專利名稱：一種布魯氏菌活疫苗及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種布魯氏菌活疫苗及其生產(chǎn)方法，屬獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的目標(biāo)之一。目前全世界范圍內(nèi)消除該病的主要方法是撲殺與免疫相結(jié)合，對布病發(fā)生相對比較嚴(yán)重的中國，由于撲殺的成本高，疫苗預(yù)防成為本病主要控制手段。布魯氏菌疫苗免疫帶來的主要問題是無法區(qū)分疫苗免疫和自然感染的動物，這在很大程度上限制了布魯氏菌疫苗的使用和推廣，也給布病的有效防治和清除帶來了一定的難度。布魯氏菌存在光滑型( 和粗糙型(R)兩類不同表型的菌株，在凝集類抗體水平上無交叉反應(yīng)，因此用粗糙型布魯氏菌疫苗免疫的動物，其血清只與粗糙型抗原發(fā)生凝集反應(yīng)，而與光滑型血清不反應(yīng)，以此可以區(qū)分疫苗株和野毒株。最早使用過的粗糙型布魯氏菌疫苗是用45/20菌株制備的，但該菌株極不穩(wěn)定，經(jīng)常會出現(xiàn)從R型到S型的變異，造成毒力返強，因而該疫苗已基本不再使用。90年代美國科學(xué)家通過人工誘變的方法獲得了粗糙型布魯氏菌RB51菌株，該菌株具有良好的免疫力，已在美國和拉美的多個國家廣泛使用。但目前該菌株在基因水平與原始菌株之間的的區(qū)別尚為完全弄清楚。已有的研究證實布魯氏菌細(xì)胞壁脂多糖(LPS)中的0鏈組成決定了其光滑型或粗糙型的表型，0鏈的某些成分缺失，會導(dǎo)致菌株由光滑型變成粗糙型?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個與布魯氏菌光滑型表型相關(guān)的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。本實驗室曾構(gòu)建了 wbkC和wboA基因缺失的重組布魯氏菌疫苗株，并比較了它們之間的免疫效果。 其后，又進一步構(gòu)建了 wboA基因不完全缺失株，系統(tǒng)地研究了 wboA基因的不同缺失對重組菌的存活率、免疫保護性以及粗糙型表型等方面的特性，并最終確定了 wboA基因1-897之間的片段為缺失的靶片段。雖然有報告通過插入抗性基因獲得重組粗糙型布魯氏菌，但由于抗性基因?qū)е碌臐撛谏锇踩[患限制了其作為疫苗開發(fā)的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過基因同源重組和蔗糖敏感基因的負(fù)篩選技術(shù)，構(gòu)建獲得了具有生物安全意義的粗糙型布魯氏菌，以該重組菌制備的布魯氏菌活疫苗比現(xiàn)在使用的布魯氏菌S2株生產(chǎn)的布魯氏菌活疫苗具有更好的安全性，且該疫苗免疫動物后不干擾布病的臨床檢測。本發(fā)明是采用蔗糖敏感基因的負(fù)篩選技術(shù)，缺失豬布魯氏菌(Brucella suis)S2菌株(本發(fā)明又簡稱為布魯氏菌S2株)wboA基因1 897bp之間的序列，構(gòu)建重組布魯氏菌rS2- AffboA株，使原始菌株由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜植谛停揖哂辛己玫捏w內(nèi)外存活能力； 用一對特異性引物，通過PCR方法可以與非重組的原始菌相區(qū)分；用該菌株制備的布魯氏菌活疫苗免疫動物后的血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分。本發(fā)明是通過以下步驟實現(xiàn)的1.蔗糖敏感基因轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建將含有啟動子序列的蔗糖敏感基因(SucBk)通過Nde I酶克隆近pUC18載體中， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-McB。將恥(^基因(1 897位)的上、下游同源臂(L和R)的PCR產(chǎn)物分別克隆進PUC18載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-L-R。通過一對引物，以pUC-L-R為模板，將包含L和R的片段擴增后通過Ml I和Sma I克隆進pUC-McB質(zhì)粒中，獲得重組穿梭質(zhì)粒 pL-R-^cB。