專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)蝿┝控i肺炎支原體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)對(duì)約3至10日齡動(dòng)物施以單劑有效量豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) (M. hyo)疫苗來(lái)治療或預(yù)防由豬肺炎支原體感染所致動(dòng)物疾病或病癥的方法。所述豬肺炎支原體疫苗可以是完全或部分滅活細(xì)胞或改良活體制劑、亞單位疫苗、或核酸或DNA疫苗。根據(jù)本發(fā)明施用的豬肺炎支原體疫苗可用合成或重組方法制備。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體(M. hyo)是一種能引發(fā)豬地方性動(dòng)物肺炎的細(xì)菌病原體。地方性動(dòng) 物肺炎是導(dǎo)致下列癥狀的慢性疾病食物轉(zhuǎn)化不良、發(fā)育障礙及繼發(fā)性肺部感染易感性。豬肺炎支原體很容易通過(guò)呼吸道分泌物以及通過(guò)母豬-豬仔傳遞而進(jìn)行傳播，并在豬場(chǎng)中大規(guī)模流行。美國(guó)約有99%的豬群被感染，養(yǎng)豬業(yè)每年因此耗費(fèi)約3億美元。已知的抵御豬肺炎支原體的疫苗大多數(shù)都是基于含佐劑的豬肺炎支原體全細(xì)胞滅活制劑。此外，基于免疫原性多肽或蛋白質(zhì)的疫苗可以通過(guò)豬肺炎支原體基因的克隆和重組表達(dá)的方法進(jìn)行合成或制備。能夠在體內(nèi)表達(dá)所述多肽或蛋白質(zhì)的豬肺炎支原體基因也可用作疫苗。全細(xì)胞滅活豬肺炎支原體疫苗的例子包括RESPISURE和STELLAMUNE，其均可從美國(guó)輝瑞公司獲得。另外，一些重組制備的可用作亞單位疫苗的豬肺炎支原體免疫原性多肽和蛋白質(zhì)在本領(lǐng)域中已有描述。公開(kāi)號(hào)為W096/28472的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)中描述了 6種豬肺炎支原體蛋白抗原，其分子量分別為46-48、52-54、60-64、72-75、90-94和110_114kDa，而且公開(kāi)了分子量為52-54、60-64和72_75kDa的抗原的部分蛋白質(zhì)序列以及分子量為46_48kDa的抗原的全長(zhǎng)核苷酸序列和氨基酸序列。編碼豬肺炎支原體蛋白質(zhì)P46的基因，即p46，也已經(jīng)被Futo等人克隆(1995; J.Bacteriol 177:1915-1917)。該小組的研究表明體外表達(dá)的基因產(chǎn)物可用于診斷豬肺炎支原體感染的抗體免疫應(yīng)答而不與其他種類(lèi)的支原體發(fā)生交叉反應(yīng)(Futo等，1995; J. Clin.Microbiol. 33:680-683)。Futo等人描述的p46基因的序列和診斷用途進(jìn)一步公開(kāi)于歐洲專(zhuān)利 0475185A1。Wise 和 Kim (1987，J. Bacteriol.，169:5546-5555)報(bào)道了名為 p70、p65 (P65,同上)、p50和p44的4種豬肺炎支原體膜整合蛋白質(zhì)，后3種經(jīng)共價(jià)脂連接而被修飾，可誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。對(duì)該免疫應(yīng)答的保護(hù)效果未做研究。編碼P65蛋白質(zhì)的基因也已克隆，其序列和在疫苗及診斷中的用途已描述于美國(guó)專(zhuān)利5，788,962。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W091/15593公開(kāi)了豬肺炎支原體的5種蛋白質(zhì)，其表觀(guān)分子量分別為150、90、85、70和43kDa。其中提供了編碼85kDa蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)C)的編碼基因的全長(zhǎng)序列，以及編碼其他4種蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列。Faulds的美國(guó)專(zhuān)利US5，252，328公開(kāi)了免疫反應(yīng)性豬肺炎支原體蛋白質(zhì)的氨基末端序列，其分子量為36、41、44、48、64、68、74· 5,79,88. 5、96和121kDa。其他根據(jù)電泳遷移率鑒定的而未公開(kāi)蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的表觀(guān)分子量為22. 5、34和52kDa。盡管US5，252，328提及這些蛋白質(zhì)可用于疫苗制劑，但未報(bào)道任何疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/09870公開(kāi)了純化豬肺炎支原體粘附素的生化方法，所述粘附素是支原體的膜整合蛋白，負(fù)責(zé)粘附到宿主的上呼吸道上皮細(xì)胞的纖毛上。WO 95/09870也建議了這些蛋白質(zhì)的測(cè)試方法及用途，例如在疫苗和診斷方面的用途。