專利名稱：Peg修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途，具體涉及制備治療病毒、細菌引起的感染藥物中的用途，尤其涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染藥物中的用途。
背景技術：
過氧化氫酶廣泛存在于各種需氧生物和一些厭氧生物中，是體內(nèi)過氧化酶體的組成之一和最標志性的酶，約占過氧化物酶體酶量的40%左右。有研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶特異高效地將過氧化氫分解成水和氧氣。在正常的生理活動中，細胞有氧呼吸所消耗的O2約10%被還原成H2O2，進而產(chǎn)生一系列活性氧自由基，而過氧化氫酶的正常生理功能就是清除體內(nèi)生成的過氧化氫，并抑制過氧化氫向其他活性氧自由基轉(zhuǎn)化。正常狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧生成和清除處在一個平衡的狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下，機體氧化還原狀態(tài)的平衡被打破，抗氧化體系受到抑制，導致機體內(nèi)過量的活性氧自由基存在，進而引起機體的氧化損傷。有研究證實，在若干病理狀態(tài)下，生物體內(nèi)的過氧化氫酶含量均有所下降，如糖尿病人體內(nèi)的過氧化氫酶含量顯著低于正常人，阿爾茨海默病病人腦內(nèi)的過氧化氫酶活力也受到抑制。還有研究表明在體外腫瘤模型中，過氧化氫酶活力的減弱是腫瘤發(fā)展進程中一個非常重要的因素。目前，有關上述方面的研究已有不少報道，如采用轉(zhuǎn)基因的方法使小鼠線粒體過氧化氫酶高表達可延長小鼠生命，延緩心臟病和白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展，減輕氧化損傷。有研究認為誘導體內(nèi)過氧化氫酶的表達可作為抗氧化治療上的一個新的途徑。有很多報導指出，外源性過氧化氫酶對疾病，尤其是氧化性疾病的進程有一定的緩解作用。研究結果證 實，小鼠靜脈注射外源過氧化氫酶極大地降低了過氧化氫誘導的脂質(zhì)過氧化，維持血液循環(huán)的過氧化氫酶活性能抑制肺部腫瘤轉(zhuǎn)移，高表達過氧化氫酶可使晶狀體上皮細胞的抗氧化耐受性增強；所述的過氧化氫酶抑制了氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)誘導的人動脈平滑肌細胞增殖。上述報道均顯示了過氧化氫酶在氧化損傷方面的研究方興未艾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供PEG修飾的重組人源過氧化氫酶新的藥物用途，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染的藥物中的用途。具體而言，本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途，其特征是將基因工程表達的人源過氧化氫酶用PEG修飾后，用于治療由氧自由基(ROS)引起的氧化損傷性疾??；所述氧化損傷性疾病具體包括病毒、細菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。本發(fā)明通過動物實驗，結果顯示，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶對病毒包括流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒，細菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷博氏菌有明顯的抑制作用。本發(fā)明中，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達并經(jīng)純化的產(chǎn)物；
所述的重組人源過氧化氫酶具有序列I的序列。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶通過下述方法制備
將人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應12h，每2h取樣一次，檢測混合物中的過氧化氫酶活力；反應完成后通過Sephacryl S-300樹脂柱，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫，分別收集修飾和未修飾得組份，進行SDS-PAGE電泳分析；所述PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，用O. 05M的PBS緩沖液溶解，O. 22um濾膜過濾。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶進行了抗氧化作用動物實驗