將重組穿梭質(zhì)粒按常規(guī)方法電轉(zhuǎn)化進布魯氏菌疫苗S2株的感受態(tài)細(xì)胞中。2.重組菌的篩選與鑒定利用pUC18載體中的氨芐抗性(AmpK)以及克隆進的蔗糖抗性(SucBk)基因進行篩選。首先用50yg/ml Amp篩選出重組菌(第一次同源重組)，重組菌在不含氨芐的TSB培養(yǎng)后，再通過5%蔗糖TSA平板篩選出丟失氨芐抗性基因和蔗糖敏感基因全的重組菌(第二次同源重組)。通過一對PCR引物，鑒定wboA基因缺失的重組菌。對獲得的重組布魯氏菌進行形態(tài)學(xué)、血清學(xué)及基因水平檢測，并對重組菌安全性、免疫保護性進行鑒定。3疫苗制備用構(gòu)建的重組菌作為疫苗生產(chǎn)菌株，按布魯氏菌活疫苗(S2株)的生產(chǎn)方法，接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成活疫苗。用于預(yù)防布魯氏菌病。
具體實施例方式本發(fā)明所涉及基因為與光滑型表型相關(guān)的布魯氏菌WboA基因。本發(fā)明所涉及基因重組技術(shù)包括利用含蔗糖敏感基因的穿梭質(zhì)粒介導(dǎo)，篩選 wboA基因缺失的重組布魯氏菌。本發(fā)明通過2次同源重組，無痕缺失了光滑型豬布魯氏菌S2株的wboA基因第 l-897bp之間的序列，最終篩選獲得了粗糙型重組豬布魯氏菌(Brucella suis)rS2株(本菌株已于2011年9月2日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 5212)。1.重組豬布魯氏菌的構(gòu)建及篩選本發(fā)明利用同源重組及蔗糖敏感基因的負(fù)篩選技術(shù)，成功構(gòu)建了 WboA基因第 l-897bp之間的序列缺失的重組布魯氏菌rS2-AffboA株，該重組菌株由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜植谛?。重組菌在培養(yǎng)基上傳20代后，遺傳性狀仍很穩(wěn)定。動物試驗表明重組菌比原始毒株 S2安全性提高10 100倍，對布魯氏菌病免疫保護性與S2相似，免疫動物后產(chǎn)生的抗體不干擾布病的臨床診斷。具體操作方法如下(I)PCR擴增wboA基因上、下游同源臂引物設(shè)計
上游同源臂引物(序列1和序列2)FffboaL 5，-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3，(含 SacI 位點)；Rffboal 5，-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3，(含 XbaI 位點)。下游同源臂引物(序列3和序列4)Fwboali 5，-ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3，(含 XbaI 位點)； Rwboali 5’ -CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3，(含 Sph I 位點)。 用!Iomega公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒(Lot :187282)，參照說明書提取布魯氏
菌S2基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板擴增wboA上、下游的基因片段。PCR反應(yīng)程序為95°C變性 5min ；95°C 50s-54°C 50s_72°C lmin，進行 30 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin。獲得的上游同源臂標(biāo)注為L，下游同源臂標(biāo)注為R。(2)構(gòu)建用于同源重組的穿梭質(zhì)粒。1) pUC-L-R質(zhì)粒的構(gòu)建將以上(1)項中PCR獲得的左側(cè)同源臂L，用McI和)(baI酶雙酶切后，克隆進同酶處理的PUC18質(zhì)粒中，按常規(guī)方法篩選重組質(zhì)粒pUC-L;將其與(1)項中PCR獲得右側(cè)同源臂R均用)(bal和SphI雙酶切后，連接、轉(zhuǎn)化，篩選重組質(zhì)粒pUC-L-R。