專利名稱：一種葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及ー種具有葡萄糖響應(yīng)性、能夠根據(jù)血糖需要自調(diào)節(jié)釋放胰島素的藥物載體的制備方法，尤其是基于伴刀豆球蛋白與糖単元特異性相互作用的葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放載體的制備方法，屬于藥物控釋與生物材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:糖尿病是ー種嚴(yán)重的終身性疾病(分為I型和II型)，表現(xiàn)為持續(xù)高血糖，主要病因是胰島P細(xì)胞受損而引起的胰島素絕對或相對分泌不足。糖尿病(I型以及嚴(yán)重的II型患者)最有效的治療方法是每天多次皮下注射胰島素，從而幫助人體血糖維持在正常水平。不幸的是，這種廣泛應(yīng)用的治療方法亦不能很好的控制血糖，常常會引發(fā)低血糖這ー急性并發(fā)癥，嚴(yán)重時甚至?xí)炟?、休克，并且長期注射還會給病人帶來很大不便，還可能引起過敏、水腫等副作用。因此，為尋求更有效舒適的治療方法，人們致カ于開發(fā)新的胰島素遞送體系，包括新的遞送路線，新的胰島素劑型等。自調(diào)節(jié)胰島素釋放體系能夠響應(yīng)不同血糖濃度調(diào)節(jié)胰島素釋放量，因而能模擬胰島的智能分泌胰島素功能，它將給糖尿病人血糖平衡的控制帶來很大幫助。葡萄糖響應(yīng)性載體材料能夠響應(yīng)介質(zhì)中葡萄糖濃度的變化而改變自身溶脹性質(zhì)，因而適合用于制備自調(diào)節(jié)胰島素釋放體系。目前文獻(xiàn)報道較多的葡萄糖響應(yīng)性載體材料主要有三種(Progress in Polymer Science, 2010，35:278-301)分別是葡萄糖氧化酶體系、伴刀豆球蛋白體系和苯硼酸基團體系。其中，基于伴刀豆球蛋白的葡萄糖響應(yīng)性體系對于葡萄糖的專一‘丨生最強。伴刀豆球蛋白(Concanavalin A, Con A)是ー種從刀豆中提取的植物凝集素，能夠與葡萄糖以及含糖環(huán)的聚合物可逆地特異性結(jié)合。這種特性能夠使Con A與含糖環(huán)聚合物(如右旋糖酐、糖基聚丙烯酸酷)特異性結(jié)合形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)環(huán)境中葡萄糖濃度升高至一定水平吋，由于游離的葡萄糖與Con A的特異性結(jié)合作用更強，因此游離的葡萄糖能夠競爭Con A-聚合物結(jié)合位點，從而使得凝膠網(wǎng)絡(luò)解離而釋放出包裹的胰島素。而當(dāng)環(huán)境中葡萄糖濃度低于一 定值時，Con A能夠與聚合物再次結(jié)合，從而再次形成凝膠網(wǎng)絡(luò)，使得體系能夠根據(jù)血糖濃度變化可逆釋放胰島素。然而，在上述伴刀豆球蛋白體系中，Con A在溶脹過程中很有可能流失，不僅造成體系的葡萄糖響應(yīng)性減弱，影響載體的可重復(fù)性，而且流失的Con A量增加時有可能引發(fā)人體免疫反應(yīng)。為解決這ー問題，將Con A共價交聯(lián)到與其具有特異性糖結(jié)合作用的聚合物基體中是ー種非常重要的方法。已有的文獻(xiàn)報道中(Biomaterials，2006, 27:1586-1597;Carbohydrate Polymers, 2010，82:412-418)分別利用Con A與甲基丙烯酸酐的親核取代反應(yīng)以及Con A與丙烯酰氧こ基甲基丙烯酸酯的邁克爾加成反應(yīng)對Con A進(jìn)行改性使其帶有可反應(yīng)性碳碳雙鍵，進(jìn)而通過紫外光聚合與同樣帶有可反應(yīng)性雙鍵的右旋糖酐交聯(lián)，得到了葡萄糖響應(yīng)性的右旋糖酐-Con A基水凝膠。但是，以上方法除需要對配體聚合物右旋糖酐進(jìn)行改性外，對Con A也需要先進(jìn)行化學(xué)改性，不僅成本高，不易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，而且對Con A改性過程中難免造成部分失活，影響最終載體的葡萄糖響應(yīng)能力。發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的是提供ー種葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放載體的制備方法，采用一種既與Con A具有特異性結(jié)合作用又能夠通過交聯(lián)劑直接與Con A交聯(lián)的聚合物基體——糖基殼聚糖(葡萄糖氧こ基丙烯酸酯改性殼聚糖，CS-GEA)與Con A相互作用，并以京尼平為交聯(lián)劑通過反相乳液分散法形成具有葡萄糖響應(yīng)性的胰島素自調(diào)節(jié)釋放微凝膠載體。本發(fā)明所述的葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放微凝膠載體，通過CS-GEA與Con A的相互作用以京尼平為交聯(lián)劑通過反相乳液分散法制備，具體包括以下步驟:I)將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為10 100mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為I 10:1，優(yōu)選為3 8:1，攪祥2 5h ;2)將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為50 100:1，以500 800rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌0.5 2h ;3)將I體積份數(shù)的步驟I)中所得的攪拌好的混合溶液用注射器針頭滴加到40 80體積份數(shù)的步驟2)的混合液中并保持與步驟2)相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌0.5 2h得到乳白色分散液；4)將交聯(lián)劑京尼平水溶液滴加到步驟3)得到的分散液中，保持反應(yīng)36 48h得到硬化的微凝膠顆粒；5)反應(yīng)結(jié)束后靜置I 2h，去除上層油相，下層用沉淀溶劑沉淀，離心、水洗3-5次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。