專利名稱：?jiǎn)误w胰島素類似物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人胰島素單體類似物。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及長(zhǎng)效的各種單體類似物非胃腸道制劑。這些制劑延長(zhǎng)了藥物的作用時(shí)間。
多年來(lái)就知道可以成功地將胰島素與鋅離子共結(jié)晶，得到許多種穩(wěn)定的晶體，它們的藥效時(shí)間比可溶性或無(wú)定形的非晶態(tài)胰島素長(zhǎng)。在50年代初期，研制出一種新的牛胰島素晶體制劑，該制劑在中性pH的乙酸鹽緩沖劑中只含胰島素和鋅。Hallas-Mller等，科學(xué)(Science)-，116，394-398(1952)。這種胰島素制劑避免了能與鋅離子強(qiáng)烈作用形成不溶性磷酸鋅衍生物的磷酸根離子。在乙酸鹽緩沖劑中只含晶態(tài)胰島素的制劑被稱作Ultralente(超長(zhǎng)效的)。用這種方式制得的晶體在本文中稱作Ultralente(超長(zhǎng)效)晶體。
近來(lái)，已研制出單體胰島素類似物，它們保持著天然人胰島素的生物活性，但是不容易二聚和自締合成更高分子量的形式。自締合的減小造成了活性發(fā)作更快。這些胰島素類似物能夠迅速吸收，使得注射時(shí)間和胰島素的峰值藥效與隨用餐而伴生的飯后葡萄糖濃度偏差更為接近。
本發(fā)明提供了具有持久作用的一種單體胰島素類似物的制劑。因?yàn)閱误w胰島素類似物不像胰島素那樣聚集的締合，所以可以形成穩(wěn)定的類似物晶體這一點(diǎn)相當(dāng)出乎意料。令人驚奇的是，本發(fā)明的制劑提供了可預(yù)測(cè)的延長(zhǎng)的作用時(shí)間。
本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)效的非胃腸道藥物制劑，它基本上由約20-約500U/ml胰島素類似物的滅菌水懸浮液，約5-約10mg/ml氯化鈉，約0.2-約2.0mg/ml生理上容許的緩沖劑，約0.04-約20.0mg/ml鋅離子和一種生理上容許的防腐劑組成，pH約為6.5-約7.8；這使得懸浮液中存在的胰島素類似物處于溶解狀態(tài)的不到5％。
本發(fā)明還提供了一種由溶液中沉淀晶體制備的胰島素類似物晶體，該溶液基本上由約200-約1200U/ml的胰島素類似物、約50-約100mg/ml的氯化鈉、約20-約20.0mg/ml生理上容許的緩沖劑和摩爾量過(guò)剩的鋅離子組成，pH為約5.0-約6.0。
本申請(qǐng)中使用的所有氨基酸縮寫均為美國(guó)專利與商標(biāo)局所認(rèn)可的縮寫，如在37C.F.R.§1.822(b)(2)中列出的那些。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“胰島素類似物”或“單體胰島素類似物”是一種二聚或自締合傾向小于人胰島素的胰島素類似物。單體胰島素類似物是一種其中B28位的Pro被Asp、Lys、Leu、Val或Ala取代，且B29位的Lys是賴氨酸或脯氨酸；去(B28-B30)；或去(B27)的人胰島素。在Chance等的美國(guó)專利申請(qǐng)07/388,201(EPO公布號(hào)383 472)和Brange等的EPO申請(qǐng)214 826中有對(duì)單體胰島素類似物的說(shuō)明，上述文獻(xiàn)在本申請(qǐng)中引用作為參考。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)這種單體胰島素類似物進(jìn)行其它修飾。這些修飾是本領(lǐng)域中廣泛采用的，包括在B1位用天冬氨酸代替苯丙氨基酸；用丙氨酸代替B30位的蘇氨酸殘基；用天冬氨酸代替B9位處的絲氨酸殘基；只去掉B1位的或是一并去掉B2位的氨基酸，以及去掉B30位處的蘇氨酸。特別優(yōu)選的單體胰島素類似物是LysB28ProB29-人胰島素(B28是Lys；B29是Pro)和AspB28-人胰島素(B28是Asp)。
