專利名稱：Rgd-脂肪胺系列化合物作為腫瘤靶向載體材料的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及靶向載體材料的制備，尤其涉及針對脂溶性藥物靶向給藥體系的構 建方法，本發(fā)明還涉及藥物載體在制備靶向給藥制劑中的應用，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
惡性腫瘤的生長和轉移是一個復雜的多步驟多環(huán)節(jié)的過程，而大多均與整合素 表達異常或分子結構改變相關。整合素是一類跨膜蛋白大家族，由a、 ^兩種亞基構 成異二聚體。目前發(fā)現(xiàn)a約有18種，/3約有8種，至少有24種異二聚體的整合素形式。 整合素在腫瘤的進展可能具有兩重性l)腫瘤發(fā)生早期，整合素表達降低可致瘤細 胞與基底膜或ECM成分的粘附作用減弱，從而有利于腫瘤在局部生長與擴散；2)瘤 細胞進入血循環(huán)后，整合素表達增高有利于瘤細胞粘附于血管內(nèi)皮，繼而定位增殖。 整合素在腫瘤細胞表面的表達高于正常細胞是公認的事實。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp， RGD)是整合素特異識別序列片 段，RGD三肽及修飾物通過與整合素特異結合，具有阻止腫瘤細胞定位增殖、抗腫
瘤新生血管生成作用。其中，ov/33整合素能與多種細胞外基質分子結合，其中包括纖 粘連蛋白、纖維蛋白原和玻璃體連接蛋白等而發(fā)揮相應生物作用。而整合素al、 a6、
01、 /34亞單位在乳腺上皮組織的表達減少與腫瘤的形成相關。
納米載藥系統(tǒng)是直徑50 1000nm的球型脂質雙層，組成成分靈活，可以制成種 類、大小、表面特征不同的多種類型，作為生物活性物質的有效運輸載體。
普通納米載藥系統(tǒng)不具有靶向性?？梢栽诩{米級載藥系統(tǒng)表面結合抗體、配體， 利用腫瘤細胞與正常細胞表面表達的抗原或受體的差異，通過抗原、抗體和受體、 配體的特異性作用增加脂質體的主動靶向性，從而提高治療指數(shù)。
抗腫瘤藥物的主動靶向性制劑將是改進抗腫瘤藥物制劑的新趨向。為了使載體 系統(tǒng)具有特異靶向性，可將各種活性物質耦聯(lián)到載體表面。受體介導的靶向策略是 解決載體系統(tǒng)靶向性途徑之一。借助這種特異性相互作用可將載有各種抗腫瘤藥物
3的載體系統(tǒng)靶向到含有特異性受體的器官、組織或細胞；同時受體與配體結合可促 進載體系統(tǒng)內(nèi)藥物釋放到細胞內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有兩親性的整合素受體靶向錨點化合物及其 制備方法；
本發(fā)明的目的之二是提供一種含有上述錨點化合物的耙向藥物載體及其制備方
法；
本發(fā)明的目的之三是將上述的靶向藥物載體應用于裝載脂溶性的抗腫瘤藥物， 制備得到主動靶向性的抗腫瘤藥物制劑組合物。
本發(fā)明上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的 一種具有兩親性的整合素受體靶向錨點系列化合物，結構如下
<formula>formula see original document page 4</formula>
其分子式為Arg-Gly-Asp-NHCnH2n+1，其中，n代表不同長鏈脂肪胺的碳數(shù)， 分別為8， 10， 12， 14， 16。
將Arg-Gly-Asp分別與不同烷基脂肪鏈進行綴合，即制備得到上述系列化合物。 本發(fā)明的化合物的制備方法，包括以下步驟 (1)按照常規(guī)液相接肽技術分別合成RGD;
(2 )將保護基保護的Arg-Gly-Asp分別與CH3(CH2)6CH2NH2 、 CH3(CH2)8CH2NH2、 CH3(CH2)10CH2NH2、 CH3(CH2)12CH2NH2、 CH3(CH2)14CH2MH2
偶聯(lián)，脫去保護基，即得。本發(fā)明的含有錨點化合物的靶向藥物載體，選自脂質體、納米?；蛭⑷椤?yōu)選 脂質體。
本發(fā)明的含有靶向藥物載體的藥物制劑組合物，其中所述藥物選自脂溶性藥 物。優(yōu)選多西紫杉醇。
本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選脂質體多西紫杉醇制劑。
本發(fā)明的藥物制劑組合物，其組成為脂溶性藥物占摩爾百分比0.5-30%;普通 藥物載體和錨點化合物的混合物占摩爾百分比70-99.5%，該混合物中，普通藥物載 體占摩爾百分比80 — 99%，錨點化合物占摩爾百分比1一20%。
本發(fā)明的靶向藥物載體(如脂質體)；由一般載體材料和本發(fā)明的錨點化合物 組成，其中優(yōu)選的，各組分按照不同摩爾百分比組成 一般載體材料80 — 99%，整 合素受體靶向錨點化合物1 一20% 。
本發(fā)明的抗腫瘤藥物制劑組合物，是將脂溶性藥物(例如抗腫瘤藥物多西紫 杉醇等)與一般載體材料、整合素受體靶向錨點化合物按照不同制劑技術進行制備， (例如抗腫瘤藥物多西紫杉醇靶向脂質體);優(yōu)選的，脂溶性藥物占靶向藥物載體(天 然卵磷脂和整合素受體耙向錨點化合物)的摩爾百分含量為0.5-30%。
優(yōu)選的， 一種制備抗腫瘤藥物靶向制劑的方法，包括
(1) 按以下摩爾百分比取各組分抗腫瘤藥物0.5-30%;普通藥物載體(如磷
脂，膽固醇等)和本發(fā)明的整合素受體靶向錨點化合物的混合物70-99.5%，該混合 物中，普通藥物載體(如卵磷脂)80_99% (摩爾百分比)，本發(fā)明的整合素受體靶 向錨點化合物1一20% (摩爾百分比)；