2)穿梭質(zhì)粒pLR-McB的構(gòu)建設(shè)計引物F 5，-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3，(含 Sal I 位點)；R 5，-CA AACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3，(含 SmaI 位點)，以 pUC-L-R質(zhì)粒為模板，擴增出包含上、 下游同源臂(LR)的大小為ISOObp的序列。將該PCR產(chǎn)物用Ml I和Sma I酶切后，克隆進同酶處理的pUC-McB質(zhì)粒(本發(fā)明人實驗室構(gòu)建保存)中，獲得重組質(zhì)粒pLR-McB。(3)制備布魯氏菌S2株菌的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌將單個CFU的S2菌接種于100ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期的中期，放冰水中冷卻。12000r/min離心lOmin，棄去培養(yǎng)基，再分別用100ml、50ml、10m、5m、2ml滅菌水各離心洗滌一次。最后將獲得的菌體重懸于Iml 10%的甘油水溶液中，此即為待用的感受態(tài)細(xì)菌。(4)電轉(zhuǎn)化和篩選1)電轉(zhuǎn)化將3 μ g pLR-SacB質(zhì)粒加入到50 μ 1 S2感受態(tài)細(xì)菌中?；靹蚝筠D(zhuǎn)移到電極杯中。電擊電壓2. 5KV ；電擊時間5毫秒。電擊完成后，加入Iml SOC培養(yǎng)基(配方 1000ml培養(yǎng)基中含胰蛋白胨20g，酵母浸粉5. 0，氯化鈉0. 5，氯化鉀0. 186，氯化鎂0. 95， 硫酸鎂1. 2，葡萄糖3. 6，pH值7. 0士0. 2，25°C )，置37°C搖振培養(yǎng)4h后，將全部菌落涂布到含50 μ g/ml氨芐青霉素的TSA平板上，37°C培養(yǎng)72h。2)用于鑒定第二次同源重組成功的PCR引物
設(shè)計如下引物(序列8和序列9)405F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，(位于 WboA 閱讀框上游-44 到-28 位。)405R405 :5，-tagccgataaacacgc-3，(位于 WboA 閱讀框下游 1243 到 1258 反向互補位。)陽性重組菌的PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為40M05bp，非重組菌的PCR產(chǎn)物大小為 1302bpo3)篩選挑取平板上單個菌落(第一次重組菌)，接種到不含氨芐的TSB培養(yǎng)液中， 37°C搖振培養(yǎng)6-他，將菌液用生理鹽水進行1 10、1 100和1 1000稀釋，每稀釋度各取菌液100 μ 1涂布含5%蔗糖的TSA平板，37°C培養(yǎng)72h。挑取蔗糖平板上生長的菌落，用鑒定引物進行菌落PCR，篩選陽性重組菌。對PCR篩選獲得的陽性菌，進一步用凝集試驗驗證其粗糙型特性。提取重組菌的基因組DNA，以F405和R405為引物進行PCR，并將PCR產(chǎn)物進行克隆和序列測定，結(jié)果證實WdoA基因l-897bp之間的序列已經(jīng)缺失，獲得的重組菌命名為 rS2-AWboA。2布魯氏菌rS2菌株的特性檢查(1)形態(tài)和生化特性檢查革蘭氏染色為陰性；柯氏染色成紅色。菌體為球桿菌，單個散在，無鞭毛，不形成芽孢和莢膜，大小約0. 6 2. 5 μ m。生化試驗為硫化氫試驗陽性。(2)培養(yǎng)特性檢查重組布魯氏菌rS2_ Δ WboA株，在ρΗ 6. 4 6. 8的胰大豆瓊脂 (TAB)或其他適宜培養(yǎng)基(如馬丁湯、胰目示肉湯、肝湯等)上生長良好；靜止培養(yǎng)易出現(xiàn)沉淀，振搖后液體渾濁、不透明。(3)粗糙型特性檢查熱凝集試驗、吖啶黃凝集試驗、菌落結(jié)晶紫染色試驗結(jié)果符合粗糙型布魯氏菌的特點，即熱凝集試驗陽性，吖啶黃凝集試驗陽性，能被結(jié)晶紫染色。(4)血清學(xué)特性檢查將布魯氏菌S2株和重組布魯氏菌rS2_ Δ WboA株菌培養(yǎng)物制成抗原注射小鼠2次，間隔1個月，第二次接種1個月后采血分離血清。