術(shù)語(yǔ)“Utralente胰島素”是指其中含有胰島素晶體的制劑，該晶體基本上按照Hallas-Mller等，在科學(xué)(Science)，116，394-398(1952)中的敘述在乙酸鹽緩沖液中制得。用這種方式制得的晶體以后稱作Ultralente(超長(zhǎng)效)胰島素晶體。
術(shù)語(yǔ)“胰島素類似物晶體”是指用本文所述方法制得的胰島素類似物晶體。
術(shù)語(yǔ)“U”是指胰島素活性的標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際單位。
本文中所用的“基本上”一詞意味著大于約95％，優(yōu)選大于約98％。例如，基本上晶態(tài)意味著結(jié)晶度大于95％的物質(zhì)。
本文中的“治療”一詞，描述了為戰(zhàn)勝疾病、癥狀或失調(diào)而對(duì)患者采取的措施和護(hù)理，它包括施用本發(fā)明化合物以防止癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作，減輕癥狀或并發(fā)癥，或消除疾病、癥狀或失調(diào)現(xiàn)象。
術(shù)語(yǔ)“生理上容許的防腐劑”是指間甲酚、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、間苯二酚、苯酚或本領(lǐng)域認(rèn)可的其它防腐劑。
術(shù)語(yǔ)“生理上容許的緩沖劑”是本領(lǐng)域已知的。生理上容許的緩沖劑包括乙酸 鈉或乙酸銨，或者與鋅無(wú)強(qiáng)烈作用的其它緩沖劑。
術(shù)語(yǔ)“鋅離子”是本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的。鋅離子的來(lái)源優(yōu)選為鋅鹽。鋅鹽的代表性實(shí)例包括乙酸鋅、溴化鋅、氯化鋅、氟化鋅、碘化鋅和硫酸鋅。熟練的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，很多其它的鋅鹽也可以用來(lái)制備本發(fā)明的制劑。
如上面所指出的，本發(fā)明提供了胰島素類似物晶體和長(zhǎng)效的胰島素類似物制劑。胰島素類似物晶體是從溶液中沉淀晶體制得的，所述溶液中基本上由約200-約1200U/ml胰島素類似物、約50-約100mg/ml的氯化鈉、約2.0-約20.0mg/ml的生理上可接受的緩沖劑和摩爾量過(guò)剩的鋅離子組成，溶液的pH為胰島素類似物的等電點(diǎn)，通常pH為約5.0-約6.0。
胰島素類似物晶體優(yōu)選用自溶液中沉淀晶體法制備，該溶液中基本上由約400-約1000U/ml胰島素類似物、約65-約75mg/ml氯化鈉、5.0-約10.0mg/ml乙酸鈉和約0.1-約0.5mg/ml鋅離子組成，pH約為5.5-約5.9。最好是，胰島素類似物晶體用從溶液中沉淀晶體法制備，該溶液基本上由400U/ml胰島素類似物、約70mg/ml氯化鈉、約8.0mg/ml乙酸鈉和0.15mg/ml鋅離子組成，pH約為5.5-約5.6。
當(dāng)把pH調(diào)節(jié)到胰島素類似物的等電點(diǎn)時(shí)，晶體形成。利用生理上容許的堿(如氫氧化鈉)調(diào)節(jié)溶液的堿度，將pH由較酸性調(diào)節(jié)到5.0-6.0。類似地，利用生理上容許的酸(如鹽酸)調(diào)節(jié)溶液的酸度，將pH由較堿性調(diào)節(jié)到5.0-6.0。
優(yōu)選配制兩種溶液，它們?cè)诤喜r(shí)形成一種溶液，該溶液基本上由約200-約1200U/ml胰島素類似物、約50-約100mg/ml氯化鈉、約2.0-約20.0mg/ml生理上容許的緩沖劑和摩爾量過(guò)剩的鋅離子組成，其pH為類似物的等電點(diǎn)。第一種溶液下文稱為胰島素類似物部分，它含有約300-約2000U/ml胰島素類似物和摩爾量過(guò)剩的鋅離子，其pH為酸性，約2.0-約3.0。第二種溶液下文稱作緩沖劑部分，含有約130-約270mg/ml氯化鈉、約5.0-約55.0mg/ml生理上容許的緩沖劑，pH為堿性，約10.5-約12.5。在合并后，溶液的pH平衡到胰島素類似物的等電點(diǎn)，pH約為5.0-6.0。晶體自溶液中沉淀出來(lái)。此溶液下文稱作晶體部分。
