專利名稱：利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)及其應用，屬微生物醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
三七是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，三七的生理活性主要與其含有的皂甙、多糖、氨基酸、黃酮類化合物、甾醇及三萜等有關。近年來，盡管三七的研究有了長足的發(fā)展，但三七的利用仍主要停留在原料藥的水平上，品種單一，附加值低，開發(fā)三七新品種已成為三七產(chǎn)業(yè)做強做大的瓶頸。
微生物轉(zhuǎn)化技術是應用微生物具有的豐富酶系，對外源物質(zhì)的結(jié)構進行修飾，從而產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的過程。目前，該技術被廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、精細化工等領域。因具有反應周期短、專一性強、易于工業(yè)化等特點而倍受關注。特別是隨著現(xiàn)代分離提取手段的進步，該項技術廣泛的應用于天然化合物的生物合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、不對稱合成、藥物代謝和活性成分篩選及新藥的開發(fā)等諸多領域。
利用微生物轉(zhuǎn)化的方法，對三七進行二次開發(fā)，產(chǎn)生具有新活性的發(fā)酵物，是進一步利用中草藥，實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的有利手段之一。
國內(nèi)外文獻檢索表明，未見有關利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的公開文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)及其應用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的該活性物質(zhì)由生產(chǎn)菌株經(jīng)液體發(fā)酵或固體發(fā)酵的生產(chǎn)方法得到；具體步驟如下(1)生產(chǎn)菌株為(Aspergillus oryzae)1.1395，該菌株已于2005年10月31日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1520；米曲霉(Aspergillus oryzae 1.1395)隸屬半知菌亞門，絲孢目，曲霉屬。1.1395菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌絲初為白色，老熟后變?yōu)槊S色，菌絲透明，有分枝和分隔，有分生孢子梗，能產(chǎn)生分生孢子。
本發(fā)明真菌Aspergillus oryzae 1.1395的培養(yǎng)方法為現(xiàn)有的常規(guī)方法。培養(yǎng)基配方為(以下為重量百分比)
液體培養(yǎng)基配方為0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培養(yǎng)基。PDB培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L。
固體培養(yǎng)基配方為0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的固體培養(yǎng)物，固體培養(yǎng)物為30％小麥、30％玉米粉、40％大米。
液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)基中的三七的乙醇提取物為三七須根粉末用95％乙醇在60℃下浸提2小時，重復兩次，兩次提取液合并，用常規(guī)的減壓濃縮得到浸膏狀三七的乙醇提取物。
(2)液體發(fā)酵生產(chǎn)方法a.將1.1395的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，25-29℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管種；b.將試管種接種到250ml的三角瓶中，每瓶裝50ml液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基配方為0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培養(yǎng)基；搖床培養(yǎng)溫度為25-28℃，轉(zhuǎn)速為150-220rpm，培養(yǎng)時間8-10天；c.將含菌絲的發(fā)酵液真空抽濾后得清亮溶液，該溶液在60-70℃采用常規(guī)方法減壓濃縮或噴霧至干，即得活性物質(zhì)；(3)固體發(fā)酵生產(chǎn)方法a.將1.1395的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，25-29℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管種；b.將99％-99.5％的固體培養(yǎng)物與0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝300g，120℃滅菌40分鐘后，接入試管種，于25-28℃，靜置培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿，即形成固體發(fā)酵物；固體培養(yǎng)物為將小麥、大米用清水浸泡24小時后，分別于攝氏100℃的開水中煮浸3分鐘過濾后加入玉米粉獲得，固體培養(yǎng)物的配方為30％小麥、30％玉米粉、40％大米；c.將固體發(fā)酵物按常規(guī)方法冷凍干燥后，用95％乙醇室溫浸提2天，按常規(guī)方法減壓濃縮、蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)。
實驗表明三七經(jīng)米曲霉發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生了對人體大腸桿菌，綠膿桿菌，福氏痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用的功能，可應用于制備生物抗菌劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，采用新的菌種，利用其自身獨特的代謝體系生產(chǎn)具有抗人體病原細菌活性的代謝物質(zhì)。并通過人工培養(yǎng)技術實現(xiàn)生產(chǎn)控制。
實施例1三七液體發(fā)酵生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)1、將斜面保藏的米曲霉接種1cm菌絲塊于液體培養(yǎng)基中(50ml培養(yǎng)基/250ml三角瓶)，搖床培養(yǎng)溫度為25-28℃，轉(zhuǎn)速為150-220rpm，培養(yǎng)時間8-10天后獲得發(fā)酵物；液體培養(yǎng)基配方為0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培養(yǎng)基；PDB培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L。其中條件1為搖床培養(yǎng)溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)時間8天，液體培養(yǎng)基配方為0.5％三七的乙醇提取物，99.5％的PDB培養(yǎng)基；條件2為搖床培養(yǎng)溫度為27℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間9天，液體培養(yǎng)基配方為0.8％三七的乙醇提取物，99.2％的PDB培養(yǎng)基；條件3為搖床培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)時間10天，液體培養(yǎng)基配方為1％三七的乙醇提取物，99％的PDB培養(yǎng)基。