采用ICR小鼠(由上海伊萊克斯實驗動物有限公司提供)，流感病毒感染引起機體一系列氧化損傷，通過鼻腔給與PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，進行抗氧化試驗，檢測體重變化、死亡保護、局部病理切片，并進行抗氧化能力評價，數(shù)據(jù)均采用SPSS15. O軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結果證實，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，可有效對抗流感病毒H1NUFM1導致的急性肺炎，使肺部病毒滴度減少、抗氧化能力和動物免疫保護增強、減緩急性肺炎的病理進程，從而使肺組織損傷減輕和小鼠體重下降，最終降低小鼠的死亡率，延長存活時間。本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶可與藥學尚可接受的載體，制成藥物制齊 ，所述的藥物制劑制成鼻腔吸入劑、腹腔注射劑及外用制劑，通過鼻腔吸入給藥、腹腔給藥或外用藥等給藥方式，用于治療由氧自由基(ROS)引起的氧化損傷性疾病，具體涉及治療病毒、細菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。為了便于理解，以下將通過具體的實施方式對本發(fā)明的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。


圖I顯示了畢赤酵母表達的人源過氧化氫酶分離純化情況，其中，A為SDS-PAGE鑒定圖，I為發(fā)酵液上清硫酸銨濃縮液，2為發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨濃縮后、疏水柱脫鹽后、上柱于Q-S柱、純度已經(jīng)達80%，3為將Q-S柱分液、再經(jīng)羥基磷灰石、純度達95% ;B為westen-blot鑒定圖，I為發(fā)酵液上清濃縮液，2為Q-S離子交換柱純化后的人源過氧化氫酶，3為羥基磷灰石柱分后的人源過氧化氫酶。圖2顯示了人源過氧化氫酶的PEG修飾產(chǎn)物的分離純化情況，其中，I為未修飾的人源過氧化氫酶，2為修飾后混合物，3為上樣樣品，4為分離出的未經(jīng)修飾的人源過氧化氫酶，5為PEG修飾的人源過氧化氫酶,6為蛋白分子量標準，自上而下依次為94kD、66kD、43kD。圖3顯示了感染病毒濃度對死亡率的影響。
圖4是感染后感染病毒后體重變化曲線圖。圖5顯示了肺組織病理學分析(X 100)，其中，A為N組的肺組織切片，可觀察到完整正常的肺組織結構；B為V組的肺組織切片，重度間質(zhì)性肺炎，可觀察到嚴重的組織血管水腫，炎癥細胞浸潤和肺萎陷；(為R組的肺組織切片，無肺萎陷，但是血管周圍有炎癥細胞浸潤；D為C組的肺組織切片，輕度肺萎陷，血管周圍有炎癥細胞浸潤；E為H組的肺組織切片，肺萎陷有所改善，組織結構大體完整；F為M組的肺組織切片，肺萎陷有所改善，但是血管周圍有嚴重的炎癥；G為L組的肺組織切片，嚴重細胞浸潤和肺萎陷肺病變基本無改善。圖6是病毒血凝滴度測定圖，其中，與V組相比，p〈0. 05，**: p〈0. 01。圖7顯示了抗氧化能力，其中，A為各組肺組織過氧化氫酶活力，與V組相比，p〈0. 05 ;B為各組清除超氧陰離子和超氧自由基能力，與V組相比，p<0.05, p<0.01 ；C為各組MDA含量，與V組相比，p<0. 05,林:ρ〈0·01。
圖8是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力比較圖，與V組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。圖9顯示了對免疫系統(tǒng)的保護，其中，A為各組肺指數(shù)比較，與V組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0.01 ;Β 為各組胸腺指數(shù)比較，與 V 組相比，ρ〈0·05，**: ρ〈0·01。
具體實施例方式實施例I PEG修飾的重組人源過氧化氫酶對流感病毒所致急性肺炎的作用 I、PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的制備
采用畢赤酵母表達的人源過氧化氫酶，將發(fā)酵液4°C離心，收集上清，用硫酸銨沉淀粗酶液，然后依次上苯基纖維素疏水柱、Q-Sepharose FF和羥基磷灰石，獲得95%純度的目的蛋白，將純化的人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應2h，將修飾反應混合物取適當?shù)牡鞍琢可蠘佑陬A先裝好的Sephacryl S-300樹脂,用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫,流速lml/min ;核酸蛋白檢測儀于280nm處監(jiān)測洗脫液蛋白含量，并用自動收集儀收集各流分，進行SDS-PAGE電泳分析；收集的PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PEG修飾的重組人源過氧化氫酶鼻腔滴劑的制備