布魯氏菌S2株的抗血清與布魯氏菌Μ5株、IC8株、Α387株和Α19株等光滑型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陽性；與布魯氏菌rS2- Δ WboA株和Ml 11株等粗糙型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陰性；而布魯氏菌rS2_ Δ WboA 株抗血清與S2株、Μ5株、IC8株、A387株和A19株等光滑型布魯氏菌凝集反應(yīng)為陰性，與粗糙型布魯氏菌Ml 11株凝集反應(yīng)為陽性。表明rS2- Δ WboA菌株免疫小鼠后，其血清不含有對光滑型布魯氏菌的凝集類抗體。以上試驗說明重組布魯氏菌rS2_AffboA株菌免疫動物后，所產(chǎn)生的血清抗體通過凝集試驗?zāi)軌蚺c光滑型布魯氏菌感染或免疫后所產(chǎn)生的血清抗體相區(qū)別，即重組布魯氏菌rS2-AffboA株菌免疫動物后不會對布魯氏菌病血清學(xué)檢疫產(chǎn)生干擾。(5)基因特性檢查設(shè)計用于同時檢測WboA 基因的引物(F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，；R405 5’ -tagccgataaacacgc-3’)，以重組菌基因組DNA為模板，擴增結(jié)果為陽性，PCR產(chǎn)物大小為405bp ；原始菌S2對照為1302bp。(6)毒力檢查用生理鹽水將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h的培養(yǎng)物洗下，稀釋成每毫升含10億CFU菌的懸液，皮下注射體重350 400g的豚鼠5只，每只1ml。經(jīng)14 15日后剖殺，取脾臟，混合稱重，制成乳劑，接種胰際瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基平板，根據(jù)其生長的菌落數(shù)計算豚鼠脾臟的含菌量，結(jié)果每個脾臟含菌不超過20萬CFU。(7)安全檢驗將重組布魯氏菌rS2-AWx)A株活菌用生理鹽水稀釋成Iml含活菌 100億，皮下注射體重18 20g的小白鼠5只，每只0. Iml, 6日應(yīng)全部健活。(8)免疫原性用生理鹽水將重組布魯氏菌rS2-AWx)A株菌稀釋成每毫升含50億CFU菌的懸液，皮下注射體重350 400g的豚鼠10只，每只0. Iml0 30日后，用3個最小感染量的強毒布魯氏菌S1330菌株(約60個CFU)接種攻毒，攻毒后30天剖殺，取脾臟搗碎作布魯氏菌分離培養(yǎng)，80%以上的豚鼠應(yīng)無強毒出現(xiàn)。(9)遺傳穩(wěn)定性重組布魯氏菌rS2_ Δ ^fboA株在TSA培養(yǎng)基上傳30代，其形態(tài)和生化特性、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、粗糙型特性、基因特性、毒力、免疫原性沒有改變。3疫苗制備與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)疫苗制備用重組布魯氏菌rS2_ Δ WboA株作為粗糙型布魯氏菌疫苗生產(chǎn)菌株， 按布魯氏菌S2株作為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)布魯氏菌活疫苗的常規(guī)方法，接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍真空干燥制成活疫苗(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明簡稱《規(guī)程》)。用于預(yù)防布魯氏菌病。用胰大豆肉湯(TSB，美國BD公司)或用于布魯氏菌活疫苗(S2株)生產(chǎn)用培養(yǎng)基(如馬丁湯、胰肉湯、肝湯等)均可作為本發(fā)明的疫苗生產(chǎn)用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的 2%接入重組布魯氏菌rS2株種子菌液，37°C培養(yǎng)48 72h，加入獸用生物制品常用的蔗糖明膠穩(wěn)定劑，充分混勻、分裝于疫苗瓶中后立即進行冷凍真空干燥， 即成為rS2活疫苗，命名為布魯氏菌活疫苗(rS2株)。冷凍真空干燥后的疫苗應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)立即進行成品檢驗。