(2) 將上述各組分按藥物制劑的常規(guī)方法制備，得到抗腫瘤藥物制劑組合物。 所制備的靶向藥物制劑的粒徑為20-1000nm, Zeta電位為-70 70mV。 以上所述抗腫瘤藥物選自
多西紫杉醇
普通藥物載體材料選自
卵磷脂
本發(fā)明的錨點化合物具有優(yōu)秀的靶向性能，在藥物傳遞系統(tǒng)中引入錨點化合物，
可將藥物導向腫瘤局部。整合素分子主要通過識別RGD三肽序列來介導細胞之間及 細胞與細胞外基質之間的黏附反應。但是RGD肽存在易被酶解，半衰期短等缺點。為了克服這些缺點，本發(fā)明將不同碳數(shù)烷基脂肪鏈與RGD肽段相綴合，對其進行疏 水性修飾，合成了具備兩親性的不同烷基脂肪鏈和RGD肽綴合物，艮口 RGD-NH(CH2)7CH3,RGD-NH(CH2)9CH3， RGD-NH(CH2)nCH3， RGD-NH(CH2)13CH3 和RGD-NH(CH2)uCH3該綴合物穩(wěn)定性強，不易被酶降解。
多西紫杉醇抗腫瘤療效顯著，但其水溶性低，口服生物利用度差，現(xiàn)有的多西 紫杉醇注射液易引起過敏反應。由于不同碳數(shù)垸基脂肪鏈與RGD肽段的綴合物具 有疏水脂肪鏈，可插于質膜上，對藥物載體進行修飾，制成靶向藥物載體。因此本 發(fā)明將兩親性RGD偶聯(lián)物引入含有抗腫瘤藥物(如多西紫杉醇)的藥物傳遞系統(tǒng) 制備得到多西紫杉醇靶向制劑(如多西紫杉醇靶向脂質體)。該靶向制劑系統(tǒng)可以增 加抗腫瘤藥物在耙部位的濃度并可減少其在非靶部位的毒副作用，提高藥物的治療 指數(shù)。
本發(fā)明以荷肉瘤S180小鼠為模型，采用種瘤后l， 3， 5， 7天尾靜脈給藥的治療
方案評價了本發(fā)明所制備的多西紫杉醇靶向脂質體制劑的抗腫瘤活性，結果顯示多 西紫杉醇靶向脂質體比各對照組具有更優(yōu)異的抗腫瘤活性。
本發(fā)明的化合物和現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點
現(xiàn)有對RGD三肽進行了結構修飾，但其合成步驟繁瑣，本發(fā)明在保留RGD三 肽這個整合素特異識別序列片斷的基礎上，迸行疏水結構的改造，使其具有雙親性。 這樣不僅簡化了結構，降低了成本，同時還具有很好的靶向效果。
具體實施例方式
為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的， 它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應當理解為對本發(fā)明的限制。 實施例1 Boc-Arg(N02)-Gly-OMe的制備
將1.595g (5.0醒ol)Boc-Arg(N02)-OH溶于20ml無水DMF，冰浴條件下，加 入0.675g(5mmol)N-羥基苯并三氮唑(HOBt)，并使完全溶解。10分鐘后加入 1.236g(6mmo1) 二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)。得到反應液(1)，待用。冰浴下把 0.628g(5.0mmol)HCL-Gly-OMe (5mmol)溶于20mlTHF中，然后加入lmlN-甲基嗎啉 (NMM)，調pH8-9。攪拌35分鐘，得到反應液(11)，待用。冰浴下把反應液(I) 加入反應液(n)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫攪拌12h， TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示 Boc-Arg(N02)-OH消失。濾除二環(huán)己基脲(DCU)，濾液吹去DMF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5XNaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5 XKHS04水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5%NaHC03水溶液洗和飽和NaCl水溶 液洗。乙酸乙酯層用無水Na2S04干燥、過濾、濾液減壓濃縮至干，得到2.948g(100 %)粗產(chǎn)物，為米黃色固體。硅膠柱純化后得1.405g (72.1%)白色純標題化合物。 (ESI-MS(m/z): 391.6[M]+) 實施仔i]2 Boc-Arg(N02)-Gly-OH的制備
將0.780g(2.0mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OMe溶于10ml甲醇。冰浴下用NaOH(2N) 水溶液調pH至10-11并攪拌4h， TLC(氯仿/甲醇,10:1)顯示Boc-Arg(N02)-Gly-OMe 消失。反應混合物用飽和KHS04調pH至7，減壓濃縮除甲醇。殘留物用飽和KHS04 調pH至2、用乙酸乙酯萃取(30mlx3)。合并的乙酸乙酯相，用飽和NaCl水溶液洗 至中性，無水Na2S04干燥。過濾，濾液減壓濃縮至干，得0.591g (78.7%)標題化 合物，為白色固體。(ESI-MS(m/z):375.3[M]-) 實施例3
1) Boc-Asp(OBzl)陽NHCH2(CH2)6CH3的制備 一
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法，1.615g(5mmol)Boc- Asp(OBzl)-OH和 0.541g(4.5 mmol) CH3(CH2)6CH2NH2制得1.918g (98.2%)米黃色固體粗品，硅膠 柱純化得U92g (61.0%)標題化合物，為白色固體。(ESI-MS(m/z):435.7[M]+ )
2) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備
將0.868g(2.0mmo1) Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3溶解在10 ml 4mo1/1氯化 氫-乙酸乙酯溶液中，室溫攪拌4小時，TLC(氯仿/甲醇，5:1)顯示原料點消失，減 壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復加少量乙醚進行減壓抽干以除去氯化氫氣。最后 加少量乙醚將殘留物研磨成0.632g (94.7%)標題化合物，為白色固體粉末，直接 用于下一步反應。(ESI-MS(m/z): 335.5[M]+)
3) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法，0.752g(2.0mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OH禾D 0.601g(l,8mmol)HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3制得1.204g (96.7%) 粗品，為米黃色固體，硅膠柱純化后得0.387g標題化合物，為白色固體 (ESI-MS(m/z):693.5[M]+)
4) Boc-Arg- Gly-Asp-NH-CH2(CH2)6CH3的制備
7將0.138g(0.2mmo1) Boc-Arg(N02)-Gly陽Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH置于50ml茄 形瓶中、用適量乙醇溶解、加28mgPd/C (5%)、通H2 (0.02Mba)，室溫攪拌至原料 點消失。濾除Pd/C、濾液減壓濃縮至干，殘留物反復用石油醚研磨，得0.104g (94.0 %)標題化合物，為無色油狀物。(ESI-MS(m/z):558.4[M]+ ) 5) HCl'Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，從0.104g (0,2mmol) Boc-Arg-Gly-NH-CH2(CH2)6CH3制得0.087g (96%)標題化合物，為淡黃色固體。 ESI-MS(m/z): 458.3[M]-， Mp.85.7 86,.8。C ， [a]D20=+6.67 (c=l，CH3OH)。 實施例4
1) Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由1.595g(5mmol)Boc-Asp(Bzl)-OH和 0.708g(4.5 mmol) CH3(CH2)8CH2NH2制得l,887g (100%)淡黃色固體，經(jīng)硅膠柱純化 得1.135g(64.7。/。)標題化合物,為白色固體粉末。(ESI-MS(m/z):463.7[M]+)
2) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法從0.780g (2.0mmol) Boc -Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3制得0,701g (96.9% )標題化合物，為白色粉末狀固體。 (ESI-MS(m/z): 363.6〔M]+)
3) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由0.752g(2.0mmo1) Boc-Arg(N02)-Gly-OH和0.724g(2.0mmo1) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3制得1.44g(100。/o)淡黃 色油狀粗品，經(jīng)硅膠柱純化得0.658g(47y。)標題化合物,為無色油狀物。(ESI -MS(m/z) :721.4[M]+)
4) Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)8CH3的制備
按照Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.150g(0.2mmol)Boc -Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)8CH3的制得0.114g (93.5%)標題化合物,為無 色油狀物。(ESI-MS(m/z):586.3 [M]+)
5) HCl'Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)8CH3的制備
按照HCl.Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，從0.114g (0.2mmol) Boc-Arg-Gly-NHCH2(CH2)8CH3 制得0.094g ( 97 % )標題化合物，為米黃色固體。ESI墨MS(m/z): 486.3[M]+ ， Mp.90.1 91.3。C ， [<20=+17.11 (c=l，CH3OH)。 實施例5
1) Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)K)CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由1.595g(5mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和 0.834g(4.5mmol)CH3(CH2)n)CH2NH2制得2.790g (100%)粗品，為淡黃色固體。經(jīng)硅 膠柱純化得1.67g(68.2。/。)標題化合物。(ESI-MS(m/z):491.5[M]+)
2) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2),。CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法從0.98g (2.0mmol) Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)10CH3制得0.764g (98%)標題化合物，為白色粉末狀 固體。(ESI-MS(m/z): 391,6[M]+)
3) Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)10CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由0.78g(2.0mmol)Boc-Arg(NO2) -Gly-OH和0.764gHCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2),oCH3制得1.336g(9P/o)粗品，經(jīng)硅膠 柱純化得0.671g(46。/。)標題化合物，為無色油狀物。(ESI-MS(m/z):749.5[M]+)
4) Boc-Arg- Gly-Asp-NHCH2(CH2)10CH3的制備
按照Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.150g(0.196mmo1) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)1()CH3的制得0.106g (88%)標題化合物,為 無色油狀物。(ESI-MS(m/z):614.4[M]+)
5) HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-麗CH2(CH2)K)CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-MHCH2(CH2)6CH3的制備方法，從0'106g (0.17mmo1) Boc-Arg-Gly-NHCH2(CH2)1()CH3制得0.081g (93%)標題化合物，為米黃色固體。 ESI-MS(m/z): 514.4[M]+， Mp.96.7 98.7。C ， [a]D2。=+14.62 (c=l,CH3OH)。 實施例6
1) Boc墨Asp(OBzl)-NHCH2(CH2;h2CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由1.595g (5mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和 0.960g(4.5mmo1) CH3(CH2)12CH2NH2制得2.596g (100%)粗品,為淡黃色固體。經(jīng)硅膠 柱純化得1.65g(71。/。)標題化合物，為白色固體粉末。(ESI-MS(m/z):519.8[M]+)
2) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-MHCH2(CH2)6CH3的制備方法從1.038g (2.0mmol)
9Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3制得0.879g (96.1%)標題化合物，為白色粉末狀 固體。(ESI-MS(m/z): 419.7[M]+)
3) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法，0.750g(2,0mmol)Boc-Arg(NO2) -Gly-OH禾B 0.836g(2.0mmol)HCl'Asp(OBzl)陽NHCH2(CH2;h2CH3制得L583g (100%) 粗品，為淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱純化得0.667(43y。)g標題化合物，為無色油狀物。 (ESI-MS(m/z):777.9[M]+)
4) Boc-Arg- Gly-Asp- NHCH2(CH2)12CH3的制備
按照Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.150g(0.19mmol)Boc -Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3的制得0.11 lg (92.0%)標題化合物,為無 色油狀物。(ESI-MS(m/z):642.5[M]+)
5) HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.1 llg (0.17mmol) Boc-Arg-Gly-NHCH2(CH2)12CH3制得0.087g (94.4%)標題化合物，為米黃色固體。 ESI-MS(m/z): 542.5[M]-， Mp.l25.3~127.10C ， [a]D20=+18.22 (c=l，CH3OH)。 實施例7
