專利名稱：：小花鬼針草提取物及其制備方法和在制備抗前列腺疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥提取物及其應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及小花鬼針草提取物及其制備方法和小花鬼針草提取物在制備抗前列腺疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺增生是腺體內(nèi)細(xì)胞不受控制的非惡性增殖，這些增殖細(xì)胞常常發(fā)生在圍繞尿道的周圍組織，隨著增生的不斷加重，腺體會擠壓尿道，并會梗阻尿路，致使膀胱不再完全排空，這樣就為感染、膀胱結(jié)石和慢性前列腺炎的發(fā)生制造了環(huán)境。如不予以治療，慢性梗阻還會導(dǎo)致尿液倒流入輸尿管，從而威脅到腎的功能。常用的治療方法為藥物療法和手術(shù)療法。手術(shù)治療是一種創(chuàng)傷性和破壞性的操作，前列腺體積偏大、患者年齡偏高增加了手術(shù)的潛在風(fēng)險。術(shù)后尿失禁、尿道狹窄、性功能障礙等各種副作用以及高昂的治療費用，均給患者帶來很大的心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。過去的十年中，采用手術(shù)治療的人群大幅度減少，而轉(zhuǎn)向用藥物療法來控制癥狀，使藥物療法成為目前臨床最為常用的治療手段。藥物治療的短期目標(biāo)是緩解患者的下尿路癥狀，長期目標(biāo)是延緩疾病的臨床進展，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生，在減少副作用的同時，保持患者較高的生活質(zhì)量。目前，抗前列腺增生藥物主要包括針對病因治療的5a-還原酶抑制劑，如非那甾胺(Finasteride)、度他雄胺(Dutasteride)等，和針對病癥治療的a-受體阻滯劑，如特拉唑嗪(Terazosin)、多沙唑嗪(Doxazosin)、坦索羅辛(Tamsulosin)。5a_還原酶抑制劑可降低前列腺體積和血液中PSA水平，從而緩解前列腺增生癥狀并可阻止疾病的進程，是目前治療前列腺增生最為常用的有效藥物。但該類制劑由于降低雄激素水平，會產(chǎn)生與雄激素減少相關(guān)的一系列副作用。a-受體阻滯劑主要是通過阻滯分布在前列腺和膀胱頸部平滑肌表面的a-腎上腺能受體，起到松弛平滑肌、緩解尿路梗阻的作用。該類制劑可緩解尿路梗阻急性癥狀(如延遲尿潴留發(fā)生的時間)，或延緩手術(shù)時間，但長期治療并不能降低上述病情的發(fā)生機率。其副作用主要表現(xiàn)為體位性低血壓、頭暈、無力、心悸等癥狀。臨床也常會將5a_還原酶抑制劑和a-受體阻滯劑聯(lián)合應(yīng)用，以期達(dá)到短期迅速緩解癥狀和長期治療和阻止疾病進展的目的，但聯(lián)合用藥的不良反應(yīng)和費用亦相應(yīng)增加。盡管上述兩類藥物是目前用于治療前列腺增生的主流藥物，但由于前列腺增生是慢性疾病，需長期服藥，因此上述藥物的毒副作用常會困擾患者。另外，這兩種制劑作用靶點較為單一，前者為降低腺體內(nèi)雄激素的活性形式，后者是緩解平滑肌張力，但對前列腺增生所引發(fā)的感染、炎癥等并發(fā)癥狀則多無治療作用。這種情況導(dǎo)致了人們對中藥及植物藥物的關(guān)注。用于治療前列腺增生的植物提取物制劑目前在世界各地，尤其是歐洲國家已被廣泛采用。國外常用植物類藥物有伯泌松、吾真寧、舍尼通、通尿靈等，這些制劑分別來源于沙巴棕(Sere麗r印ens，在歐洲他稱為藍(lán)棕)、沙巴棕[Sere麗r印ens(bartram)small]和紫錐花(Echinaceaanagustifolia)、裸麥(Secalecereale)花粉、非洲臀果木(Pru皿sAfricanaL.)等等。國內(nèi)用于治療前列腺增生的中藥制劑種類較多，如前列通(蒲公英、黃柏、車前子等)、前列安膠囊(膜莢黃芪、地鱉蟲、冬葵果、桃仁等)、前列康(油菜花花粉)等。這些植物制劑在治療前列腺增生的同時，往往可治療前列腺炎。而且這些植物制劑的毒副作用較低，還未見有毒性的報道。目前的植物制劑大多起效緩慢不適于急性癥狀或增生較為明顯的患者，因此提高藥效是突出植物制劑治療該疾病優(yōu)越性的關(guān)鍵步驟。近年來，從天然產(chǎn)物中挖掘更為有效、低毒的抗前列腺增生有效成分是我們所面臨的機遇和挑戰(zhàn)。PSA(Prostatespecificantigen前列腺特異性抗原)是臨床診斷前列腺增生和前列腺癌的最重要指標(biāo)之一。