King等人的研究論文(1997; Vaccine 15:25-35)公開(kāi)的分子量為124kDa的粘附素Mhpl是P97的一個(gè)菌株變體。Wilton 等人(1998，Microbiology 144:1931-1943)測(cè)定出了 P97 的一種 94kDa 變體。此外，研究表明P97基因是還編碼名為P102的第二種蛋白質(zhì)的操縱子的一部分，該第 二種蛋白質(zhì)的推測(cè)分子量約102kDa (Hsu等，1998，Gene 214:13-23)。Minion和Hsu在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 99/26664中提出P102可用于疫苗，但未報(bào)道疫苗實(shí)驗(yàn)。沒(méi)有任何一種已知的豬肺炎支原體疫苗被報(bào)道在對(duì)大約3-10日齡的豬施以單劑量治療時(shí)是有效的。這樣的疫苗將消除對(duì)多劑量的需求，并因此大大減少世界范圍內(nèi)豬群大規(guī)模接種疫苗相關(guān)的費(fèi)用和勞動(dòng)力。因此需要一種對(duì)約3至10日齡豬施以單劑量疫苗接種以有效地保護(hù)和預(yù)防由豬肺炎支原體感染所致疾病或病癥的豬肺炎支原體疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防由豬肺炎支原體感染所致動(dòng)物疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)約3至10日齡動(dòng)物施以單劑有效量的豬肺炎支原體疫苗。本發(fā)明方法可消除對(duì)額外劑量的需求，所述額外劑量旨在產(chǎn)生或維持抵御豬肺炎支原體的免疫力。本發(fā)明的單疫苗接種方法能為血清反應(yīng)陰性和血清反應(yīng)陽(yáng)性的豬提供抵御毒性豬肺炎支原體的保護(hù)。本發(fā)明方法能有效地治療或預(yù)防由豬肺炎支原體感染導(dǎo)致的癥狀，例如預(yù)防和減輕豬肺的病灶。本發(fā)明方法包括對(duì)豬施以單劑有效量的豬肺炎支原體疫苗，所述疫苗包含完全或部分細(xì)胞制劑(如菌菌或改良活體制劑)，亞單位疫苗，例如這樣一種亞單位疫苗，其包含一個(gè)或多個(gè)豬肺炎支原體衍生多肽或蛋白質(zhì)或者所述多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性片段，或編碼所述多肽、蛋白質(zhì)或免疫原性片段的一個(gè)或多個(gè)豬肺炎支原體基因，所述基因或核酸能在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。豬肺炎支原體疫苗中提供的豬肺炎支原體多肽、蛋白質(zhì)及其免疫原性片段和基因或核酸可以用本領(lǐng)域公知技術(shù)來(lái)合成或重組制備。根據(jù)本發(fā)明施用的豬肺炎支原體疫苗可包括附加成分，如佐劑。可以使用的多種佐劑包括那些此處描述的以及本領(lǐng)域公知的。發(fā)明詳述本發(fā)明包括一種治療或預(yù)防由豬肺炎支原體感染所致動(dòng)物疾病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)約3至10日齡動(dòng)物施以單劑有效量豬肺炎支原體疫苗。本發(fā)明的單劑疫苗接種方法可消除對(duì)豬施用額外劑量的需求，該額外劑量旨在產(chǎn)生和/或維持抵御豬肺炎支原體的免疫力。為清楚公開(kāi)，并且非限制性的，對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述將分成如下幾個(gè)部分，各部分描述或說(shuō)明某些特征、實(shí)施例或發(fā)明的應(yīng)用。某些實(shí)施例中，本發(fā)明方法中所使用的疫苗包括部分或全細(xì)胞豬肺炎支原體滅活制劑(菌苗)或改良活體疫苗以及藥物學(xué)上可接受的載體，或者部分或全細(xì)胞豬肺炎支原體滅活制劑(菌苗)或改良活體疫苗以及佐劑。在其他一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法中所使用的疫苗包括免疫原性蛋白質(zhì)或多肽或其片段以及藥物學(xué)上可接受的載體，或者免疫原性蛋白質(zhì)或多肽或其片段以及佐劑。定義及縮寫(xiě)術(shù)語(yǔ)“治療或預(yù)防”在涉及豬肺炎支原體感染時(shí)是指抑制豬肺炎支原體細(xì)菌的復(fù)制、抑制豬肺炎支原體的傳播、或防止豬肺炎支原體在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕豬肺炎支原體感染所致疾病或病癥的癥狀。如果細(xì)菌荷載量減少、肺部感染減輕和/或攝食量和/或生長(zhǎng)增加，那么就可以認(rèn)為所述治療達(dá)到了治療效果。術(shù)語(yǔ)“豬肺炎支原體疫苗”是指能夠用于預(yù)防或治療由豬肺炎支原體感染所致病癥或疾病的疫苗，該疫苗可包括任何能夠有效治療或預(yù)防豬受豬肺炎支原體感染的疫苗。能夠用于本發(fā)明的豬肺炎支原體疫苗包括，例如，完全或部分豬肺炎支原體細(xì)胞制劑、滅活或改良活體疫苗、亞單位疫苗，所述亞單位疫苗含有一個(gè)或多個(gè)豬肺炎支原體衍生的多肽·或蛋白質(zhì)或所述多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性片段、或者編碼一個(gè)或多個(gè)豬肺炎支原體衍生多肽或蛋白質(zhì)、或其免疫原性片段的一個(gè)或多個(gè)豬肺炎支原體基因或核酸，且所述基因或核酸能夠在豬體內(nèi)表達(dá)。