1) Boc-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2),4CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法，1.595g(5mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和 1.085g(4.5 mmol) 013(012)14012服2制得2.300g (93.6%)粗品，為黃色固體。經(jīng)硅 膠柱純化得1.69g(69。/。)標題化合物，為無色油狀物。(ESI-MS(m/z):547.6[M]+)
2) HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3的制備
按照HCl'Asp(QBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法'1.092g (2.0mmol) Boc-Asp (OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3制得0.871g (97.7%)標題化合物，為白色固體粉末。 (ESI-MS(m/z): 447.6[M]+)
3) Boc-Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由，0.750g(2.0mmo1) Boc-Arg(N02) -Gly-OH禾卩0.803g(1.8mmol)HCl.Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3制得1.57g(100。/。)粗 品，為淡黃色油狀物，經(jīng)硅膠柱純化得0.680g(47y。)標題化合物,為無色油狀物 (ESI-MS(m /z):806.2[M]+)4) Boc-Arg- Gly-Asp-NHCH2(CH2)14CH3的制備
按照Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.150g(0.19mmol)Boc -Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3的制得0.121g (95.6%)標題化合物,為無 色油狀物。(ESI-MS(m/z):670.8 [M]+)
5) HCl'Arg(N02)-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)14CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.121g(0.18mmo1) Boc-Arg-Gly-NHCH2(CH2)14CH3制得0.099g (97.2%)標題化合物，為米黃色固體。 ESI-MS(m/z): 570.7[M]+， Mp.l31.6 133.9。C ， [a]D20=+7.27 (c=l，CH3OH)。 實施例8
1) Boc-Gly-Gly-OH的制備
0.875g(5mmol)Boc-Gly溶解于無水THF，加入0.810g(5.5mmol)N-羥基琥珀酰亞 胺(HOSu)，冰浴下加1.34gDCC，反應12h后，過濾DCU，減壓去除THF，用50ml 乙酸乙酯溶解，飽和NaHC03水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，無水NaS04干燥。 過濾NaS04，減壓去除乙酸乙酯，用THF溶解。0.377g(5mmol)Gly溶解于10ml蒸 餾水，滴加入THF反應液中，NMM調pH至8-9，反應過夜。減壓去除THF,飽和 KHS04調pH至2，乙酸乙酯萃取(30mlX3)，飽和NaCl隨后溶液洗3次，無水 NaS04干燥過夜。過濾，減壓去除乙酸乙酯，制得0.650g (56.0%)標題化合物， 為白色粉末狀固體。(ESI-MS(m/z): 231.1[M]—)
3) Boc-Gly-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)1C)CH3的制備
按照Boc-Arg(N02)Gly-OMe的制備方法由0.464g(2.0mmo1) Boc-Gly-Gly-OH和 0.702g(2.0mmol)HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3制得1.021g(93.9。/。)粗品，經(jīng)硅膠 柱純化得0.576g(54。/。)標題化合物，為無色油狀物。(ESI-MS(m/z)605.2[M]+)
4) Boc-Gly-Gly-Asp-NHCH2(CH2)12CH3的制備
按照Boc-Arg-Gly-Asp-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法由0.150g(0.25mmo1) Boc-Gly-Gly-Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)12CH3制得0.123g (95.5%)標題化合物,為無色油狀 物。(ESI陽MS(m/z)515.4[M]-)
5) HCl'Gly-Gly-Asp-NHCH2(CH2)10CH3的制備
按照HCl'Asp(OBzl)-NHCH2(CH2)6CH3的制備方法，0.123g (0.24mmol) Boc-Gly-Gly-Asp-NH-CH2(CH2)K)CH3制得0.092g (93.4%)標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z):415.2[M]+， Mp.99.7 101.2。C ， [a]D20=+8.89 (c=l,CH3OH)。 實施例9含RGD-NHCH2(CH2)wCH3脂質體(D)的制備