在約5.0-6.0的pH下，晶體在攪拌下于約6-72小時(shí)內(nèi)沉淀。但是，完成晶體生長(zhǎng)的準(zhǔn)確時(shí)間取決于所選擇的胰島素類似物和所采用的條件。所形成的要求保護(hù)的晶體是輪廓分明的，形狀為菱形。
優(yōu)選向溶液中加入種晶以形成大小分布更均勻的晶態(tài)物質(zhì)并加速晶化。種晶的制備是本領(lǐng)域已知的，可以由人胰島素、牛胰島素、豬胰島素或胰島素類似物衍生得到。
因?yàn)閱误w胰島素類似物不發(fā)生自締合，故其物理性質(zhì)和特征與胰島素不相似。例如，各種單體類似物很少或者不發(fā)生Zn誘導(dǎo)的締合。這與胰島素顯著不同，后者在鋅存在下幾乎完全是六聚體構(gòu)型。因?yàn)橐纬珊线m的Ultralente胰島素晶體，每個(gè)胰島素六聚體內(nèi)至少需要絡(luò)合兩個(gè)鋅原子，所以在與制備Ultralente胰島素使用的類似條件下能形成胰島素類似物晶體是相當(dāng)出乎意料的。
此外，本發(fā)明的晶體優(yōu)選在約500-3000ppm的低含量苯酚存在下制備。因?yàn)榘茨柋劝l(fā)生的防腐劑的結(jié)合會(huì)引起胰島素類似物自締合，所以單體類似物在不存在高濃度防腐劑的條件下發(fā)生晶化是令人驚奇的。因此，晶體的形成是出乎意料的，因?yàn)閱误w類似物形成六聚體的傾向有限。這與胰島素不同，后者在有鋅但沒(méi)有防腐劑存在下容易形成六聚體。
再者，本領(lǐng)域已知酚類防腐劑會(huì)損害Ultralente胰島素結(jié)晶。因此，在酚類防腐劑存在時(shí)于本文所述條件下形成胰島素類似物晶體是令人驚奇的。
本發(fā)明還提供了適合用皮下注射治療糖尿病的胰島素類似物晶體的制劑。非腸道用藥的藥物制劑基本上由約20-約500U/ml胰島素類似物的滅菌水懸浮液，約5-約10mg/ml的氯化鈉、0.2至約2.0mg/ml的生理上容許的緩沖劑，約0.04-約20.0mg/ml的鋅離子和生理上容許的防腐劑組成，其pH約為6.5-約7.8；這就使懸浮液中存在的胰島素類似物處在溶解狀態(tài)的不到5％。優(yōu)選，制劑中胰島素類似物處于溶解狀態(tài)的不到2％。
本文所述的胰島素類似物制劑是用本領(lǐng)域用來(lái)制備人胰島素超長(zhǎng)效制劑的公認(rèn)技術(shù)制備的。胰島素類似物晶體的懸浮液用稀釋溶液稀釋，該稀釋溶液中含有生理上容許的緩沖劑和防腐劑。制劑的pH調(diào)節(jié)到約7.3-約7.4。
本發(fā)明專利要求保護(hù)的這種胰島素類似物制劑造成胰島素類似物的緩慢吸收，因此如果愿意，所需的注射用藥每天不超過(guò)一次。
這些制劑中含有防腐劑(如對(duì)羥基苯甲酸甲酯)，鋅含量為約0.04-約20.0mg/ml，pH約為7.1-約7.5。晶體中存在的氯化鈉起等滲劑的作用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，如有必要，制劑的等滲性可以用氯化鈉或工藝上已知的其它等滲調(diào)節(jié)劑(如甘油)調(diào)節(jié)。另外，普通技術(shù)人員都了解，很多其它的防腐劑都可用于本發(fā)明。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，總鋅濃度對(duì)于U40制劑為0.04-約0.1mg/ml，優(yōu)選為0.08mg/ml，對(duì)于U100制劑為約0.1-約0.24mg/ml，優(yōu)選為0.14mg/ml。
制劑的pH可以用生理上容許的緩沖劑緩沖。生理上容許的緩沖劑包括乙酸鈉或與鋅無(wú)強(qiáng)烈作用的其它緩沖劑。
最有意義的是，通過(guò)向制劑中加入額外的鋅使總鋅濃度為每100單位胰島素約0.5-約20mg，優(yōu)選每100單位約0.5-約7mg，進(jìn)一步延長(zhǎng)了制劑的作用時(shí)間。額外的鋅是在晶體絡(luò)合與配制后加入。增加了鋅的制劑中超過(guò)50％的總鋅量是在可溶部分中而不是與胰島素絡(luò)合。增加了鋅的制劑的pH一般為6.0-7.4。