豬肺炎支原體多肽、蛋白質(zhì)、所述多肽和蛋白質(zhì)的免疫原性片段、或豬肺炎支原體基因或核酸可用本領(lǐng)域公知技術(shù)合成或重組制備。優(yōu)選的，本發(fā)明的方法使用的豬肺炎支原體疫苗為菌苗。術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”是指全部非人類(lèi)動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“豬”是指小豬(piglets), swine, pigs, porcine,大母豬(sows),小母豬(gilts) , barrows,公豬(boars)以及豬科的成員。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法施用于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的，豬。術(shù)語(yǔ)“菌苗”是指適用于疫苗用途的滅活的完全或部分豬肺炎支原體細(xì)胞制劑。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以在其施用的受試者體內(nèi)激發(fā)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的豬肺炎支原體疫苗的量。所述免疫應(yīng)答可以包括但不限于，內(nèi)在的、細(xì)胞的和/或體液的免疫的誘導(dǎo)。滅活(部分或全細(xì)胞)及改良活體疫苗用于本發(fā)明方法的傳統(tǒng)滅活或改良活體疫苗的制備方法是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明所述的單劑量疫苗接種方法所施用的豬肺炎支原體菌苗可獲自多種公眾可用的來(lái)源。例如，豬肺炎支原體菌苗可從豬肺炎支原體分離物中制取。豬肺炎支原體的很多分離物對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)均為熟知的并可獲自，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801Boulevard 大學(xué)，馬納薩斯(Manassas), VA 20110-2209。包括例如ATTC 序號(hào)為 25095，25617，25934，27714 和 27715。豬肺炎支原體分離物還可用已知技術(shù)直接獲自自然或?qū)嶒?yàn)感染的豬的肺損傷組織。豬肺炎支原體分離物可用多種已知方法進(jìn)行滅活，例如，用美國(guó)專(zhuān)利5，565，205中公開(kāi)的二元吖丙啶(BEI)處理細(xì)菌分離物、或用如福爾馬林、熱、BPL、放射或戊二醛進(jìn)行滅活。適用于本發(fā)明方法的豬肺炎支原體菌苗還可獲自多種商業(yè)來(lái)源。該來(lái)源包括但不限于RESPIFEND(Fort Dodge,美國(guó)家庭用品公司)，HY0RESP (梅里亞公司)，M+PAC (先靈葆雅公司)，PROSYSTEM M(Intervet)，INGLEVAC M(Boehringer)，RESPISURE (輝瑞公司)，和STELLAMUNE MYCOPLASMA (輝瑞公司)。
用于本發(fā)明方法的優(yōu)選的豬肺炎支原體菌苗來(lái)源為RESPISURE和STELLAMUNEMYCOPLASMA。用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的豬肺炎支原體菌苗來(lái)源為RESPISURE-1 (輝瑞公司)，包含株系P-5722-3(NL1042)，獲自美國(guó)普度大學(xué)。優(yōu)選地，P-5722-3株用BEI滅活并且選用商業(yè)可獲得的佐劑，優(yōu)選AMPHIGEN(Hydronics,美國(guó))使其佐劑化。優(yōu)選劑量為2. 0ml。常用防腐劑包括硫柳汞/EDTA?？梢约尤胼d體，優(yōu)選為PBS。制備改良活體疫苗的方法，如經(jīng)培養(yǎng)傳代以減低毒株的毒性，是本領(lǐng)域熟知的。亞單位疫苗本發(fā)明方法的實(shí)施可以使用含有純化的豬肺炎支原體免疫原性蛋白質(zhì)，多肽及所述蛋白和多肽的免疫原性片段。所述蛋白質(zhì)和多肽可以用本領(lǐng)域公知技術(shù)進(jìn)行制備。另夕卜，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法測(cè)定蛋白質(zhì)純度或均質(zhì)性，例如，先對(duì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后再觀(guān)測(cè)染色凝膠上的單個(gè)多肽條帶?？梢允褂肏PLC或其他本領(lǐng)域熟知的相似方法進(jìn)行更高的分辨率測(cè)定。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，用于本發(fā)明的疫苗包含至少一種豬肺炎支原體蛋白質(zhì)，如，但不限于，P46, P65, P97, P102, P70, P50 和 P44。