PSA是一種由前列腺上皮細(xì)胞分泌的絲氨酸蛋白酶，存在于前列腺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，正常情況下被分泌入前列腺液或精液中。PSA(t-PSA)在血液中有兩種形式存在少量呈游離小碎片形式的f-PSA;大部分與al-胰蛋白酶(ACT)結(jié)合，呈復(fù)合物c-PSA形式。通常血清中總的PSA(t-PSA)水平以f-PSA與c-PSA之和表示。PSA主要由前列腺上皮中已分化的柱狀細(xì)胞分泌產(chǎn)生，基底細(xì)胞基本不產(chǎn)生PSA。正常情況下，富含PSA的前列腺腺泡內(nèi)容物與淋巴系統(tǒng)間存在著由基底膜、基底細(xì)胞和內(nèi)皮層構(gòu)成的屏障，使PSA很少或不會通過血液循環(huán)，所以外周血中PSA濃度很低。前列腺炎癥破壞了前列腺腺管及原有生理屏障的完整性，使腺管及腺泡內(nèi)的PSA滲漏進入血循環(huán)，從而引起血清PSA濃度升高。故血液中PSA含量升高通常提示前列腺有疾患存在，PSA含量測定已成為男性例行健康檢查中的常規(guī)指標(biāo)。前列腺增生癥、前列腺炎等良性疾病，PSA可輕微升高，但升高幅度不大，一般小于10yg/L，經(jīng)有效治療后一般能恢復(fù)至正常水平。但應(yīng)注意的是，在其臨床演變過程中，若PSA濃度呈明顯增高或由低逐漸轉(zhuǎn)高，則提示有可能伴發(fā)前列腺癌(PCa)。故PSA作為前列腺癌的早期診斷資料具有一定的價值。PCa患者PSA升高幅度大，一般大于10iig/L，如果大于20iig/L，則很少幸免于PCa。PCa患者在進行化療、放療、去勢或抗雄激素治療后，如原增高的PSA水平逐漸恢復(fù)，則可以判斷治療有效?？梢哉f，PSA雖不能完全特異性地鑒別診斷PCa，但臨床醫(yī)師如能根據(jù)PSA升高的程度以及隨時間的變化規(guī)律加以正確分析，可提高其診斷價值及觀察療效、判定預(yù)后、預(yù)測復(fù)發(fā)的能力。在沒有癌變的情況下，前列腺體積的大小與血液中PSA含量成正相關(guān)。因此在排除前列腺癌后，PSA也是臨床評價前列腺增生疾病進展情況的重要指標(biāo)。前列腺癌患者中，PSA的含量之所以顯著升高，是因體內(nèi)前列腺癌細(xì)胞會分泌大量PSA的緣故。因此，能否抑制前列腺癌細(xì)胞分泌PSA成為體外抗前列腺癌活性評價的重要指標(biāo)。但是，前列腺增生也同樣會導(dǎo)致血液中PSA的含量升高。在這種增生病變中，PSA則是由非癌變的細(xì)胞所分泌。但不論是在正常、增生還是癌變的前列腺上皮細(xì)胞中，PSA的表達(dá)主要是通過雄激素/雄激素受體進行調(diào)控，因此在體外檢測能夠抑制癌細(xì)胞分泌PSA的活性物質(zhì)，在體內(nèi)亦可能降低正常的上皮細(xì)胞分泌PSA。有研究表明，PSA含量與前列腺增生體積大小成正對數(shù)相關(guān)，體內(nèi)的PSA水平降低并趨于正常時，常常是增生癥狀得以緩解的標(biāo)志。臨床用于治療前列腺增生的一線藥物非那甾安，體外活性測試具有抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA的活性，在治療過程中也會降低前列腺體積的大小和降低血液中PSA的水平。ELISA法作為臨床上較為常用的測定PSA方法，已有文獻(xiàn)報道。小花鬼針草(BidensparvifloraWilld.)為菊科鬼針草屬植物，又名細(xì)葉剌針草，小剌叉，小鬼叉，鍋叉草，一包針；分布在東北、華北、河南、山東、江蘇、陜西、四川；生在山坡、路旁或農(nóng)田中。小花鬼針草性苦、味平、無毒，藥用全草，具有清熱解毒、散瘀消腫的功效，主治咽喉腫痛、泄瀉、痢疾、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷、風(fēng)濕痹痛。關(guān)于小花鬼針草的藥理作用和臨床應(yīng)用文獻(xiàn)報道較少。小花鬼針草與鬼針草同屬菊科鬼針草屬植物，具有相似的藥理作用。主要是抗菌抑菌作用、抗炎鎮(zhèn)痛作用、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用、抗高血脂及血栓形成作用、抗胃潰瘍作用、對體外白血病細(xì)胞的抑制作用以及對血小板聚集功能的影響。其臨床應(yīng)用與鬼針草相似，主要用于治療前列腺肥大、高血壓、闌尾炎、預(yù)防感冒、流感。目前對小花鬼針草的活性化學(xué)成分的研究報道較少。