所述沉淀溶劑為甲醇，こ`醇，丙酮，異丙醇或ニ甲基亞砜。所述的CS-GEA由如下方法制備得到:將分子量為50 200kDa、脫こ酰度為86 90%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為0.5 2%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酷水溶液，殼聚糖初始濃度為10 25mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.2
0.8mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為0.8 1.2:1，40 60° C下攪拌反應(yīng)24 48h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8_9，然后使用溶劑(溶劑包括甲醇，こ醇，丙酮，異丙醇，ニ甲基亞砜)進(jìn)行沉淀，過濾收集固體組分，重新用去離子水溶解后使用截留分子量8 15kDa的透析膜在去離子水中透析4 7天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為1.5 3的CS-GEA。所述的Con A活化溶液由如下方法得到:將Con A溶于含有0.lmol/LKCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.lmmol/L MnCl2 的 pH7.0 7.8 的緩沖溶液中，Con A 初始濃度為I 10mg/mL，緩沖溶液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽-檸檬酸緩沖液三者之一，靜置6h以上。所述的交聯(lián)劑京尼平的初始濃度為I 10mg/mL，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的5% 12%。本發(fā)明的有益效果:使用的聚合物基體既與Con A具有特異性結(jié)合作用，又能夠通過京尼平直接與Con A共價交聯(lián)，避免了 Con A改性過程造成的損失，從而保證了該方法所制備的載體材料具有很好的葡萄糖響應(yīng)性，并且該響應(yīng)具有可重復(fù)性，利于胰島素的自調(diào)節(jié)釋放；同時該方法固定Con A簡單有效，成本低，實施方便，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施方式
:實施例1:DCS-GEA的制備:將分子量為50kDa、脫こ酰度為90%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為
0.5%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖初始濃度為10mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.2mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為0.8:1，40° C下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用甲醇溶劑沉淀，過濾收集固體組分，重新溶解后于去離子水中透析(透析膜截留分子量8Da) 4天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為1.5的CS-GEA。2) Con A 活化液的制備:將 Con A 溶于含有 0.lmol/L KCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.1mmoVLMnCl2的pH7.4的磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液中，Con A初始濃度為lmg/mL，
靜置6h。3)微凝膠載體的制備:①將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為100mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為1: 1，攪拌2h ;②將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為50:1，以500rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌30分鐘；③將I體積份數(shù)的步驟①中所得的攪拌好的混合溶液用5#注射器針頭緩慢滴加到40體積份數(shù)的步驟②的混合液 中并保持與步驟②相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌0.5h得到乳白色分散液；④將濃度為lmg/mL的京尼平水溶液滴加到步驟③得到的分散液中，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的5%，保持反應(yīng)36h得到硬化的微凝膠顆粒；⑤反應(yīng)結(jié)束后靜置2h，去除上層油相，下層用異丙醇沉淀，離心、水洗3次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。