薄膜分散法制備，取磷脂(80_99%， n/n)及所需RGD綴合物 RGD-NHCH2(CH2)14CH3 (1—20%， n/n)至圓底燒瓶中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除 溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量的PBS磷酸鹽緩沖液(O.Ol mol/L)， 30 。C超聲分散20 min。得具乳光的脂質體溶液，粒徑100 300nm， Zeta-Potential —20—25mV 。 實施例10含多西紫杉醇脂質體(F)的制備
薄膜分散法制備，取磷脂(80 — 99%, n/n)和所需多西紫杉醇(0.5 — 30%， n/n)至圓底燒瓶中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質 膜，加入所需量的PBS磷酸鹽緩沖液(O.Ol mol/L)， 30 。C超聲分散20 min。得具乳 光的脂質體溶液，粒徑100~200nm， Zeta-Potential-25—60mV。
實施例ll含RGD-NHCH2(CH2)6CH3與多西紫杉醇脂質體(G)的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和RGD-NHCH2(CH2)6CH3的 混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80—99% (摩爾百分比)，整合素受體 靶向錨點化合物1_20% (摩爾百分比)；
參照實施例1的制備方法，取磷脂和RGD-NHCH2(CH2)6CH3及所需多西紫杉醇 至圓底燒瓶中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜， 加入所需量的PBS磷酸鹽緩沖液(O.Ol mol/L)， 30GC超聲分散20min。得具乳光的 脂質體溶液，粒徑100 250nm， Zeta-Potential-10—70mV。
實施例12含RGD-NHCH2(CH2)8CH3與多西紫杉醇脂質體(H)的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和RGD-NHCH2(CH2)sCH3的 混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80_99% (摩爾百分比)，整合素受體 耙向錨點化合物1一20% (摩爾百分比)；
參照實施例1的制備方法，取磷脂、多西紫杉醇和RGD-NHCH2(CH2)8CH3至圓 底燒瓶中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入 所需量的PBS磷酸鹽緩沖液(O.Ol mol/L)， 30 °C超聲分散20 min。得具乳光的脂質
12體溶液，粒徑100 250nrn， Zeta-Potential —10—70mV。
實施例13含RGD-NHCH2(CH2)1()CH3與多西紫杉醇脂質體(I)的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和RGD-NHCH2(CH2)1C)CH3 的混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80 — 99% (摩爾百分比)，整合素受 體靶向錨點化合物1_20% (摩爾百分比)；
薄膜分散法制備，取磷脂、多西紫杉醇和RGD-NHCH2(CH2)K)CH3至圓底燒瓶 中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量 的PBS憐酸鹽緩沖液(O.Ol mol/L)， 30。C超聲分散20mm。得具乳光的脂質體溶液， 粒徑100 250nm， Zeta-Potential—10—70mV。
實驗例14含RGD-NHCH2(CH2h2CH3與多西紫杉醇脂質體(J)的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和RGD-NHCH2(CH2)!2CH3 的混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80_99% (摩爾百分比)，整合素受 體靶向錨點化合物1_20% (摩爾百分比)；
薄膜分散法制備，取磷脂、多西紫杉醇和RGD-NHCH2(CH2)12CH3至圓底燒瓶
中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量 的PBS磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L)， 3(TC超聲分散20min。得具乳光的脂質體溶液， 粒徑100 250nm， Zeta-Potential — 10—70mV。
實驗例15含RGD-NHCH2(CH2;h4CH3與多西紫杉醇脂質體(K)的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和RGD-NHCH2(CH2)14CH3 的混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80_99% (摩爾百分比)，整合素受 體耙向錨點化合物1一20% (摩爾百分比)；