迄今為止，文獻(xiàn)報道從小花鬼針草中分離得到的化合物有以下幾類黃酮類化合物、黃酮苷類化合物、酚酸類化合物、咖啡酰基奎寧酸類化合物及其甲酯、苯丙苷類化合物、聚炔苷類化合物、揮發(fā)油類成分以及木脂素、糖酯等其它類化學(xué)成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了小花鬼針草提取物及其制備方法和用途。本發(fā)明一方面提供了一種小花鬼針草提取物，該提取物中總黃酮的含量是60%90%。該提取物中的黃酮類成分包括蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷。本發(fā)明另一方面提供了一種小花鬼針草提取物的制備方法，是將小花鬼針草原料用溶劑提取后濃縮得到提取物，該溶劑可以是三氯甲烷、乙酸乙酯或30%95%乙醇。其中，提取方法可以是加熱提取、常溫萃取或冷浸提取。該提取物可以進一步用溶劑萃取純化，合并萃取液溶劑，減壓干燥，濃縮得到純化后的提取物。萃取溶劑優(yōu)選水飽和過的正丁醇_乙酸乙酯混合溶劑，正丁醇與乙酸乙酯的體積比在i:15:l之間，優(yōu)選正丁醇與乙酸乙酯體積比為4:i的水飽和過的正丁醇-乙酸乙酯混合溶劑?？梢赃x擇地，原料用溶劑提取后濃縮得到的提取物也可以進一步用樹脂純化，合并洗脫液溶劑，減壓干燥，濃縮得到純化后的提取物。樹脂純化優(yōu)選大孔吸附樹脂柱，純化過程用30%95%乙醇洗脫，優(yōu)選45%75%乙醇洗脫，更優(yōu)選60%乙醇洗脫。本發(fā)明再一方面提供了一種藥用組合物，該藥用組合物含有藥學(xué)有效量的小花鬼針草提取物和藥用輔料。該小花鬼針草提取物中總黃酮的含量范圍是60%90%。該提取物中的黃酮類成分包括蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷。該藥用組合物中小花鬼針草提取物的制備方法，是將小花鬼針草原料用溶劑提取后濃縮得到提取物，該溶劑可以是三氯甲烷、乙酸乙酯或30%95%乙醇。其中，提取方法可以是加熱提取、常溫萃取或冷浸提取。該提取物可以進一步用溶劑萃取純化，合并萃取液溶劑，減壓干燥，濃縮得到純化后的提取物。萃取溶劑優(yōu)選水飽和過的正丁醇_乙酸乙酯混合溶劑，正丁醇與乙酸乙酯的體積比在i:15:l之間，優(yōu)選正丁醇與乙酸乙酯體積比為4:i的水飽和過的正丁醇-乙酸乙酯混合溶劑?？梢赃x擇地，原料用溶劑提取后濃縮得到的提取物也可以進一步用樹脂純化，合并洗脫液溶劑，減壓干燥，濃縮得到純化后的提取物。樹脂純化優(yōu)選大孔吸附樹脂柱，純化過程用30%95%乙醇洗脫，優(yōu)選45%75%乙醇洗脫，更優(yōu)選60%乙醇洗脫。該提取物可加入相應(yīng)藥用輔料，制成片劑、沖劑、膠囊劑、顆粒劑。5此外，本發(fā)明提供了小花鬼針草提取物在制備抗前列腺疾病藥物中的應(yīng)用。細(xì)胞實驗結(jié)果表明本發(fā)明小花鬼針草提取物可明顯抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA。本發(fā)明小花鬼針草提取物以及含有該小花鬼針草提取物的藥用組合物采用口服給藥，服用方便，副作用小。本發(fā)明小花鬼針草提取物的有效量是12.530.7mmol/L。本發(fā)明小花鬼針草提取物是從中藥材小花鬼針草中提取的有效成分，可明顯抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA，該提取物的制備方法及其在抗前列腺疾病方面的用途可以廣泛的應(yīng)用于開發(fā)和制備更為有效、低毒的抗前列腺疾病天然藥物，尤其是抗前列腺增生藥物和抗前列腺癌藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實施例方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍?！?、提取物的制備實施例一小花鬼針草干燥全草2.0kg，用20倍量三氯甲烷提取兩次，每次48小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得到浸膏，該提取物為黃紅色粉末。用體積比為4:l的水飽和過的正丁醇_乙酸乙酯混合溶劑萃取，反復(fù)多次至萃取液顏色變淡，合并萃取液溶劑，減壓干燥，得小花鬼針草總黃酮提取物176.0g。經(jīng)紫外可見分光光度法測定，該提取物中總黃酮含量為88%。實施例二小花鬼針草干燥全草2.0kg，用20倍量乙酸乙酯提取兩次，每次48小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得到浸膏，該提取物為黃紅色粉末。