在另一個(gè)實(shí)施例中，用于本發(fā)明方法的疫苗包含豬肺炎支原體菌苗(滅活的完全或部分細(xì)胞或改良活體)或豬肺炎支原體蛋白質(zhì)或多肽或其免疫原性片段和至少另外一種免疫原(滅活的完全或部分細(xì)胞或改良活體)或免疫原性或抗原性蛋白質(zhì)、多肽或其免疫原性片段，優(yōu)選為病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)多肽。所述另外的病原和蛋白質(zhì)、多肽或其免疫原性片段包括，但不限于豬流感病毒(SIV),豬生殖和呼吸疾病病毒(porcine reproductive andrespiratory disease virus, PRRS 或神秘豬病(mystery swine disease)),斷奶后腹灣(post-weaning diarrhea, PWD)和豬增生性腸炎(porcine proliferative enteritis,PPE ) o該組合物作為聯(lián)合疫苗是有益的。在另一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)或多肽的免疫原性片段含有用于本發(fā)明方法的免疫原性蛋白質(zhì)和多肽(包括但不限于P46，P65, P97, P102, P70, P50和P44)中至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100個(gè)連續(xù)氨基酸。此外，用于疫苗的豬肺炎支原體蛋白為基本純化的或均質(zhì)的。本發(fā)明方法所采用的蛋白質(zhì)或多肽一般是從表達(dá)編碼這些蛋白質(zhì)的重組核苷酸的宿主細(xì)胞中純化得來(lái)的。所述蛋白質(zhì)的純化可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的多種方法實(shí)施。參見(jiàn)，比如，“Methods inEnzymologyAcademic Press, Inc. , San Diego, 〃蛋白質(zhì)純化:原理和方法 〃，1982,Springer-Verlag, New York 中所述的技術(shù)。純化的豬肺炎支原體多肽和蛋白質(zhì)以及其免疫原性片段還可用已知的合成方法來(lái)制備。疫苗制劑用于本發(fā)明的疫苗的合適制劑包括可注射的液體溶液或懸浮液；也可以是在注射前適合溶于或懸浮于液體中的固體形式。也可以制成乳化劑。所述活性免疫原成分常與藥物學(xué)上可接受并能與該活性成分匹配的佐劑相混合。可以將所述多肽配制成中性或鹽類(lèi)的疫苗形式。藥物學(xué)上可接受的鹽類(lèi)包括酸加成鹽(與所述肽游離氨基基團(tuán)形成的)以及與無(wú)機(jī)酸形成的鹽類(lèi)，所述無(wú)機(jī)酸如，鹽酸或磷酸，或與乙酸、草酸、酒石酸、馬來(lái)酸等有機(jī)酸形成的鹽。與游離的羧基形成的鹽類(lèi)也可以衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、或氫氧化三鐵等無(wú)機(jī)堿，以及異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等有機(jī)堿。本發(fā)明所述的疫苗制劑含有免疫有效量的豬肺炎支原體免疫原和藥物學(xué)上可接受的載體。疫苗制劑包含免疫有效量的一種或多種抗原以及藥物學(xué)上可接受的載體。藥物學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、無(wú)菌的等滲含水緩沖液及其組合。這種可接受載體的一個(gè)實(shí)例是含有一種或多種穩(wěn)定劑的生理平衡培養(yǎng)基，所述穩(wěn)定劑如穩(wěn)定的水解蛋白、乳糖等。優(yōu)選該載體是無(wú)菌的。制劑形式應(yīng)該適合所述的施用方式?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)方法將純化后的抗原用于疫苗制劑。例如應(yīng)該將所述純化蛋白質(zhì)調(diào) 整到一合適的濃度，配以任一合適的疫苗佐劑并包裝。合適的佐劑包括，但不限于礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性劑，例如溶血卵磷脂；糖式，例如皂甙和Quil A或GPI-0100等阜式衍生物;陽(yáng)離子表面活性劑，例如DDA (quaternary hydrocarbon ammoniumhalogenide ；Pluronic多元醇；聚陰離子和多原子離子；聚丙烯酸，非離子嵌段多聚物，例如 Pluronic F-127 (B. A. S. F. , USA) ;Avridine 和 Rantidine ;妝；重組突變不穩(wěn)定毒素，例如白細(xì)胞毒素(rmLT)或霍亂毒素(CT);化學(xué)結(jié)合或近分子轉(zhuǎn)運(yùn)體(chemicallybound or close proximity molecular transporters);礦物油，例如 MontanideISA-50 (Seppic, Paris, France);聚羧乙烯，Amphigen (Hydronics,美國(guó)),Omaha, NE.美國(guó),Alhydrogel, (Superfos Bisector, Frederikssund, Denmark)油類(lèi)乳狀液(oilemulsions)，例如BayolF/Arlacel A等礦物油與水的乳狀液，或者植物油、水和乳化劑如卵磷脂的乳狀液；明帆，MDP, N —乙酰一胞壁酰一L —蘇氨酰一D —異谷氨酰胺(thr MDP),N —乙酰一去甲(nor)—胞壁酰一 L 一丙氨酰一 D —異谷氨酰胺，N —乙酰胞壁酰一 L 一丙氨酰一 D —異谷氨酰胺酰一 L 一丙氨酸一 2 —(Γ 一 2’ 一二棕櫚酰一 sn —甘油基一 3 —羥基磷酰氧基)一乙胺；膽固醇細(xì)胞因子及佐劑的組合物。