專利名稱：疏水藥物-白蛋白-葡聚糖納米乳液及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水包油型納米乳液及其制備方法，以及該乳液在制備疏水藥物注射制劑中應用。
背景技術(shù)：
大多數(shù)抗腫瘤藥物在水中的溶解性很小。例如紫杉醇幾乎不溶于水，目前臨床常用的紫杉醇制劑是用聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)制成的紫杉醇制劑。雖然聚氧乙烯蓖麻油對紫杉醇有良好的增溶作用，但會引起過敏反應以及在稀釋后容易形成沉 淀(Constantinides，P. P.，et al.，Pharmaceutical Research, 2000. 17: p. 175-182.)。為了解決這些問題，很多學者制備了紫杉醇乳劑。如陳建明等人利用注射油和乳化劑(注射用大豆磷脂，卵磷脂，波洛沙姆188，或單油酸甘油酯中的一種或一種以上的混合物)等通過PH調(diào)節(jié)和高壓均質(zhì)方法制備了靜脈注射用紫杉醇乳劑(中國專利號 200410068134. 3 ；200810100234. 8)。由美國生命科學(American Bioscience)公司開發(fā)的白蛋白結(jié)合紫杉醇納米粒注射混懸液(ABRAXANE)，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床治療中有很好的療效(Stinchcombe, Τ. E.，Nanomedicine, 2007. 2: p. 415-423.)。研究表明，白蛋白可利用細胞膜上的白蛋白受體Gp60及細胞膜穴樣內(nèi)凹(caveolae)，以及腫瘤組織中富含的半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)的作用，促使藥物進入腫瘤細胞內(nèi)，增加化療作用 (Hawkins, Μ. J. , et al. , Advanced Drug Delivery Reviews, 2008. 60: p. 876-885·)。 目前，疏水藥物-白蛋白體系已有很多報道(專利號US 2006121119, WO 9814174，US 2001046961)。在載藥納米粒子的表面修飾多糖，如茁霉多糖，殼聚糖，葡聚糖等可以增加納米粒子在體內(nèi)的循環(huán)時間，使得載藥納米粒子避免被巨噬細胞吞噬而成功地輸送到靶向病灶(Liu, Ζ.G. , et al., Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2007. 83A: p. 806-812. ； Couvreur, P. , et al. , European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004. 58: p. 327-341. ； Labarre, D., et al. , Pharmaceutical Research, 1998. 15: p. 1046-1050.)。除此而外，在載藥納米粒子的表面修飾多糖還可以增加納米粒子在水溶液中的穩(wěn)定性。利用蛋白質(zhì)-多糖接枝復合物制備乳液已經(jīng)有很多研究。由于蛋白質(zhì)具有兩親性質(zhì)，在乳化過程中分布在油水界面，穩(wěn)定水包油乳滴，位于乳滴外部的親水多糖使得乳滴在水溶液中均勻分散。但是到目前為止，還沒有一個蛋白質(zhì)_多糖乳液體系能夠滿足注射制劑的要求。一個主要問題是多糖的接枝效率不高，在制備蛋白質(zhì)-多糖復合物的反應中，多糖的質(zhì)量必須大大高于蛋白質(zhì)的質(zhì)量才能使一定數(shù)目的多糖接枝到蛋白質(zhì)表面，達到乳化以后穩(wěn)定乳液的目的(專利號 WO 2006/090110 Al, K. K. Xu., et al.，Langmuir, 2009. 25: p. 9714-9720.)。因此，所報道的蛋白質(zhì)-多糖復合物乳液中自由多糖含量很高，只適合于食品工業(yè)的應用(McClements, D. J. et al.，Advances in Colloid and Interface Science, 2010. 159: p. 213-228.)，不適合于疏水藥物注射制劑的應用。另一個主要問題是所形成的蛋白質(zhì)油-水界面膜不穩(wěn)定，乳滴會發(fā)生融合，尺寸逐漸增加，從而導致乳液分層和油水分離。還有一個主要問題是乳滴的粒徑過大，不能通過濾膜除菌，而加熱除菌會導致乳滴聚集，因此不能滿足注射制劑的要求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)油-水界面膜穩(wěn)定，乳滴不易聚集，因而能滿足注射制劑要求的水包油型納米乳液及其制備方法，以及該乳液在制備疏水藥物注射制劑中應用。本發(fā)明提供的水包油型納米乳液，是一種疏水藥物-白蛋白-葡聚糖納米乳液。該納米乳液中乳滴的結(jié)構(gòu)是以包含疏水藥物的油相為內(nèi)核，白蛋白為油水界面膜，葡聚糖位于油滴外部以保持油滴在水相中的穩(wěn)定性。