將冷凍干燥的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶用O. 05M的PBS緩沖液溶解，O. 22um濾膜過濾，備用。3、動物實驗
實驗動物采用ICR小鼠，體重16-18g;病毒株采用流感病毒Al (HlNl)鼠肺適應株FMl。流感病毒感染小鼠將小鼠雌雄各隨機分組，設正常對照組(N組)、病毒對照組(V組)、未修飾人源過氧化氫酶組(C組)、利巴韋林組(R組)、PEG修飾的人源過氧化氫酶高中低(H、M、L)三組。病毒組和給藥組小鼠用乙醚麻醉后鼻腔感染STCID5tl病毒；感染后2h開始第一次給藥，一天給藥兩次，共給藥4天；第五天殺剖，采血和取肺。4、檢測指標病毒TCID5tl體重變化、死亡率、肺部病理，并進行抗氧化能力評價。(I)感染和給藥后各組小鼠體重和死亡率變化
如圖4所示，感染和給藥后，每天稱量各組中小鼠的體重，結果顯示，正常小鼠體重隨時間的延長日漸上升，病毒感染組體重明顯下降；結果表明，PEG修飾的人源過氧化氫酶對抑制體重下降及死亡率的作用具有量效關系。( 2 )肺指數(shù)和肺病變率
結果如表I所示，正常組小鼠肺部無病變，肺指數(shù)較??；病毒感染后各組肺指數(shù)均顯著上升，平均肺重增至正常水平的3倍。肺部病理學評分，病毒感染后第5天，肺部平均淤血面積超過了總表面積的75%。結果表明，所述PEG修飾的人源過氧化氫酶能顯著緩解肺部淤血水腫等病變，將病變區(qū)域面積減少至50%以下，顯示出了劑量依賴性。表I
權利要求
1.PEG修飾的重組人源過氧化氫酶在制備治療病毒、細菌引起的感染藥物中的用途，所述的重組人源過氧化氫酶具有序列I的序列。
2.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的感染是病毒、細菌及燒傷感染引起的急性肺炎及燒傷感染。
3.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的病毒選自流感病毒、SARS病毒、呼吸道合胞病毒或冠狀病毒。
4.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的細菌選自金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌或肺炎克雷博氏菌。
5.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達并經(jīng)純化的產(chǎn)物。
6.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的藥物制成鼻腔吸入劑、腹腔注射制劑或外用制劑。
7.按權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶通過下述方法制備 采用畢赤酵母表達的人源過氧化氫酶，將發(fā)酵液4°C離心，收集上清，用硫酸銨沉淀粗酶液后，依次上苯基纖維素疏水柱、Q-Sepharose FF和羥基磷灰石，獲得95%純度的目的蛋白，將純化的人源過氧化氫酶和活化的PEG 5000以一定的摩爾比投入到硼酸緩沖液，4°C混合均勻后攪拌反應2h,將修飾反應混合物取適當?shù)牡鞍琢可蠘佑陬A先裝好的SephacrylS-300樹脂，用20mmol/L的pH 7.0的PBS洗脫，流速lml/min ;核酸蛋白檢測儀于280nm處監(jiān)測洗脫液蛋白含量，并用自動收集儀收集各流分，進行SDS-PAGE電泳分析；收集的PEG修飾的人源過氧化氫酶透析后分裝入滅菌的安培瓶，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及PEG修飾的重組人源過氧化氫酶的藥物用途。本發(fā)明中，所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶，為經(jīng)PEG修飾、DNA序列為人源過氧化氫酶cDNA在畢赤酵母中表達并經(jīng)純化的產(chǎn)物；其可有效對抗流感病毒H1N1、FM1導致的急性肺炎，使肺部病毒滴度減少、抗氧化能力和動物免疫保護增強、減緩急性肺炎的病理進程，降低死亡率，延長存活時間。本發(fā)明所述的PEG修飾的重組人源過氧化氫酶可制成鼻腔吸入劑、腹腔注射制劑或外用制劑，用于治療病毒、細菌及燒傷等感染引起的急性肺炎及燒傷感染。
文檔編號A61P17/02GK102772789SQ20111011988
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權日2011年5月10日
發(fā)明者馮美卿, 史訓龍, 葉麗, 周偉, 周珮, 施志惠, 朱海燕, 李繼楊, 黃海 申請人:復旦大學