(2)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)涉及到的相關(guān)檢驗方法按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版(三部).中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明稱《中國獸藥典》)的方法進行。1)疫苗應(yīng)為疏松團快，加入稀釋液后能迅速(Imin內(nèi))溶解；2)疫苗應(yīng)純粹無其他細(xì)菌；3)用含5億CFU活菌的疫苗接種18 20g的昆明系小白鼠，6天內(nèi)應(yīng)全部健活；4)對疫苗進行活菌計數(shù)，每頭份活菌數(shù)應(yīng)不少于800億 1000億CFU。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法。疫苗是由重組布魯氏菌rS2_ AffboA 株作為生產(chǎn)菌株。該重組菌株通過非抗性基因篩選技術(shù)，缺失布魯氏菌S2株菌WboA基因 l-897bp之間的堿基序列，使其失去了光滑型布魯氏菌細(xì)胞壁LPS結(jié)構(gòu)中0鏈形成的條件， 從而由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?。粗糙型重組菌株的安全性顯著提高，但仍保留了對布魯氏菌病良好的免疫效果。以此菌株生產(chǎn)疫苗將改變布魯氏菌疫苗免疫動物與野毒株感染動物難以區(qū)分的現(xiàn)狀，并有效提高現(xiàn)有疫苗的安全性。


圖1重組菌rS2_ Δ WboA不同代次PCR鑒定結(jié)果1 :Mareker 2000 ；2 非重組的S2 菌PCR結(jié)果；3-6. rS2-AffboA在豚鼠體內(nèi)傳代不同傳代的PCR結(jié)果。
實施例實施例1胰大豆肉湯(TSB，美國BD公司)或其它適宜培養(yǎng)基作為重組菌的培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基量加入適量的常用消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的 2%接入重組布魯氏菌rS2株種子菌液，在36 37°C逐漸加大通氣量，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)36h，，培養(yǎng)過程中可根據(jù)需要加入50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總量的1 % 2%。培養(yǎng)完成，取樣用胰大豆瓊脂按《中國獸藥典》規(guī)定的方法作純粹檢驗，為純粹。同時取樣用TSA進行活菌計數(shù)，供濃縮時參考。
將純粹檢驗合格的菌液，按總量0.2% 0.4%加入羧甲基纖維素鈉，使菌體沉淀，吸去上清液，置2 8°C保存?zhèn)溆谩Ｈ饪s的菌液按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進行純粹檢驗，為純粹。取濃縮的菌液按《中國獸藥典》規(guī)定的方法用TSA進行活菌計數(shù)，作為配苗時的參考。經(jīng)檢驗合格的菌液，按其菌數(shù)加入獸用生物制品常用的pH 7. 0蔗糖明膠穩(wěn)定劑 (《規(guī)程》)，使其最終含量為5% 10%蔗糖和 1.5%明膠；加入最終含量為 3%的硫脲。充分混勻后、按800億 1000億/ml的劑量定量分裝。分裝后疫苗瓶迅速冷凍真空干燥后即成為粗糙型布魯氏菌病活疫苗(rS2- Δ WboA株)。實施例2成品檢驗本發(fā)明涉及到的相關(guān)檢驗方法按《中國獸藥典》的方法進行(1)物理性狀疫苗應(yīng)為疏松團快，加入稀釋液后能迅速(Imin內(nèi))溶解；( 純粹檢驗疫苗應(yīng)純粹無其他細(xì)菌；(3)用含5億CFU活菌的疫苗接種18 20g的昆明系小白鼠，6天內(nèi)應(yīng)全部健活；(4)活菌計數(shù)用TSA進行活菌計數(shù)對疫苗進行活菌計數(shù)，每頭份活菌數(shù)為于800 億 1000億CFUo(5)安全檢驗將布魯氏菌活疫苗(rS2株)用生理鹽水稀釋成Iml含活菌100億 CFU，皮下注射體重18 20g的小白鼠5只，每只0. Iml, 6日應(yīng)全部健活。