多原子離子可作為分散劑、增稠齊U、抗結(jié)塊劑，從而使疫苗在延長(zhǎng)的沉淀期后重懸為單分散懸液。佐劑組合物可以是水劑，膠囊(控釋或緩釋)或微膠囊等形式。也可以將所述免疫原引入到脂質(zhì)體中，或者偶聯(lián)到多糖和/或其它可用于疫苗制劑的聚合物上。當(dāng)重組抗原是一種半抗原，即具有抗原性因而能與相關(guān)抗體選擇性反應(yīng)，但不具有免疫原性因而不能激發(fā)免疫應(yīng)答的分子時(shí)，可以將所述半抗原共價(jià)偶聯(lián)到一種載體或免疫原性分子上；例如，血清白蛋白等大分子蛋白可賦予與其偶聯(lián)的半抗原免疫原性。可以配制所述半抗原-載體用作疫苗。基因和核酸疫苗本發(fā)明可以使用編碼免疫原性蛋白，多肽及所述蛋白質(zhì)和多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體基因或核酸。該基因和核酸可在體內(nèi)表達(dá)而且可以用本領(lǐng)域熟知方法進(jìn)行制備。在一個(gè)具體實(shí)施例中，用于本發(fā)明的疫苗包含至少一種基因或核酸，所述基因或核酸編碼豬肺炎支原體蛋白，例如，但不限于，P46，P65，P97，P102, P70, P50和P44。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明中使用的基因或核酸編碼豬肺炎支原體蛋白或多肽的免疫原性片段，所述免疫原性片段含有本發(fā)明中所采用的免疫原性蛋白和多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或至少100連續(xù)氨基酸，所述免疫原性蛋白或多肽包括，但不限于 P46, P65, P97, P102, P70, P50 和 P44。在本發(fā)明方法的另一些實(shí)施例中，基因或核酸用本領(lǐng)域熟知方法來(lái)施用，例如，使用基因槍。在本發(fā)明方法的另一些實(shí)施例中，所使用的基因或核酸為DNA疫苗。此外，該核酸或基因可與脂質(zhì)體或本領(lǐng)域熟知的其它促進(jìn)轉(zhuǎn)染的因子聯(lián)合使用。用于制備和傳遞DNA疫苗的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)，例如，Krishnan, B.R, “DNA 疫苗在獸醫(yī)學(xué)中的現(xiàn)狀” Advanced Drug Delivery Reviews, Elsevier Science (2000)。表達(dá)系統(tǒng)可以用多種的宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明所述的抗原性蛋白質(zhì)序列。這類(lèi)宿主表達(dá)系統(tǒng)可以是目的編碼序列可以從中產(chǎn)生并隨后純化的載體，也可以是當(dāng)用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后能夠在原位展示出本發(fā)明的豬肺炎支原體基因產(chǎn)物的細(xì)胞。這些包括但不限于微生物,例如用含有mhp3編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌)；用含有豬肺炎支原體基因產(chǎn)物編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，糖酵母、畢赤氏酵母)；用含有豬肺炎支原體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV ;煙草花葉病毒，TMV)感染或用含有豬肺炎支原體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者用含有取自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒啟動(dòng)子(如腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘病毒7. 5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHO、BHK、293、3T 3)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述表達(dá)載體是細(xì)菌系統(tǒng)。豬肺炎支原體多肽和蛋白質(zhì)及其免疫原性片段還可用活體重組病毒和細(xì)菌載體比如腺病毒或沙門(mén)氏菌。實(shí)際使用的載體也是本領(lǐng)域熟知且容易獲得的或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域熟知方法構(gòu)建。劑量和施用方法根據(jù)本發(fā)明，對(duì)約3-10日齡的豬施以單劑有效量的豬肺炎支原體可提供抵御隨后豬肺炎支原體攻擊的有效免疫力。優(yōu)選的，對(duì)約6-約8日齡的豬施以豬肺炎支原體疫苗。最為優(yōu)選的，對(duì)約7日齡的豬施以豬肺炎支原體疫苗。單次劑量實(shí)施中豬肺炎支原體菌苗疫苗的有效劑量為每劑中包含約I X IO6至約5X 101°變色單位(color changing unit) (CCU)。