本發(fā)明還提供了胰島素類似物制劑，包括主要由晶態(tài)和無(wú)定形物質(zhì)混合物構(gòu)成的Lente(長(zhǎng)效)類制劑，以及只含有無(wú)定形物質(zhì)的SemiLente(半長(zhǎng)效)類制劑。這些混合物提供了可預(yù)知的藥效持續(xù)時(shí)間和更快的清除。另外，這些制劑比可溶性胰島素的藥效持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)久。
本文所述的特殊的結(jié)晶條件只形成晶態(tài)制品。如果改變條件，則形成不同數(shù)量非晶態(tài)的無(wú)定形物質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，從緩沖劑部分去掉鹵化物或者在中性pH下而不是在等電點(diǎn)下結(jié)晶將產(chǎn)生非晶態(tài)物質(zhì)。優(yōu)選利用這些變化的組合來(lái)制備無(wú)定形產(chǎn)物，以保證完全生成無(wú)定形物質(zhì)。因?yàn)楦鞣N單體類似物在只生成晶態(tài)產(chǎn)物的最佳條件方面略有不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，其它制備無(wú)定形物質(zhì)的程序或條件也是可行的。例如，加入對(duì)鋅離子有強(qiáng)親合力的緩沖劑將中斷結(jié)晶過(guò)程。
無(wú)定形鋅類似物的濃懸浮液優(yōu)選用從溶液中沉淀無(wú)定形鋅胰島素類似物顆粒的方法制備，該溶液主要由約200-約1200U/ml胰島素類似物、約2.0-約20.0mg/ml生理上容許的緩沖劑、約50.0-約100mg/ml氯化鈉和摩爾量過(guò)剩的鋅離子組成，pH值約為7.0-約7.5。
半長(zhǎng)效的胰島素類似物(Semilente-like)制劑是將無(wú)定形鋅胰島素類似物的濃懸浮液稀釋成無(wú)定形制劑而制得的，該制劑中主要由約20-約500U/ml的胰島素類似物、約5-約10mg/ml氯化鈉、0.2-約2.0mg/ml生理上容許的緩沖劑、約0.07-約20.0mg/ml的鋅離子以及生理上可接受的防腐劑組成，pH為約6.5-約7.8；這就使懸浮液中存在的胰島素類似物處在溶解狀態(tài)的不到5％。
長(zhǎng)效胰島素類似物(Lente-like)制劑是70％結(jié)晶與30％無(wú)定形物質(zhì)的混合物。晶態(tài)部分是按照本文對(duì)胰島素類似物晶體所述的方式制備的。無(wú)定形物質(zhì)是按照對(duì)半長(zhǎng)效胰島素類似物所述的方式制備的。用常規(guī)方法將晶體部分和無(wú)定形部分混合。
本發(fā)明的胰島素類似物可以用許多公認(rèn)的合成肽方法中的任何一種來(lái)制備，包括經(jīng)典的(溶液)方法、固相法、半合成法和更近的重組DNA方法。
提供以下實(shí)施例只是為了進(jìn)一步說(shuō)明胰島素類似物的制備和本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不應(yīng)看作只包括以下實(shí)施例。
制備例1晶種的制備Lente(長(zhǎng)效)晶種的制備方法是本領(lǐng)域已知的，例如在JorganSchlictkrull“胰島素晶體IV晶核、晶種和單分散胰島素晶體懸浮液的制備(Insulin CrystalsIV.The Preparation of Nuclie，Seedsand Monodisperse Insulin Crystal Suspensions)”斯堪的那維亞化學(xué)學(xué)報(bào)(Acta Chemica Scandinavica)，11299-302(1957)中所述。