實施例2:DCS-GEA的制備:將分子量為lOOkDa、脫こ酰度為88%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為1%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖初始濃度為20mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.5mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為1:1，50° C下攪拌反應(yīng)36h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用こ醇溶劑沉淀，過濾收集固體組分，重新溶解后于去離子水中透析(透析膜截留分子量IOkDa) 6天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為1.8的CS-GEA。2) Con A 活化液的制備:將 Con A 溶于含有 0.lmol/L KCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.1mmoVLMnCl2的pH7.4的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液中，Con A初始濃度為5mg/mL,靜置 6h。3)微凝膠載體的制備:①將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為10mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為3:1，攪拌3h ;②將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為60:1，以600rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌Ih ；③將I體積份數(shù)的步驟①中所得的攪拌好的混合溶液用5#注射器針頭緩慢滴加到50體積份數(shù)的步驟②的混合液中并保持與步驟②相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌Ih得到乳白色分散液；④將濃度為5mg/mL的京尼平水溶液滴加到步驟③得到的分散液中，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的10%，保持反應(yīng)42h得到硬化的微凝膠顆粒；⑤反應(yīng)結(jié)束后靜置1.5h，去除上層油相，下層用異丙醇沉淀，離心、水洗3次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。實施例3:DCS-GEA的制備:將分子量為200kDa、脫こ酰度為86%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為1%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖初始濃度為20mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.7mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為1:1，50° C下攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用丙酮溶劑沉淀，過濾收集固體組分，重新溶解后于去離子水中透析(透析膜截留分子量8kDa) 7天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為2.1的CS-GEA。2) Con A 活化液的制備:將 Con A 溶于含有 0.lmol/L KCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.1mmoVLMnCl2的pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，Con A初始濃度為10mg/mL，靜置6h。3)微凝膠載體的制備:①將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為50mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合 ，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為5:1，攪拌3h ;②將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為80:1，以600rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌30分鐘；③將I體積份數(shù)的步驟①中所得的攪拌好的混合溶液用5#注射器針頭緩慢滴加到60體積份數(shù)的步驟②的混合液中并保持與步驟②相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌Ih得到乳白色分散液；④將濃度為lOmg/mL的京尼平水溶液滴加到步驟③得到的分散液中，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的10%，保持反應(yīng)48h得到硬化的微凝膠顆粒；⑤反應(yīng)結(jié)束后靜置lh，去除上層油相，下層用異丙醇沉淀，離心、水洗3次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。