優(yōu)選的，能提供有效免疫力的豬肺炎支原體菌苗疫苗單劑包含I X IO8至約5 X IOiqCXU及更優(yōu)選的，約5 X IO8至5 X 101QCCU。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)使用優(yōu)選的菌苗產(chǎn)品RESPISURE-1時(shí)，單劑施用RESPI SURE-I的量為約O. 5-3. 0ml，優(yōu)選的約I. 5ml至約2. 5ml，更優(yōu)選的，約2ml。本發(fā)明包含一個(gè)或多個(gè)蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體亞單位疫苗的有效量為約O. 01 μ g至約200 μ g。
本發(fā)明包含一個(gè)或多個(gè)編碼免疫原性蛋白或多肽或所述蛋白或多肽的免疫原性片段的豬肺炎支原體基因或核酸(優(yōu)選DNA)的豬肺炎支原體疫苗的有效量為約O. I μ g至約 200mg。根據(jù)本發(fā)明，疫苗的施用可以采用本領(lǐng)域所熟知的途徑，包括口腔、皮內(nèi)、肌內(nèi)、粘膜局部、經(jīng)皮和腸胃外(例如，靜脈內(nèi)的，腹膜內(nèi)的，皮內(nèi)的，皮下，肌肉內(nèi))。還可以使用無(wú)針頭的傳遞裝置進(jìn)行施用。施用還可以通過(guò)聯(lián)合途徑完成，如，首次施用采用腸胃外途徑，隨后的施用采用粘膜途徑。優(yōu)選的施用途徑為肌內(nèi)施用。本發(fā)明疫苗的有效劑量(免疫劑量)還可以根據(jù)模型測(cè)試系統(tǒng)中的劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)中推出。本發(fā)明接種疫苗的方法為血清反應(yīng)陽(yáng)性和血清反應(yīng)陰性的小豬均可提供針對(duì)豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫力。血清反應(yīng)陽(yáng)性的小豬是指血清中含有抗豬 肺炎支原體抗體的小豬。血清反應(yīng)陰性的小豬是指血清中不含可檢測(cè)水平的抗豬肺炎支原體抗體的小豬。 本發(fā)明進(jìn)一步描述于，但不限于，下列實(shí)施例中。實(shí)施例I豬肺炎支原體菌苗的制備豬肺炎支原體NL1042株用二元吖丙唳(BEI))進(jìn)行滅活。在生長(zhǎng)期末，將培養(yǎng)物的pH調(diào)高至7. 8 + 0. 2，并保持pH在此范圍內(nèi)至少一小時(shí)。在此期間，加入經(jīng)濾過(guò)滅菌處理的2 —溴乙基銨氫溴酸鹽(2-BromoEthylAminehydrobromide) (BEA)水溶液至終濃度約 4. OmM。在提高的 pH 下,BEA會(huì)化學(xué)轉(zhuǎn)化為BE I。培養(yǎng)物于37±2°C下持續(xù)攪拌溫育至少24小時(shí)。溫育24小時(shí)后，加入經(jīng)濾過(guò)滅菌處理的硫代硫酸鈉水溶液至終濃度約4mM以中和過(guò)剩的BEI。再將培養(yǎng)物于37 ± 2°C下持續(xù)攪拌溫育24小時(shí)。滅活后，但在用硫代硫Ife納中和如，取樣品并檢測(cè)滅活完成情況。將含有0.0026%酚紅的新培養(yǎng)基用5-20%接種體接種，并在檢測(cè)顏色改變前在37±2°C下至少孵育一周，所述顏色改變?yōu)闇缁钍〉谋憩F(xiàn)。大量樣本在37±2°C的巰基醋酸鹽培養(yǎng)液中，和室溫下的胰胨豆胨培養(yǎng)液中，檢測(cè)無(wú)菌狀態(tài)。滅活的培養(yǎng)物移入滅菌儲(chǔ)存容器中并在組裝前保存于2-8。。下。通過(guò)體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)定量最終容器中的抗原以測(cè)定效價(jià)。用于功效研究中的疫苗效價(jià)決定了在失效期時(shí)疫苗所必須表現(xiàn)的最小活性。每一系列或第一亞系的完成產(chǎn)品的整體或最終容器樣品用下述方法進(jìn)行豬肺炎支原體的檢測(cè)。菌苗保存于-50°C的IOOml的小瓶。小瓶解凍后，等分為15ml并在使用前保存于5+/-2。。。為檢測(cè)組裝系列的效價(jià)，該組裝系列的一個(gè)樣本與參照物進(jìn)行比較，并確定這一組裝系列的RP單位值。組裝系列或組裝亞系在起始時(shí)優(yōu)選包含至少6. 33RP，并且在整個(gè)期間至少為5. 06RP。RP指的是相對(duì)效價(jià)?？梢杂门c參照疫苗相比較的相對(duì)抗原量來(lái)測(cè)定RP值。在本申請(qǐng)中，將參照疫苗RP值確定為I。本發(fā)明單劑量產(chǎn)品優(yōu)選具有6. 33RP值，即為參照疫苗的6. 33倍。
加入硫柳萊(Merthiolate)作為防腐劑,終濃度不要超過(guò)O. 01%(w/v)。加入10%乙二胺四乙酸(EDTA，二鈉鹽或四鈉鹽)溶液作為防腐劑，終濃度大約為