實(shí)施例1單體類似物晶體的制備LysB28ProB29-人胰島素部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入1.034g LysB28ProB29-人胰島素晶體(內(nèi)源鋅含量0.51％，苯酚濃度939ppm)。將該晶體懸浮在約30ml Milli-QTM水中。向此溶液中加入0.464ml一份10mg/ml酸性氧化鋅溶液，使總鋅量為4.64mg。用10％鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2.77。在溶液完全澄清后，加入Milli-QTM水使溶液的最終重量為40g。將最終的胰島素類似物溶液(下文稱用類似物部分)經(jīng)過(guò)0.22μm濾器(MilliporeSterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。緩沖劑部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入0.565g乙酸鈉和4.947g氯化鈉。用大約25g Milli-QTM水將鹽溶解，用10％氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至約11。在調(diào)節(jié)完pH之后，用Milli-QTM水將溶液的最終質(zhì)量調(diào)節(jié)到30g。此溶液(下文稱作緩沖溶液)經(jīng)過(guò)0.22μm濾器(MilliporeSterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。用0.25ml的10％NaOH將緩沖溶液調(diào)節(jié)至pH為12.01，以便在與類似物溶液合并后pH為5.6。結(jié)晶采用以下條件配制50ml的400U/ml晶體(下文稱作晶體部分)。向結(jié)晶容器中加入29.716ml類似物部分。在攪拌下向容器中加入總計(jì)18.75ml緩沖液部分。等待60秒后，向容器中加入1.544ml人胰島素晶種混合物(官能度＝4)，其數(shù)量是按1/2官能度乘以類似物的克數(shù)算出的。在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌24小時(shí)。
實(shí)施例2具有長(zhǎng)效的胰島素類似物藥物制劑(40U/ml)稀釋溶液將0.6g對(duì)羥基苯甲酸甲酯溶在Milli-QTM水中使最終質(zhì)量為300g，配成對(duì)羥基苯甲酸甲酯貯備液(2mg/g)。向配衡好的裝有磁攪棒的燒杯中加入277.78g對(duì)羥基苯甲酸甲酯貯備液、0.444g乙酸鈉和4.785ml的10mg/ml酸性氧化鋅溶液。用10％氫氧化鈉溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)到5.53。加入Milli-QTM水使溶液的最終質(zhì)量為500g，最后使溶液通過(guò)0.22μm的濾器(Millipore SterivexTM-GV過(guò)濾裝置)。制劑將一份0.020ml10％的鹽酸和一份0.750ml的10％氫氧化鈉溶液加到稀釋溶液中使pH為7.72，這使得晶體部分與稀釋溶液混合后的最終pH為7.3-7.4。向一只已配衡的裝有磁攪棒的容器中加入360g稀釋溶液(為最終體積的90％，比重＝1.000)，然后加入42.40g晶體部分(為最終體積的10％，比重＝1.060)。用0.010ml 10％氫氧化鈉溶液將最終pH調(diào)節(jié)到7.27-7.34。
實(shí)施例3晶體及最終制劑的鑒定用顯微鏡檢查按本文所述制得的LysB28ProB29-人胰島素晶體，在結(jié)晶24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)主要含有大小約10μm的菱形晶體。最終的40U/mlLysB28ProB29-人胰島素制劑用顯微鏡檢驗(yàn)并用一些分析試驗(yàn)鑒定，以驗(yàn)證制備和加工的效果。顯微鏡檢驗(yàn)表明制劑中存在菱形晶體。將一份1ml充分再懸浮的制劑在14000 RPM下離心30分鐘。小心地取出上清液，向800μl該溶液中加入1μl 9.6M鹽酸。然后將一份20μl的該混合物注入到用逆相法運(yùn)行的HPLC系統(tǒng)上。