再用體積比為4:l的水飽和過的正丁醇_乙酸乙酯混合溶劑萃取，反復(fù)多次至萃取液顏色變淡，合并萃取液溶劑，減壓干燥，得小花鬼針草總黃酮提取物178.2g。經(jīng)紫外可見分光光度法測定，該提取物中總黃酮含量為89%。實施例三小花鬼針草干燥全草2.0kg，用20倍量60%乙醇加熱回流提取兩次，每次1.0小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得到浸膏，該提取物為褐色粉末。將60%乙醇提取物混懸于10倍量水中，上大孔吸附樹脂柱(柱床體積15L)，依次用3倍保留體積的水，30%乙醇，60%乙醇，95%乙醇洗脫，合并30%乙醇、60%乙醇以及95%乙醇洗脫液，減壓干燥，得到小花鬼針草總黃酮提取物202.0g。經(jīng)紫外可見分光光度法測定，該提取物中總黃酮含量為60%。實施例四小花鬼針草干燥全草2.0kg，用20倍量60%乙醇加熱回流提取兩次，每次1.0小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得到浸膏，該提取物為褐色粉末。將60%乙醇提取物混懸于10倍量水中，上大孔吸附樹脂柱(柱床體積15L)，依次用3倍保留體積的水，30%乙醇，60%乙醇，95%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，減壓干燥，得到小花鬼針草總黃酮提取物105.0g。經(jīng)紫外可見分光光度法測定，該提取物中總黃酮含量為65%。二、小花鬼針草提取物中黃酮類成分的指認(rèn)1、液相色譜條件色譜柱SHIMADZUVP_C18(4.6mmX250mm，5iim)分析柱；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脫0lmin(10%A)，130min(10%25%A)，3045min(25%50%A)，4555min(50%100%A)，5560min(100%A)。檢測波長254nm;柱溫25。C;流速1.OmL/min乙腈(色譜純，MerckCompany);水(Millipore-Q自制超純水)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；Agilent1100高效液相色譜儀，配有在線脫氣機、四元梯度洗脫泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器和色譜工作站。2、質(zhì)譜條件離子源電噴霧離子電離源(ESI源)；檢測方式負(fù)離子檢測；掃描方式MRM干燥氣氮氣(300L/h);碰撞氣氬氣(真空度2.6X10—3mbar)源溫度105。C;去溶劑溫度300。C;毛細(xì)管電壓3.5kV;錐孔電壓25V;3、小花鬼針草提取物供試品溶液及對照品溶液(1)供試品溶液取干燥恒重的小花鬼針草粉末(40目)2.Og，精密稱定，置100ml燒杯中，加60%乙醇40ml，分別超聲(功率250W，頻率40kHz)提取兩次，每次30min，提取液過濾后減壓回收乙醇，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45iim微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。(2)對照品溶液精密稱取各對照品蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷適量，分別用甲醇溶解并稀釋成含蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷2.48、2.52、2.04mg/mL的溶液。3、具體操作分別稱取蘆丁、金絲桃苷和槲皮苷對照品溶液。將小花鬼針草供試品溶液和上述對照品溶液按上述色譜條件進行分析，根據(jù)同一化合物相同色譜分離條件下保留時間相同，紫外光譜圖一致的原則，比較小花鬼針草供試品和各對照品的色譜峰，分別指認(rèn)出蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷。并且通過多級質(zhì)譜裂解規(guī)律進一步對其進行了確認(rèn)，并通過文獻(xiàn)檢索加以證明。蘆丁、金絲桃苷和槲皮苷的液相色譜的保留時間、其LC-MS(n)質(zhì)譜裂解情況及化合物結(jié)構(gòu)詳見表l。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、提取物的活性實驗本發(fā)明選用體外抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA活性作為抗前列腺增生和抗前列腺癌的活性評價體系，對小花鬼針草提取物進行活性評價。