的溫度及pH恒定(溫度為53 55 °C，pH為9. 5)，酶解時(shí)間為3h。得酶解產(chǎn)物。3、將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，所述酶解液依次經(jīng)大孔樹(shù)脂脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得免疫增強(qiáng)肽。具體實(shí)驗(yàn)為①滅酶將酶解產(chǎn)物于95°C水浴中滅酶lOmin，然后冷卻至10°C ;從而終止酶反應(yīng)，接著在5000r/min下離心15min,取上清液作為酶解液。②DlOl大孔樹(shù)脂脫鹽將酶解液制成質(zhì)量濃度為10mg/ml溶液，加入到DlOl大孔樹(shù)脂層析柱，以水洗除酶解液中的鹽及雜質(zhì)，然后用70%乙醇以2. OBV/h的流速將酶解物從DlOl大孔樹(shù)脂上解吸下來(lái)，低溫((40°C )真空濃縮得酶解液濃縮液。③噴霧干燥噴霧干燥時(shí)酶解液比重為I. lg/cm3,進(jìn)行溫度應(yīng)為175 180°C,出口溫度應(yīng)為75 80°C。所得的貽貝酶解多肽經(jīng)SEC-HPLC試驗(yàn)表明酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9kDa，分子量(80 2500u)含量為90. 89%。將制得的貽貝酶解多肽做小鼠機(jī)體的免疫增強(qiáng)作用實(shí)驗(yàn)(對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響、對(duì)小鼠血清溶血素的影響和對(duì)小鼠碳廓清能力的影響)，測(cè)定方法參照徐增萊，汪瓊，趙猛等“淮山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究”[記載于《世珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥》，2007年第5期(第I8卷)第1040-041頁(yè)]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明貽貝酶解多肽能顯著增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)小鼠抗體生成、增強(qiáng)小鼠碳廓清能力，亦即貽貝酶解多肽對(duì)小鼠的體液免疫、細(xì)胞免疫功能、非特異性免疫功能都具有一定的增強(qiáng)作用。表I貽貝酶解多肽對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(n = 3)
權(quán)利要求
1.一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)以貽貝干粉作為原料，將原料與PH為9.5 10. 5的甘氨酸-NaOH緩沖液按照Ig 20ml Ig 25ml的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9. 5 10，得混合液； 2)將混合液溫度升至50 55°C攪拌預(yù)熱15 20分鐘，按原料質(zhì)量的I.0% I. 5%分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50 55°C，酶解時(shí)間2 4h ; 3)將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，再將酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得到免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中的貽貝為紫貽貝、厚殼貽貝或者翡翠貽貝。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中的緩沖液的PH為10。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的堿性蛋白酶的酶活力彡1.9X104U/g，中性蛋白酶的酶活力彡4.9X104U/g/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的滅酶處理為將步驟2)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C，并于此溫度保持10 15min，再冷卻至O 10°C以終止酶反應(yīng)，然后離心，得酶解液； 所述步驟3)中脫鹽、濃縮和噴霧干燥的具體過(guò)程為將酶解液制成濃度10mg/ml 20mg/ml的溶液，進(jìn)行大孔樹(shù)脂脫鹽；脫鹽后的酶解液在彡40°C的低溫下進(jìn)行真空濃縮，得到濃縮酶解液的比重為I. 05 I. 15g/cm3 ;濃縮酶解液在進(jìn)行溫度為160 200°C下進(jìn)行噴霧干燥，出口溫度為65 110°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中所得的貽貝酶解多肽的酶解產(chǎn)物平均分子量為385. 9Da，分子量80 2500Da的含量為90. 89%。
7.一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽片劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)以貽貝干粉作為原料，采用權(quán)利I 5中任一的酶解技術(shù)方法制備免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽； 2)將制得的酶解多肽與稀釋劑混合均勻，過(guò)60 80目篩，加入適量乙醇，將混合物制成軟材，過(guò)20 24目篩，制成顆粒狀，再在50 60°C條件下通風(fēng)干燥，再過(guò)18 22目篩，得到制片顆粒； 3)在所得制片顆粒中加入適量的崩解劑和潤(rùn)滑劑，混合均勻，最后在壓片機(jī)上壓成片齊U，包薄膜衣，即得免疫增強(qiáng)型貽貝多肽片。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述稀釋劑為微晶纖維和淀粉，所述酶解多肽與微晶纖維和淀粉按照質(zhì)量比I : 0.8 I : O. 3 O. 6混合均勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述崩解劑為干淀粉，所述潤(rùn)滑劑為滑石粉；所用干淀粉的量為制片顆粒重量的2. 5% 3. 5%，所用滑石粉的量為制片顆粒重量的1% 2%。
全文摘要
一種免疫增強(qiáng)貽貝酶解多肽及其相應(yīng)片劑的制備方法，步驟為以貽貝干粉作為原料，與緩沖液按照1∶20～1∶25的重量體積比混合、勻漿，然后調(diào)節(jié)pH值至9.5～10，得混合液；將混合液溫度升至50～55℃預(yù)熱10～15分鐘，按照原料的1.0％～1.5％分別加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解溫度為50～55℃，酶解時(shí)間2～4h；將所得的酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理，得酶解液，所述酶解液依次經(jīng)脫鹽、濃縮和噴霧干燥，得免疫增強(qiáng)酶解多肽；本發(fā)明還公開(kāi)了相關(guān)的免疫增強(qiáng)型貽貝多肽片。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，得到的免疫增強(qiáng)肽及其片劑具有較高的活性，同時(shí)原料資源豐富，具有較強(qiáng)的工業(yè)實(shí)施性。
文檔編號(hào)A61K9/20GK102952838SQ20111024664
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者王斌, 羅紅宇, 馬佳卉, 栗麗 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院