此試驗(yàn)結(jié)果表明，上清液中含有0.034U/ml未結(jié)晶的LysB28ProB29-人胰島素。為測(cè)定制劑的總藥效，用3μl9.6M的鹽酸將1ml重新懸浮的制劑酸化，然后用0.01M鹽酸將樣品稀釋至5ml。將一份20μl的樣品注入到按逆相法運(yùn)行的HPLC系統(tǒng)上。實(shí)測(cè)的總藥效為43.6 U/ml。制劑的純度用逆相色譜法測(cè)定，直接注入酸化過(guò)的(用3μl 9.6M鹽酸)1ml樣品的20μl。根據(jù)峰值與總量比較測(cè)得純度為98.3％。高分子量聚合物含量用尺寸排阻HPLC測(cè)定，直接注入酸化過(guò)的1ml液樣的20μl。根據(jù)峰值與總量比較測(cè)得聚合物總量為0.17％。
實(shí)施例4體外溶解試驗(yàn)此方法是對(duì)Graham和Pomeroy在藥物與藥理學(xué)雜志(J.Pharm.Pharmacol.)36，427-430(1983)中公開(kāi)的方法的改進(jìn)。本領(lǐng)域把此方法作為對(duì)生物響應(yīng)的預(yù)測(cè)，它使用晶體在用不與鋅結(jié)合的緩沖液充分稀釋后的溶解比率作為手段，來(lái)預(yù)測(cè)晶態(tài)制劑在皮下注射到動(dòng)物內(nèi)之后的溶解比率。
晶態(tài)的LysB28ProB29-人胰島素(40U/ml)制劑(表1中的LysPro)對(duì)照HumulinTM超長(zhǎng)效胰島素和兩種40U/ml人胰島素長(zhǎng)效制劑進(jìn)行試驗(yàn)。將0.2ml一份的這些懸浮液分別在環(huán)境溫度和攪拌下加到裝在玻璃燒杯中的20ml 0.1M pH7.5的Tris(三羥甲基氨基甲烷，Mallinckrodt，Paris，KY)緩沖液中。在0.5、3和8小時(shí)后自攪拌著的樣品中取出0.2ml的液樣并通過(guò)0.2μm的Acrodisc濾器。用逆相HPLC法定量測(cè)定濾液中的胰島素量。由開(kāi)始時(shí)對(duì)未過(guò)濾的酸化的液樣進(jìn)行的試驗(yàn)確定最大胰島素含量。對(duì)于各樣品，數(shù)據(jù)以對(duì)最大胰島素含量的百分?jǐn)?shù)的形式列出。
表1.體外溶解試驗(yàn)的時(shí)間依賴性時(shí)間(小時(shí))樣 品0.5 3 8HumulinTM超長(zhǎng)效胰島素 17.7％ 51.0％ 90.4％HumulinTM長(zhǎng)效胰島素，1 43.0％ 74.9％ 98.2％HumulinTM長(zhǎng)效胰島素，2 45.6％ 61.7％ 80.1％LysPro晶體 26.0％ 67.6％ 95.0％
表1的結(jié)果表明，LysB28ProB29-人胰島素晶體的溶解性質(zhì)具有延長(zhǎng)的藥效持續(xù)時(shí)間。
實(shí)施例5LysB28ProB29-人胰島素晶體的制備，對(duì)于U400晶態(tài)懸浮液LysB28ProB29-人胰島素部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入1.048g鋅和少于500ppm的LysB28ProB29-人胰島素(酚濃度檢測(cè)不出)。將晶體懸浮在約30ml水中，加入0.942ml的10mg/ml酸性氧化鋅溶液。用10％鹽酸和10％氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到2.6。在溶液完全澄清后，加水使溶液的最終重量為38.95g。最終的溶液經(jīng)過(guò)0.22μm濾器(Millipore SterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。緩沖液部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入0.565g乙酸鈉和4.947g氯化鈉。用大約25g水將鹽溶解，用10％氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至約11.52。