薄膜分散法制備，取磷脂、多西紫杉醇和RGD-NHCH2(CH2)14CH3至圓底燒瓶 中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量 的PBS磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L)， 30。C超聲分散20min。得具乳光的脂質體溶液, 粒徑100~250nm， Zeta-Potential—10~—70mV。
實施例16含GGD-NHCH2(CH2)1()CH3與多西紫杉醇脂質體(L)的制備各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂和GGD-NHCH2(CH2;h()CH3 的混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80—99% (摩爾百分比)，整合素受 體靶向錨點化合物1—20% (摩爾百分比)；
薄膜分散法制備，取磷脂、多西紫杉醇和GGD-NHCH2(CH2)wCH3至圓底燒瓶 中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量 的PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L), 30 °C超聲分散20 min。得具乳光的脂質體溶液， 粒徑100 250nm， Zeta-Potential — 10—70mV。
實施例17含RGD-NHCH2(CH2)K)CH3、長循環(huán)膜材DSPE與多西紫杉醇脂質體(O) 的制備
各組分的用量多西紫杉醇0.5-30%;天然卵磷脂、RGD-NHCH2(CH2)wCH3與 DSPE-mPEG2000的混合物70-99.5%，該混合物中，天然卵磷脂80—99% (摩爾百 分比)，整合素受體靶向錨點化合物1一20% (摩爾百分比)；
薄膜分散法制備，取磷脂、多西紫杉醇和RGD-NHCH2(CH2)1QCH3至圓底燒瓶 中以氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，在瓶壁形成一層干燥透明的質膜，加入所需量 的PBS磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L)， 30。C超聲分散20min。得具乳光的脂質體溶液， 粒徑100~250nm， Zeta-Potential—10—70mV。
實驗例18含RGD-NHCnH2n+1(n=8，10,12,14，16)與多西紫杉醇脂質體的對S180腹水 小鼠的治療作用
取腹腔接種S,8o腹水瘤第八天的ICR種小鼠一只，脫頸椎處死，用75%酒精消 毒后置于超凈臺內(nèi)，用鑷子夾起腹部中線偏右的皮膚并用小剪刀剪一小口至可見乳 白色腹水流出。將吸管由開口處輕輕插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到裝有約3ml 滅菌生理鹽水的15ml的離心管中，使體積增至約10ml。用吸管輕輕吹氣，使腹水 與生理鹽水混勻。試管加蓋，1000轉/分離心5分鐘。棄去上清液后，加9ml滅菌 生理鹽水，用吸管輕輕吹氣，使瘤細胞均勻浮起，試管加蓋，1000轉/分離心5分鐘, 棄去上清液。試管底部有的乳白色的膠狀物。往試管底部的乳白色膠狀物中加9ml 滅菌生理鹽水，用吸管輕輕吹氣，使瘤細胞均勻浮起。取100 pi該懸浮液加至9.9 ml 滅菌生理鹽水中，混勻，得100倍稀釋液，混勻，加蓋，放入冰中待用。取IOO /il上述瘤細胞稀釋液置入Eppendoff小管中，加100 pi臺盼蘭染液，混勻。取少許該 混勻液加至計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi)，于顯微鏡下計算4個大格中被染上藍色的存活瘤細 胞的個數(shù)。將原液中的存活瘤細胞稀釋成2.0"07個/1111，用于接種。在無菌條件下 用lml腹水瘤細胞接種液，用2%碘酒棉球和75%酒精棉球在雄性昆明種小鼠右側 腋下消毒。并注入0.2ml瘤細胞液，緩緩抽出針頭。按此方法給每批昆明種小鼠接 種，隨機分組，放入動物室詞養(yǎng)。
藥物配制.-本實驗共設14組A.PBS溶液組；B.0.5M CMC-Na的PBS組C. 空白脂質體組；D.含RGD的空白脂質體組(實施例9所制備)；E.多西紫杉醇混懸液 組；F.多西紫杉醇脂質體(實施例IO所制備)組；G膜材中含有RGD-NH(CH2)7CH3 的多西紫杉醇脂質體(實施例ll所制備)組；H,膜材中含有RGD-NH(CH2)9CH3的 多西紫杉醇脂質體(實施例12所制備)組；L膜材中含有RGD-NH(CH2)nCH3的多 西紫杉醇脂質體(實施例13所制備)組；J.膜材中含有RGD-NH(CH2;h3CH3的多西 紫杉醇脂質體(實施例14所制備)組；K』莫材中含有RGD-NH(CH2;h5CH3的多西紫 杉醇脂質體(實施例15所制備)組；L.膜材中含有GGD-NH(CH2)nCH3的多西紫杉 醇脂質體(實施例16所制備)組；M.膜材中含有RGD-NH(CH2)uCH3的小劑量多 西紫杉醇脂質體(實施例12所制備)組；N.膜材中含有小劑量RGD-NH(CH2)uCH3 的多西紫杉醇脂質體(實施例12所制備)組。O.膜材中含有RGD-NH(CH2)nCH3 及長循環(huán)膜材DSPE的多西紫杉醇脂質體(實施例17所制備)組。