O.07%(w/v)。實(shí)施例2動(dòng)盤(pán)大約I周齡的豬被選用以接種疫苗。其豬肺炎支原體血清狀況用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。ELISA值< O. 50的豬為豬肺炎支原體陰性。ELISA值大于O. 50的豬為豬肺炎支原體血清陽(yáng)性。疫苗豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)用來(lái)給豬免疫接種。使用該疫苗前，·用與參照豬肺炎支原體菌苗相比較的相對(duì)抗原量來(lái)確定其效價(jià)。參照疫苗(RP=I. O)每劑量包含大約8000單位的抗原(在滅活前收獲的存活細(xì)胞的大約I 一 2X108(XU)，用能測(cè)定疫苗中豬肺炎支原體抗原的固相免疫實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在制備RESPISURE-1中使用的同一液體佐劑(AMPHIGEN)用作安慰劑(即，沒(méi)有細(xì)菌細(xì)胞。)攻擊接種體(challenge inoculum)以IOml均分的肺組織勻漿形式提供的攻擊接種體，凍于_70°C，并被視為豬肺炎支原體株11 (L136)的衍生物。解凍該接種體并用Friis Mycoplasma Broth稀釋為1:25的稀釋液，并在接種前保持冰浴。每只豬在以下每個(gè)實(shí)施例中的特定日時(shí)經(jīng)鼻接受5ml的劑量(每個(gè)鼻孔2. 5ml的1:25懸液)。攻擊的每一天，肺接種體的一等份要進(jìn)行培育以確定不存在細(xì)菌的感染。其后在三天中的每一天，用滴定法測(cè)定第二等分，結(jié)果顯示了接種體包含大約IO6-IO7變色單位(CXU)的豬肺炎支原體。實(shí)驗(yàn)步驟豬在母豬體上時(shí)即用耳部標(biāo)記進(jìn)行識(shí)別[(-1)天]。該豬按照普遍隨機(jī)分組法被分配至圍欄中和治療組中。豬的分組是基于窩和斷奶圍欄進(jìn)行的。在第O天，豬經(jīng)肌內(nèi)接種2ml劑量的豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)，或經(jīng)肌內(nèi)接種2ml劑量的安慰劑。每只豬在以下每個(gè)實(shí)施例中的特定日時(shí)經(jīng)鼻接受5ml劑量的1:25懸液。全部豬每天都要監(jiān)測(cè)和檢查疾病的臨床癥狀。在攻擊第I天后的特定時(shí)間，無(wú)痛處死全部豬并作尸檢。取出肺并進(jìn)行評(píng)測(cè)。尸檢測(cè)定包括評(píng)估支原體呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理程度。每一片肺葉都要檢測(cè)，并畫(huà)出病灶的草圖以評(píng)估其占每片肺葉的百分比。并記錄總的病灶程度。數(shù)據(jù)分析根據(jù)豬肺炎支原體感染的典型肺病灶百分比來(lái)評(píng)估功效。治療組(接種組)中豬的全部肺病灶的百分比顯著(P ( O. 05)小于安慰劑組中的豬。總病變肺百分率每片肺葉的百分?jǐn)?shù)用下面的單個(gè)肺葉與肺總質(zhì)量的比例來(lái)加權(quán)平均左頭葉10%，左中葉10%，左尾葉25%。右頭葉10%，右中葉10%，右尾葉25%，其他為10%。然后將加權(quán)的肺葉值相加即可得出總病變肺百分率(Pointon等，1992)。
實(shí)施例3評(píng)測(cè)豬抵御毒性豬肺炎支原體攻擊的保護(hù)作用，所述豬為于3-8日齡施以單劑量豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)的豬肺炎支原體血清型陽(yáng)性的豬。在疫苗接種時(shí)或其前后，對(duì)RESPISURE — I進(jìn)行五個(gè)復(fù)制效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。用與疫苗參照物相比的相對(duì)抗原量來(lái)測(cè)定相對(duì)效價(jià)(RP)。疫苗參照物的RP=I. 0，包含大約8000單位的豬肺炎支原體抗原。五項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的RP值分別為5. 42，3. 96，4. 71，5. 49和4. 36。第O天，T02治療組中的豬(見(jiàn)下面表I)經(jīng)肌內(nèi)接種劑量為2ml的豬肺炎支原體菌苗RESPISURE-1 (輝瑞公司)。TOl組中的豬經(jīng)肌內(nèi)接種劑量為2ml的安慰劑。在第178，179和180天，每只豬均經(jīng)鼻接種劑量為5ml的1:25的攻擊接種體懸液。這三天中的每一天，在接種時(shí)培養(yǎng)一等份攻擊物，以確定不含細(xì)菌污染。第二等份用反滴定法來(lái)確定攻擊儲(chǔ)存物中包含大約107CCU/ml的豬肺炎支原體。所有的豬每日都要進(jìn)行檢測(cè)并檢查疾病的臨床癥狀?！す舻谝惶旌?0天，無(wú)痛處死全部豬并作尸檢。將肺取出并進(jìn)行評(píng)估。尸檢測(cè)定包括評(píng)估支原體呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的病理程度。每一片肺葉都要檢測(cè)，并畫(huà)出病灶的草圖以評(píng)估其占每片肺葉的百分比。并記錄總的病灶百分?jǐn)?shù)。表I
權(quán)利要求