調(diào)節(jié)完pH之后，加水使溶液的最終質(zhì)量為30g。最終溶液經(jīng)0.22μm濾器(Millipore SterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。結(jié)晶將LysB28ProB29-人胰島素部分和緩沖液部分進(jìn)行試驗(yàn)性組合(0.75ml LysB28ProB29-人胰島素部分和0.45ml緩沖液部分)，以確定為達(dá)到pH5.5-5.6的最終結(jié)晶條件所需的緩沖液部分的合適pH值。用0.28ml 10％氫氧化鈉溶液將緩沖液部分調(diào)節(jié)到pH為12.13，以便在與LysB28ProB29-人胰島素部分混合后pH為5.6。采用下列條件配制50ml400U/ml的UltraLente LysB28ProB29-人胰島素部分(晶體部分)。向結(jié)晶容器中加入30.61g LysB28ProB29-人胰島素部分，這是按LysB28ProB29-人胰島素部分加上晶種等于晶體部分體積的62.5％估算出的。在攪拌下向容器中加入按晶體部分37.5％算出的18.75ml緩沖液部分。60秒之后，向晶體部分中加入按照1/2官能度乘以LysB28ProB29-人胰島素的克數(shù)估算出的0.824ml人胰島素晶種混合物(官能度＝2)。在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌48小時(shí)。
48小時(shí)后用顯微鏡(600倍放大)檢驗(yàn)該懸浮液，發(fā)現(xiàn)其中包含由輪廓分明的菱形晶體、結(jié)晶不好的晶體及無(wú)定形物質(zhì)構(gòu)成的混合物。
實(shí)施例6LysB28ProB29-人胰島素?zé)o定形沉淀物的制備LysB28ProB29-人胰島素部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入0.994g含鋅的LysB28ProB29-人胰島素(內(nèi)源性鋅0.43％，苯酚濃度2663ppm)。將該晶體懸浮在約30ml水中，向溶液中加入0.515ml的10mg/ml酸性氧化鋅溶液。用0.220ml10％鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3.6。在溶液完全澄清后，加水使溶液的最終重量為40g。最終的溶液經(jīng)0.22μm濾器(Millipore SterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。緩沖液部分向帶刻度的裝有磁攪棒的燒杯中加入0.565g乙酸鈉和4.947g氯化鈉。加入約25g水將鹽溶解，用10％氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到約12.6。調(diào)節(jié)完pH后，加水至最終質(zhì)量為30g。溶液經(jīng)0.22μm的濾器(MilliporeSterivexTM-GV過(guò)濾裝置)過(guò)濾。無(wú)定形懸浮液LysB28ProB29-人胰島素部分和緩沖液部分進(jìn)行試驗(yàn)性組合(0.75mlLysB28ProB29-人胰島素部分和0.45ml緩沖液部分)，以確定為達(dá)到pH 7.2-7.4的最終溶液所需的緩沖液部分的合適pH值。向緩沖液部分加入額外的10％鹽酸將pH調(diào)節(jié)到12.2。最終的組合溶液中含有31.25mlLysB28ProB29-人胰島素部分和18.75ml緩沖液部分，pH為7.3。在環(huán)境溫度下繼續(xù)攪拌24小時(shí)。
48小時(shí)后用顯微鏡(600倍放大)檢驗(yàn)該懸浮液，發(fā)現(xiàn)其中只含無(wú)定形物質(zhì)。
實(shí)施例7晶態(tài)和無(wú)定形混合制劑為制備一種長(zhǎng)效制劑，將70％的實(shí)施例1的晶態(tài)LysB28ProB29-人胰島素懸浮液與30％實(shí)施例6的無(wú)定形的LysB28ProB29-人胰島素懸浮液混合。
權(quán)利要求