實施例4:DCS-GEA的制備:將分子量為200kDa、脫こ酰度為88%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為1%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖初始濃度為20mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.8mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為1.1:1,50° C下攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCOjf節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用異丙醇溶劑沉淀，過濾收集固體組分，重新溶解后于去離子水中透析(透析膜截留分子量8kDa) 7天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為2.3的CS-GEA。2) Con A 活化液的制備:將 Con A 溶于含有 0.lmol/L KCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.lmmol/LMnCl2的pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，Con A初始濃度為10mg/mL，靜置8h。3)微凝膠載體的制備:
①將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為80mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為8:1，攪拌4h ;②將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為80:1，以600rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌2h ；③將I體積份數(shù)的步驟①中所得的攪拌好的混合溶液用5#注射器針頭緩慢滴加到70體積份數(shù)的步驟②的混合液中并保持與步驟②相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌2h得到乳白色分散液；④將濃度為lOmg/mL的京尼平水溶液滴加到步驟③得到的分散液中，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的12%，保持反應(yīng)48h得到硬化的微凝膠顆粒；⑤反應(yīng)結(jié)束后靜置2h，去除上層油相，下層用異丙醇沉淀，離心、水洗3次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。實施例5:DCS-GEA的制備:將分子量為200kDa、脫こ酰度為88%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為2%的醋酸水溶液中，后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖初始濃度為25mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯的初始濃度為0.8mol/L，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為1.2:1,60° C下攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCOjf節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用ニ甲基亞砜溶劑沉淀，過濾收集固體組分，重新溶解后于去離子水中透析(透析膜截留分子量15kDa) 7天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為3的CS-GEA。2) Con A 活化液的制備:將 Con A 溶于含有 0.lmol/L KCl, 0.lmmol/LCaCl2, 0.lmmol/LMnCl2的pH7.8的磷酸鹽-朽1檬酸緩沖溶液中，Con A初始濃度為10mg/mL,靜置8h。

3)微凝膠載體的制備:①將CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為100mg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為10:1，攪拌5h ；②將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為100:1，以800rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌Ih ；③將I體積份數(shù)的步驟①中所得的攪拌好的混合溶液用5#注射器針頭緩慢滴加到80體積份數(shù)的步驟②的混合液中并保持與步驟②相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌Ih得到乳白色分散液；④將濃度為lOmg/mL的京尼平水溶液滴加到步驟③得到的分散液中，京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的12%，保持反應(yīng)48h得到硬化的微凝膠顆粒；⑤反應(yīng)結(jié)束后靜置lh，去除上層油相，下層用異丙醇沉淀，離心、水洗3次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性微凝膠載體。實施例6:將IOmg實施例3得到的微凝膠載體置于25mL濃度為lmg/mL的pH6.5的胰島素溶液中(胰島素先溶解于0.0lN的鹽酸中，然后用pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至lmg/mL)，室溫下攪拌5h。載藥結(jié)束后用去離子水洗滌微凝膠表面3次，冷凍干燥12h后于4° C保存。實施例1:
將實施例6得到的載有胰島素的2mg微凝膠置于小離心管中，加入釋放介質(zhì)后放入恒溫振蕩箱，保持37±0.5° C以及l(fā)OOr/min的振蕩速度。胰島素的釋放過程就在此恒溫振蕩箱中進(jìn)行，釋放介質(zhì)為不同葡萄糖濃度的磷酸鹽緩沖溶液$85，？11值為7.4，葡萄糖濃度分別為0、4mg/mL),姆隔一定時間取出離心管并更換釋放介質(zhì)(0 — 4 — Omg/mL循環(huán)),10000r/min的轉(zhuǎn)速離心30s，取上層清液檢測其中胰島素的含量，同時補給與所取檢測液相同體積的釋放介質(zhì)繼續(xù)釋放實驗。實驗結(jié)果分別顯示了載體響應(yīng)環(huán)境葡萄糖濃度變化調(diào)節(jié)胰島素釋放量的行為以及·在葡萄糖濃度脈沖變化刺激下的胰島素脈沖釋放趨勢，表明自調(diào)節(jié)釋放的可重復(fù)性。其余實施例子的例子都有類似的結(jié)果，能實現(xiàn)自調(diào)節(jié)釋放的可重復(fù)性。
權(quán)利要求
1.ー種葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放微凝膠載體的制備方法，所述方法包括: 1)將葡萄糖氧こ基丙烯酸酯改性殼聚糖CS-GEA溶解于去離子水中，CS-GEA初始濃度為l(TlOOmg/mL，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合，CS-GEA與Con A的質(zhì)量比為I 10:1，攪拌2 5h; 2)將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為50^100:1,以500 800 rpm轉(zhuǎn)速于室溫下攪拌0.5 2h ； 3)將I體積份數(shù)的步驟I)中所得的攪拌好的混合溶液用注射器針頭滴加到40 80體積份數(shù)的步驟2)的混合液中并保持與步驟2)相同轉(zhuǎn)速繼續(xù)攪拌0.5^2h得到乳白色分散液； 4)將交聯(lián)劑京尼平水溶液滴加到步驟3)得到的分散液中，保持反應(yīng)36 48h得到硬化的微凝膠顆粒； 5)反應(yīng)結(jié)束后靜置f2h，去除上層油相，下層用沉淀溶劑沉淀，離心、水洗3-5次，經(jīng)冷凍干燥即得葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放微凝膠載體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的萄萄糖氧こ基丙烯酸酯改性殼聚糖CS-GEA由如下方法制備得到:將分子量為5(T200kDa、脫こ酰度為86 90%的殼聚糖溶于體積百分?jǐn)?shù)為0.5^2%的醋酸水溶液中，然后滴加葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液，殼聚糖醋酸水溶液濃度為l(T25mg/mL，葡萄糖氧こ基丙烯酸酯水溶液濃度為0.2^0.8mol/L，加入的葡萄糖氧こ基丙烯酸酯與殼聚糖分子中氨基的摩爾比為0.fl.2:1，40飛0 °C下攪拌反應(yīng)24 48h，反應(yīng)結(jié)束后使用過量NaHCO3調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9，然后使用溶劑進(jìn)行沉淀，過濾收集固體組分，重新用去離子水溶解后使用截留分子量8 15kDa的透析膜在去離子水中透析4 7天，經(jīng)冷凍干燥得到取代度為1.5^3的CS-GEA。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述沉淀溶劑為甲醇，こ醇，丙酮，異丙醇或ニ甲基亞砜。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的ConA活化溶液由如下方法得到:將Con A 溶于含有 0.1 mol/L KCl, 0.1 mmol/L CaCl2, 0.1 mmol/L MnCl2 的 pH 7.0 7.8的緩沖溶液中，Con A初始濃度為flO mg/mL，緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液或磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，靜置6h以上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的交聯(lián)劑京尼平的初始濃度為f10mg/mL,京尼平質(zhì)量為CS-GEA與Con A質(zhì)量總和的5% 12%。
全文摘要
一種葡萄糖響應(yīng)性胰島素自調(diào)節(jié)釋放微凝膠載體的制備方法屬于藥物控釋與生物材料技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括1)將葡萄糖氧乙基丙烯酸酯改性殼聚糖CS-GEA溶解于去離子水中，溶解后的溶液與活化后的Con A溶液混合；2)將環(huán)己烷與乳化穩(wěn)定劑吐溫85混合，環(huán)己烷的體積毫升數(shù)與吐溫85的質(zhì)量克數(shù)之比為50~100:1；3)將1體積份數(shù)的步驟1)中所得的攪拌好的混合溶液滴加到40～80體積份數(shù)的步驟2)的混合液中得到分散液；4)將交聯(lián)劑京尼平水溶液滴加到分散液中得到硬化的微凝膠顆粒；反應(yīng)結(jié)束后靜置，下層沉淀，離心、水洗干燥。本發(fā)明所制備的載體材料具有很好的葡萄糖響應(yīng)性，并且該響應(yīng)具有可重復(fù)性，利于胰島素的自調(diào)節(jié)釋放；同時該方法固定Con A簡單有效，成本低，實施方便，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A61K47/36GK103110956SQ20131000378
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者聶俊, 殷瑞雪 申請人:北京化工大學(xué)