1.包含豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)菌苗、用于治療或預(yù)防因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的豬疾病或病癥的疫苗，其中所述疫苗以單劑量對(duì)3至10日齡的所述豬施用，且其中所述單劑量能有效治療或預(yù)防因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的癥狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的疫苗,其還包含佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的疫苗，其中所述佐劑選自礦物凝膠；表面活性劑；糖甙，包括皂甙或皂甙衍生物；Pluix)niC多元醇；聚陰離子；非離子嵌段多聚物，礦物油，油類(lèi)乳狀液(ο i I emu I s i ons )，植物油、水和乳化劑的乳狀液；明帆，細(xì)胞因子，MDP，N —乙酰一胞壁酰一L 一蘇氨酰一 D —異谷氨酰胺(thr MDP), N —乙酰一去甲(nor) —胞壁酰一 L 一丙氨酰一D一異谷氨酰胺，N —乙酰胞壁酰一 L 一丙氨酰一 D —異谷氨酰胺酰一 L 一丙氨酸一 2 -(Γ 一 2’ 一二棕櫚酰一 sn —甘油基一 3 —羥基磷酰氧基)一乙胺；rmLT和AMPHIGEN 。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述佐劑是AMPHIGEN 。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述表面活性劑是溶血卵磷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述皂甙或皂甙衍生物是QuilA或GP1-0100。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗，其中所述乳化劑是卵磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的疫苗,其還包含藥物學(xué)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的疫苗，其還包含豬肺炎支原體以外的病毒或細(xì)菌抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，其中所述病毒或細(xì)菌抗原選自豬流感病毒(SIV)、豬生殖和呼吸疾病病毒(PRRS或神秘豬病)、斷奶后腹瀉(PWD)和豬增生性腸炎(PPE)。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的疫苗，其中所述豬肺炎支原體菌苗包含P_5722-3(NL1042)株。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的疫苗，其中所述株用二元吖丙啶(BEI)滅活。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的疫苗，其中所述株用AMPHIGEN 使其佐劑化。
14.根據(jù)權(quán)利要求I的疫苗，其中所述單劑量能有效治療或預(yù)防肺損傷。
15.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任何一項(xiàng)的疫苗，其中所述單劑量能有效治療或預(yù)防在免疫接種時(shí)對(duì)豬肺炎支原體而言血清反應(yīng)陽(yáng)性的豬和血清反應(yīng)陰性的豬兩者因豬肺炎支原體感染而引發(fā)的癥狀。
16.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任何一項(xiàng)的疫苗，其中所述單劑量包含約IX IO6至約5 X 101°變色單位(CCU)，優(yōu)選約I X IO8至約5 X IOloCCU,更優(yōu)選約5 X IO8至約5 X 1010CCU。
17.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任何一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗的量是約0. 5至約3. Oml,約I. 5至約2. 5ml或約2ml。
18.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任何一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗是RESPISURE-1。
19.根據(jù)權(quán)利要求I一 14中任何一項(xiàng)的疫苗，其中所述疫苗是單劑量的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)對(duì)約3至10日齡動(dòng)物施以單劑有效量豬肺炎支原體(M.hyo)疫苗來(lái)治療或預(yù)防由豬肺炎支原體感染所致動(dòng)物疾病或病癥的方法。所述豬肺炎支原體疫苗可以是完全或部分滅活細(xì)胞或改良活體制劑、亞單位疫苗、或核酸或DNA疫苗。根據(jù)本發(fā)明施用的豬肺炎支原體疫苗可用合成或重組方法制備。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102872456SQ201210389058
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月2日
發(fā)明者R·L·凱赫, L·G·薩巴迪尼 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司