1.一種具有長(zhǎng)效的非胃腸道藥物制劑，它主要由約20U/ml-約500U/ml胰島素類似物的無(wú)菌含水懸浮液，約5mg/ml-約10mg/ml氯化鈉，約0.2-約2.0mg/ml生理上容許的緩沖劑，約0.04mg/ml-約20.0mg/ml的鋅離子和生理上容許的防腐劑組成，pH為約6.5-約7.8；這使得懸浮液中存在的類似物處于溶解狀態(tài)的不到5％。
2.權(quán)利要求1的制劑，其中的胰島素類似物是LysB28ProB29-人胰島素。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中懸浮液中存在的類似物基本上是晶態(tài)物質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的非胃腸道藥物制劑，其中胰島素類似物濃度約為40U/ml，氯化鈉濃度約為7mg/ml，緩沖劑為約1.6mg/ml的乙酸鈉，pH約為7.0-約7.4。
5.權(quán)利要求3的非胃腸道藥物制劑，其中胰島素類似物濃度為約100U/ml，氯化鈉濃度為約7mg/ml，緩沖劑為約1.6mg/ml的乙酸鈉，pH為約7.0-約7.4。
6.權(quán)利要求1的制劑，其中懸浮液中存在的類似物基本上是無(wú)定形物質(zhì)。
7.權(quán)利要求1的制劑，其中懸浮液中存在的類似物是約70％晶態(tài)和約30％無(wú)定形的物質(zhì)。
8.利用從溶液中沉淀晶體制備的一種胰島素類似物晶體，該溶液主要由約200-約1200U/ml胰島素類似物、約50mg/ml-約100mg/ml氯化鈉、約2.0-約20.0mg/ml生理上容許的緩沖劑和摩爾量過(guò)剩的鋅離子組成，其pH為約5.0-約6.0。
9.利用從溶液中沉淀晶體制備的一種胰島素類似物晶體，該溶液主要由約200-約1200U/ml胰島素類似物、約50mg/ml-約100mg/ml氯化鈉、約2.0-約20.0mg/ml生理上容許的緩沖劑、約500ppm-約3000ppm的苯酚和摩爾量過(guò)剩的鋅離子，pH約為5.0-約6.0。
10.一種胰島素類似物晶體，它通過(guò)將以下的第一種溶液和第二種溶液混合制得第一種溶液中含有約300U/ml-約2000U/ml的胰島素類似物，約500ppm-約3000ppm苯酚和摩爾量過(guò)剩的鋅離子，pH為約2.0-約3.0；第二種溶液含有約130mg/ml-約270mg/ml氯化鈉，約5.0-約55.0mg/ml生理上容許的緩沖劑，pH為約10.5-12.5；這使得混合后的溶液的pH為5.0-6.0。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的晶體，其中胰島素類似物是LysB28ProB29-人胰島素。
12.一種制備LysB28ProB29-人胰島素晶體的方法，該方法包括將第一種溶液與第二種溶液混合；第一種溶液中含有約300U/ml-約2000U/ml胰島素類似物、約500ppm-約3000 ppm苯酚和摩爾量過(guò)剩的鋅離子，pH為約2.0-約3.0；第二種溶液含約130mg/ml-約270mg/ml氯化鈉、約5.0-約55.0mg/ml生理上容許的緩沖劑，pH為約10.5-12.5；混合后溶液的pH為5.0-6.0。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了具有長(zhǎng)效的各種非胃腸道藥物制劑,該制劑含有:約20/U/ml－約500U/ml胰島素類似物的滅菌水懸浮液,約5mg/ml－10mg/ml氯化鈉,約0.2－約2.0mg/ml生理上容許的緩沖劑,約0.07mg/ml－約0.1mg/ml的鋅離子和生理上容許的防腐劑,pH為約6.5－約7.8;這使得懸浮液中存在的胰島素類似物處在溶解狀態(tài)的不到5%。
文檔編號(hào)A61K38/28GK1185114SQ96194052
公開(kāi)日1998年6月17日 申請(qǐng)日期1996年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月31日
發(fā)明者M·R·德費(fèi)利皮斯, B·H·弗蘭克 申請(qǐng)人:伊萊利利公司