1、實驗材料(1)供試品小花鬼針草藥材分別按照實施例一、實施例二、實施例三和實施例四中的方法制備得到的不同提取物。(2)細(xì)胞來源雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCaP。細(xì)胞接種于含10%熱滅活胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、實驗方法(1)樣品配制與給藥將各測試部分溶解于DMS0中，分別配制成終濃度為50iig/ml或100iig/ml(DMS0的終濃度應(yīng)小于5%。)。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為10000個。培養(yǎng)48h后，進行給藥，并設(shè)有溶劑對照組。給藥后培養(yǎng)48h后，進行ELISA和MTS測試。(2)酶聯(lián)免疫法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)抗原溶液制備將LNCaP細(xì)胞以10000細(xì)胞/孔，接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)48小時后，換入新鮮培養(yǎng)液，然后將不同濃度的待測餾分或單體化合物加入，并設(shè)置溶劑對照組、陽性藥組(10i!M非那甾安)和空白組(未接種細(xì)胞)，每一濃度均設(shè)置三個復(fù)孔。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后將培養(yǎng)液吸出，并轉(zhuǎn)入另一干凈的96孔板中，用于測試其中的PSA含量。同時，采用MTS法對細(xì)胞的存活情況進行測試。包被ELISA培養(yǎng)板在測試前需將ELISA板預(yù)先用抗體包被。將兔抗原PSA多克隆抗體用包被緩沖液(Na2C030.159g，NaH2C030.293g，溶解于100mlH20中)稀釋至4yg/ml，以100iil/well加入96孔ELISA培養(yǎng)板中，4。C下過夜。封閉將包被好的ELISA板，用PBST[O.1%Tween20，PBS(KH2P040.2g，Na2HP04.12H202.9g，NaCl8.Og，KC10.2g，H201000ml)]洗滌一次，加入200ii1/well的封閉液[1XBSA(上海伯奧)溶于PBS]，37。C，封閉1小時。加入待測抗原溶液封閉完成后，PBST洗滌板兩次，倒扣控干，將收集的待測抗原溶液，以及用抗原稀釋液(5%FBSRPMI-1640)配制成不同濃度的(0，1，3，6，10ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)PSA(Fitzgerald)溶液加入ELISA板中，37°C，作用2小時。加入一次抗體與抗原作用完成后，PBST洗滌板三次，倒扣控干，將鼠抗原PSA單克隆抗(Biodesign)用抗體稀釋液(0.5%BSA溶于PBST)稀釋至200ng/ml，100yl/well加入ELISA板中，37t:，作用l小時。加入二次抗體一抗作用完成后，PBST洗滌板三次，扣干，將經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體(DAKO)用二抗稀釋液(0.5%BSAinPBST，不含NaN》稀釋4000倍，100yl/well加入ELISA板中，37。C，作用半小時。顯色二抗作用完成后，PBST洗滌板六次，扣干，將顯色液[9ml底物緩沖液(檸檬酸0.51g，Na2HP04.2H201.84g，H20100ml)1%OPD(lg溶于100ml底物緩沖液)，30%H20215iil]100iil/well加入ELISA板中。1015分鐘后，加入反應(yīng)終止液(1M貼04溶于柳，50iil/well。采用SPECTRAmax⑧340PC微孔分光光度計(MolecularDevicesCor.)，490nm處測定OD值。(3)MTS檢測法MTS(Sigma)溶液250mgMTS溶于125mlDPBS(Gibico，100mgMgCl2.6H20and133mgCaCl2.2H20溶解于1LDPBSH20)，于4。C避光保存;PMS(Promega)溶液0.92mg/mlPMS溶于DPBS。藥物作用后的細(xì)胞數(shù)量用MTS檢測法檢測，按照AqueousOneSolutionCellProliferationAssayKit(Promega)試劑盒所述的實驗程序進行。