2、將培養(yǎng)好的發(fā)酵物用常規(guī)方法真空抽濾后得清亮溶液，溶液在60-70℃用常規(guī)方法減壓濃縮或噴霧至干，即得活性物質(zhì)。
3、將活性物質(zhì)用5％甲醇水溶液溶解，配制為0.1mg/ml的濃度。
4、對照培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基與發(fā)明內(nèi)容所述液體發(fā)酵生產(chǎn)方法相同，不同之處是不接種米曲霉。
5、用牛津杯法做抑菌實驗。在混有病原菌液的平板上放上牛津杯，在每一牛津杯內(nèi)加入0.1ml樣液，于37℃培養(yǎng)12hr。測量抑菌圈直徑(牛津杯直徑扣除，單位毫米)。每處理重復三次。結(jié)果見表1表1三七液體發(fā)酵物對人體病原細菌的抑制作用

實施例2三七固體發(fā)酵生產(chǎn)活性抗菌物質(zhì)1、將99％-99.5％的固體培養(yǎng)物與0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝300g，120℃滅菌40分鐘后，接入斜面保藏的1cm米曲霉菌絲塊試管種，于25-28℃，靜置培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿，即形成固體發(fā)酵物；固體培養(yǎng)物為將小麥、大米用清水浸泡24小時后，分別于攝氏100℃的開水中煮浸3分鐘過濾后加入玉米粉獲得，固體培養(yǎng)物的配方為30％小麥、30％玉米粉、40％大米。其中條件1為搖床培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間15天，固體培養(yǎng)基配方為99.5％的固體培養(yǎng)物與0.5％三七的乙醇提取物混合；條件2為搖床培養(yǎng)溫度為27℃，培養(yǎng)時間18天，固體培養(yǎng)基配方為99.2％的固體培養(yǎng)物與0.8％三七的乙醇提取物混合；條件3為搖床培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間20天，固體培養(yǎng)基配方為99％的固體培養(yǎng)物與1％三七的乙醇提取物混合；2、將固體發(fā)酵物按常規(guī)方法冷凍干燥后，用95％乙醇室溫浸提2天，按常規(guī)方法減壓濃縮、蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)。
3、將活性物質(zhì)用5％甲醇水溶液溶解，配制為0.1mg/ml的濃度。
4、對照培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基與發(fā)明內(nèi)容所述固體發(fā)酵生產(chǎn)方法相同，不同之處是不接種米曲霉。
5、用牛津杯法做抑菌實驗。在混有病原菌液的平板上放上牛津杯，在每一牛津杯內(nèi)加入0.1ml樣液，于37℃培養(yǎng)12hr。測量抑菌圈直徑(牛津杯直徑扣除，單位毫米)。每處理重復三次。結(jié)果見表2表2三七固體發(fā)酵物對人體病原細菌的抑制作用

權利要求
1.一種利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，其特征在于該活性物質(zhì)由生產(chǎn)菌株經(jīng)液體或固體發(fā)酵生產(chǎn)方法得到；具體步驟如下(1)生產(chǎn)菌株為(Aspergillus oryzae)1.1395，該菌株已于2005年10月31日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1520；(2)液體發(fā)酵生產(chǎn)方法a.將1.1395的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，25-29℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管種；b.將試管種接種到250ml的三角瓶中，每瓶裝50ml液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基配方為0.5％-1％三七的乙醇提取物，99％-99.5％的PDB培養(yǎng)基，PDB培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L；搖床培養(yǎng)溫度為25-28℃，轉(zhuǎn)速為150-220rpm，培養(yǎng)時間8-10天；c.將含菌絲的發(fā)酵液真空抽濾后，于60-70℃下減壓濃縮或噴霧至干，獲得活性物質(zhì)；(3)固體發(fā)酵生產(chǎn)方法a.將1.1395的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，25-29℃下培養(yǎng)5-7天，獲得試管種；b.將99％-99.5％的固體培養(yǎng)物與0.5％-1％三七的乙醇提取物混合，然后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝300g，120℃滅菌40分鐘后，接入試管種，于25-28℃，靜置培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿即成固體發(fā)酵物；其中固體培養(yǎng)物由小麥、大米用清水浸泡24小時后用，分別于攝氏100℃的開水中煮浸3分鐘并過濾加入玉米粉后得到固體培養(yǎng)物的配方為30％小麥、30％玉米粉、40％大米；c.將固體發(fā)酵物冷凍干燥，95％乙醇室溫浸提2天，60-70℃下減壓濃縮，蒸干溶劑后即得活性物質(zhì)；(4)液體發(fā)酵生產(chǎn)和固體發(fā)酵生產(chǎn)中的三七的乙醇提取物為三七須根粉末用95％乙醇在60℃下浸提2小時，重復兩次，兩次提取液合并，減壓濃縮得浸膏狀三七的乙醇提取物。
2.權利要求1所說的利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，其特征在于該活性物質(zhì)對有拮抗人體病原細菌的作用，可作為制備抗菌制劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)及其應用，屬微生物醫(yī)藥技術領域。用微生物轉(zhuǎn)化三七產(chǎn)生的活性物質(zhì)由生產(chǎn)菌株經(jīng)液體發(fā)酵生產(chǎn)或固體發(fā)酵生產(chǎn)方法獲得。生產(chǎn)菌株為(Aspergillus oryzae)1.1395，該菌株已于2005年10月31日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.1520。該活性物質(zhì)有抑制大腸桿菌，綠膿桿菌，福氏痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌4種人體病原細菌的作用，可應用于制備生物抗菌制劑。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，利用了微生物自身獨特的代謝體系以三七為底物生產(chǎn)具有抗菌作用的代謝物質(zhì)。并通過人工培養(yǎng)技術實現(xiàn)生產(chǎn)控制。
文檔編號A61K36/25GK1800342SQ200510048709
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權日2005年12月20日
發(fā)明者劉亞君, 張克勤, 趙鵬, 周薇 申請人:云南大學