藥物混懸液制備稱取藥物并研碎，加入兩滴吐溫80潤濕，然后用0.5%CMC-Na 制成混懸液。脂質體的分散體系為高溫高壓滅菌后的PBS緩沖溶液，陽性對照是多 西紫杉醇的脂質體，陰性對照為空白脂質體。各組藥物除第M組(膜材中含有 RGD-NH(CH2)nCH3的小劑量多西紫杉醇藥脂體組)以0.25 mg/ml配制外，其余均 以0.5mg/mL配制。
實驗方法將靜息飼養(yǎng)兩天的小鼠，右側腋下接種腹水瘤后，隨機分為15組， 每組10只。接種后，于第l， 3， 5， 7天尾靜脈給藥，每天尾靜脈注射上述各組藥 物0.2ml。 7天后將各組荷瘤小鼠處死，稱體重和瘤重，按抑瘤率=[(陰性對照組平 均瘤重一治療組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重]xlOOX計算抑瘤率。獲得的數(shù)據(jù) 以(X±SD)表示，并做t檢驗。
結果見表1。結果顯示含有RGD肽綴合物的多西紫杉醇脂質體有優(yōu)越的抗腫瘤
1活性。通過結果分析可看出其中G,H， I， J， K組抗腫瘤作用高于多西紫杉醇脂質 體組F，其中J， K組有極顯著性差異(P 〈0.01), H， I組有顯著性差異(P 〈0.05)。 含有小劑量多西紫杉醇脂質體組(M)的抗腫瘤作用高于多西紫杉醇脂質體組F， 卻無統(tǒng)計學意義；；M組抗腫瘤活性雖與J組有一定的差異，卻無統(tǒng)計學意義，說 明多西紫杉醇靶向脂質體給藥量0.25mg/kg時已具有很好的抗腫瘤活性。N組抗腫 瘤活性雖與F組相當，無統(tǒng)計學意義，說明RGD膜材含量低于一定水平就不能達 到很好的治療效果。D組的平均瘤重與C組相當，且無統(tǒng)計學意義，證明單純的 RGD膜材不能起到抑瘤的作用，而實際起作用的是以RGD為膜材所達到的耙向效 果。O組抗腫瘤作用高于多西紫杉醇脂質體組F，且有極顯著性差異(P 〈0.01)， 說明具有長循環(huán)膜材的靶向制劑有很好的治療效果，而與I組比較卻無顯著性差異， 表明長循環(huán)膜材的比例對其療效有影響，還需進一步探索。G， H， I， J， L, M組 的抗腫瘤活性均高于L組，其中J， L， M組有極顯著性差異(P 〈0.01)， H， I組 有顯著性差異(P 〈0.05)，且L組與F組無統(tǒng)計學差異，表明脂質體L沒有靶向性， 說明RGD肽綴合物作為整合素受體錨點化合物的必要性。
表1多西紫杉醇靶向制劑對荷肉瘤S180小鼠的作用
序 號藥物劑型瘤重X士SD (g)抑瘤率 TGI(%)
APBS1.5143±0.4356
B0.5M CMC-Na的PBS1.2607±0.3613
C空白脂質體1.4567±0.5283
D含RGD的空白脂質體1.2424±0.6466
E多西紫杉醇混懸液1.1286±0.380610.5%
F多西紫杉醇脂質體1.0357±0.321828.9%
G含H-RGD-NHCH2(CH2)6CH3的多西紫杉醇脂質體0.8832±0.3581139.1%
H含H-RGD-NHCH2(CH2)8CH3的多西紫杉醇脂質體0.6980±0.2465*52.1%
I含H-RGD-NHCH2(CH2)1()CH3的多西紫杉醇脂質體0.7110±0.1914*51.2%
含H-RGD-NHCH2(CH2)12CH3的多西紫杉醇脂質體0.4989±0.2142**65.8%
K含H-RGD-NHCH2(CH2)14CH3的多西紫杉醇脂質體0.5563±0.1761"61.8%
含H-GGD-NHCH2(CH2)1QCH3的多西紫杉醇脂質體1.0537±0.350527.7%
M含RGD的小劑量多西紫杉醇脂質體1.0076±0.441330.8%
N含小劑量RGD的多西紫杉醇脂質體1.0938±0.561224.9%
0含RGD及DSPE-mPEG2000的多西紫杉醇長循環(huán)脂質體0.6412土0.2143**56.0%
4對比于多西紫杉醇脂質體對照組有顯著性意義(P0.05)， **對比于多西紫杉醇脂質體組有 極顯著性意義(PO.Ol)。
1權利要求
1、具下式結構的兩親性靶向錨點化合物，其中，n代表8，10，12，14，16。
2、 權利要求1所述的化合物的制備方法，包括以下步驟 (1)按照常規(guī)液相接肽技術分別合成RGD;(2 )將保護基保護的Arg-Gly-Asp分別與CH3(CH2)6CH2NH2 、 CH3(CH2)8CH2NH2、 CH3(CH2)10CH2NH2、 CH3(CH2)12CH2NH2、 CH3(CH2)14CH2MH2 偶聯(lián)，脫去保護基，即得。
3、 含有權利要求l的錨點化合物的靶向藥物載體。
4、 權利要求3的靶向藥物載體選自脂質體、納米粒或微乳等納米劑型。
5、 權利要求3的靶向藥物載體是脂質體。
6、 含有權利要求3的靶向藥物載體的藥物制劑組合物。
7、 權利要求6的藥物制劑組合物，其中所述藥物選自抗腫瘤藥物。
8、 權利要求7的藥物制劑組合物，其中所述抗腫瘤藥物選自多西紫杉醇。
9、 權利要求6的藥物制劑組合物，是含有磷脂的脂質體藥物組合物，其中藥 物選自多西紫杉醇。
10、權利要求9的藥物制劑組合物，其組成為抗腫瘤藥物占摩爾百分比0.5-30%; 普通藥物載體和錨點化合物的混合物占摩爾百分比70-99.5%，該混合物中，普通藥 物載體占摩爾百分比80—99%，錨點化合物占摩爾百分比1一20%。
全文摘要
本發(fā)明RGD-脂肪胺系列化合物作為腫瘤靶向載體材料的制備及應用，所述化合物，結構如右式。
文檔編號A61K9/14GK101538312SQ200910136619
公開日2009年9月23日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權日2009年5月8日
發(fā)明者怡 孫, 崔國輝, 崔純瑩 申請人:首都醫(yī)科大學