簡要為將培養(yǎng)板中培養(yǎng)液吸走，每孔加入MTS混合液[1.lmLMTS，55yLPMS，5.5mL5%FBS/RPMI-1640]60yl。置于37。C培養(yǎng)箱，作用2小時。然后用SPECTRAmax⑧340PC微孔分光光度計(MolecularDevicesCor.)，490nm處測定0D值。(4)數(shù)據(jù)處理ELISA檢測法以標(biāo)準(zhǔn)PSA濃度為縱軸，0D值為橫軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=156.57x3-40.222x2+15.726x_0.0141，R2=0.9999，計算待測PSA的濃度。MTS法測得OD值減去空白組0D值，為實際0D值，用ODa表示。每孔、每個細(xì)胞相對于對照組分泌PSA量的計算公式如下抑制分舒SA的相對量對照組PSA濃度踢"^S):，藥后PSA濃度""(縦S)x辦對照組PSA濃度/OD、MTS)每一數(shù)據(jù)點以三個復(fù)孔的平均值表示。3、實驗結(jié)果對小花鬼針草的不同提取物進行體外抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA活性實驗，結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1*測試濃度50iig/L;2*測試濃度100iig/L結(jié)果表明，小花鬼針草乙酸乙酯提取物具有較好的抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA活性，三氯甲烷提取物抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA活性次之。乙醇提取物部分，60%乙醇洗脫部位具有較好的抑制LNCaP細(xì)胞分泌PSA活性，30%乙醇洗脫部位活性次之，95%乙醇洗脫部位基本沒有活性。提取物及洗脫部位的測試濃度為100iig/ml，陽性藥非那甾安(Fina.)的測試濃度為10yM。權(quán)利要求一種小花鬼針草提取物，其特征在于，所述提取物中總黃酮的含量是60％～90％。2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取物中的黃酮類成分包括蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷。3.—種小花鬼針草提取物的制備方法，是將小花鬼針草原料用溶劑提取后濃縮得到提取物，其特征在于，所述溶劑可以是三氯甲烷、乙酸乙酯或30%95%乙醇。4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，進一步包括將所述提取物用溶劑萃取純化。5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述溶劑是正丁醇_乙酸乙酯混合溶劑，所述正丁醇與乙酸乙酯的體積比是l:15:1。6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，進一步包括將所述提取物用樹脂純化。7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，純化過程用30%95%乙醇洗脫。8.—種藥用組合物，其特征在于，含有藥學(xué)有效量的小花鬼針草提取物和藥用輔料。9.如權(quán)利要求8所述的藥用組合物，其特征在于，所述小花鬼針草提取物中總黃酮的含量是60%90%。10.小花鬼針草提取物在制備抗前列腺疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種小花鬼針草提取物及其制備方法和用途。本發(fā)明提供的小花鬼針草提取物中總黃酮含量是60％～90％，主要含有蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷等黃酮類成分。小花鬼針草提取物的制備方法是將小花鬼針草原料用氯仿、乙酸乙酯或30％～95％乙醇提取濃縮后得到。本發(fā)明還提供了一種藥用組合物，其含有藥學(xué)有效量的小花鬼針草提取物和藥用輔料。小花鬼針草提取物抗前列腺增生和抗前列腺癌的活性測試結(jié)果表明，其在制備抗前列腺疾病藥物方面具有廣泛的應(yīng)用。文檔編號A61P13/08GK101744857SQ20091010962公開日2010年6月23日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者劉敏,龐發(fā)根,李軍,李玉蘭,王玨申請人:深圳市藥品檢驗所