(6)免疫原性用生理鹽水將布魯氏菌活疫苗(rS2株)活疫苗稀釋成每毫升含50億CFU菌的懸液，皮下注射體重350 400g的豚鼠10只，每只0. Iml0 30日后，用3個最小感染量的強毒布魯氏菌S1330菌株(約60個CFU，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存和供應(yīng))接種攻毒，攻毒后 30天剖殺，取脾臟搗碎作布魯氏菌分離培養(yǎng)，80%以上的豚鼠應(yīng)無強毒出現(xiàn)。實施例3重組布魯氏菌rS2_ Δ WboA (rS2株)的PCR鑒定設(shè)計如下引物F405 :5，-aatgagctattcccgc-3，(位于 WboA 閱讀框上游-44 到-28 位)R405 5' -tagccgataaacacgc-3，(位于 WboA 閱讀框下游 1 3 到 1 8 反向互補位)。按如下PCR反應(yīng)程序進行95 "C 5min——95 °C 45sec，56 °C 45sec，
72°C lmin(30cycles)-72 °C IOmin-4 °C IOmin0 反應(yīng)結(jié)束后，取 5yL PCR 產(chǎn)物進行
電泳。重組菌的預(yù)期大小為398bp，非重組菌能擴出大小為1302bp的條帶(見圖1)。
權(quán)利要求
1.一種布魯氏菌活疫苗，其特征在于該菌苗是用一株重組豬布魯氏菌rS2株作為生產(chǎn)菌株制備的，用該菌疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分進行鑒別診斷。
2.如權(quán)利要求1所述一種布魯氏菌活疫苗，其特征在于該疫苗的生產(chǎn)菌株重組豬布魯氏菌rS2-株菌是采用非抗性篩選技術(shù)，缺失豬布魯氏菌S2菌株wboA基因1 897bp之間的序列，使原始菌株由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜植谛?，且具有良好的體內(nèi)外存活能力；用一對特異性引物，通過PCR方法可以與非重組的原始菌相區(qū)分，豬布魯氏菌rS2-株菌已于2011年9 月2日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 5212。
3.—種如權(quán)利要求1和2所述的布魯氏菌活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于用胰大豆肉湯作為重組豬布魯氏菌rS2-株菌疫苗制造用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的按 2%接入豬布魯氏菌rS2-株種子菌液，370C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)觀 38h，加入獸用生物制品常用的蔗糖明膠穩(wěn)定劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經(jīng)冷凍真空干燥，即成為布魯氏菌活疫苗(rS2株)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一布魯氏菌及其疫苗的生產(chǎn)方法。疫苗是由重組布魯氏菌rS2-ΔWboA株作為生產(chǎn)菌株。該重組菌株通過非抗性基因篩選技術(shù)，缺失布魯氏菌S2株菌WboA基因1-897bp之間的堿基序列，使其失去了光滑型布魯氏菌細(xì)胞壁LPS結(jié)構(gòu)中O鏈形成的條件，從而由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?。粗糙型重組菌株的安全性顯著提高，但仍保留了對布魯氏菌病良好的免疫效果。以此菌株生產(chǎn)疫苗將改變布魯氏菌疫苗免疫動物與野毒株感染動物難以區(qū)分的現(xiàn)狀，并有效提高現(xiàn)有疫苗的安全性。
文檔編號A61P31/04GK102327606SQ20111026167
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者丁家波, 馮忠武, 周桂蘭, 毛開榮, 王楠, 程君生, 蔣玉文, 陳光華 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所