本發(fā)明中，所述的白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他動物血清白蛋白。本發(fā)明中，所述的葡聚糖的分子量在2000-70000之間。本發(fā)明中，所述的藥物是可以溶解在油相中的疏水藥物。包括紫杉醇、阿霉素、喜樹堿等等，但不限于這些。本發(fā)明提供的水包油型納米乳液(疏水藥物-白蛋白-多糖納米乳液)的制備方法，是利用Maillard反應制備白蛋白-葡聚糖共價復合物；再將白蛋白-葡聚糖復合物溶解在水溶液中，將疏水藥物溶解或者分散在大豆油中；將上述制備的水性溶液和油性溶液混合，通過高壓均質(zhì)方法制得水包油納米乳液；再加熱制得的水包油納米乳液，形成穩(wěn)定的白蛋白油水界面膜，從而得到穩(wěn)定的載藥納米乳液。其中，制備條件是
(1)白蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比在1:0.4到1:2之間，通過Maillard反應制備白蛋白-葡聚糖共價接枝復合物；
(2)白蛋白-葡聚糖復合物溶解在水中，其中白蛋白濃度為1-50mg/ml，調(diào)節(jié)溶液pH 在3. 0-8. 0區(qū)間；
(3)將疏水藥物溶解于大豆油中，濃度為1-500mg/ml ；
(4)混合白蛋白-葡聚糖復合物水溶液和疏水藥物油溶液，油溶液與水溶液的體積比在1: 2到1:15之間；
(5)通過高壓均質(zhì)制備納米乳液，其中高壓均質(zhì)的壓力大于500bar，高壓均質(zhì)時間大于2分鐘；
(6)加熱制得的水包油納米乳液，溫度在80°C以上，加熱時間至少30分鐘。本發(fā)明中，所述Mai Ilard反應制備白蛋白-葡聚糖共價復合物，具體可參見中國專利:200710040028ο本發(fā)明中，所述高壓均質(zhì)是高效制備納米乳液的方法，可參見Donsi，F(xiàn)., et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010. 58: p. 10653-10660.。在高壓下所產(chǎn)生的強烈剪切，撞擊和空穴作用，使液態(tài)物質(zhì)得到超細微化。兩親性的白蛋白在高壓均質(zhì)的過程中發(fā)生二硫鍵交換、氫鍵重排及疏水相互作用使得白蛋白在乳滴表面形成油水界面膜，從而將油滴固定并同時實現(xiàn)了疏水藥物的高效負載。連接在白蛋白上的葡聚糖由于其親水性而在乳滴表面伸展，避免乳滴聚集。
加熱可以使蛋白質(zhì)變性，形成分子間疏水聚集和二硫鍵交聯(lián)。對蛋白質(zhì)乳液進行加熱，位于油水界面的蛋白質(zhì)會進一步發(fā)生分子間相互作用，從而形成高度交聯(lián)的蛋白質(zhì)膜，達到乳液長期穩(wěn)定和將疏水藥物固定在油相中的目的。加熱還可以達到滅菌的目的。通過 動態(tài)光散射分析，可以得到納米乳液的粒徑和多分散系數(shù)。本發(fā)明的載藥納米乳液的粒徑為200 nm左右。乳液可以通過450 nm濾膜達到除菌的目的。透射電鏡實驗表明(附圖1)乳滴的粒徑較為均一。電位分析(附圖2)表明多糖位于乳滴的表面。本發(fā)明制備的水包油型納米乳液可作為疏水藥物注射制劑加以應用。例如，通過本發(fā)明方法制備的紫杉醇納米乳液在ρΗ 7. 4生理條件下長期穩(wěn)定，說明乳滴表面的葡聚糖很好地阻止了乳滴的聚集。體外細胞實驗表明，空白乳液幾乎沒有毒副作用，而紫杉醇乳液與自由紫杉醇的藥效相同。荷腫瘤小鼠實驗結(jié)果表明，與目前臨床上使用的商品紫杉醇注射液相比，本發(fā)明制備的紫杉醇乳液具有更好的腫瘤抑制和生命延長效果。


圖1.紫杉醇_白蛋白-葡聚糖乳液的透射電子顯微鏡照片。圖2.白蛋白(BSA)和紫杉醇-白蛋白-葡聚糖乳液在不同ρΗ條件下的ζ-電位。圖3.不同濃度的紫杉醇(PTX)DMSO溶液和紫杉醇-白蛋白-葡聚糖乳液對KB細胞存活率的影響。圖4. KB細胞與紫杉醇(PTX)DMSO溶液和紫杉醇-白蛋白-葡聚糖乳液保存不同時間后的存活率。
具體實施例方式實施例1.將牛血清白蛋白(BSA)和葡聚糖(62 kDa)用去離子水溶解，其質(zhì)量投料比1:0.93 (BSA:葡聚糖)，待溶解混合均勻后調(diào)節(jié)溶液ρΗ值到8.0，然后將溶液冷凍干燥。將凍干后的固體放入燒杯中，置于裝有KBr飽和溶液的密閉容器中(容器內(nèi)相對濕度為79%)，在60°C下進行Maillard反應48小時后得到白蛋白-葡聚糖共價復合物。將白蛋白-葡聚糖共價復合物用去離子水溶解，濃度為19.3 mg/ml。然后將復合物水溶液與注射用大豆油混合，油水體積比為1:4，混合溶液經(jīng)高速均質(zhì)(10000轉(zhuǎn))1分鐘后，再經(jīng)高壓 400^1200 bar均質(zhì)廣5分鐘，然后將乳液在90°C加熱1小時，即可得到白蛋白-葡聚糖空白納米乳液。表1的結(jié)果顯示在800 bar條件下，當高壓均質(zhì)時間超過3分鐘時，即可得到粒徑較小并且分散均一的乳液。表2的結(jié)果顯示在均質(zhì)時間為4分鐘的條件下，高壓均質(zhì)壓力越高，所得到的乳滴粒徑越小。加熱對乳滴粒徑?jīng)]有影響，表明乳滴表面的葡聚糖阻止了乳滴在加熱過程中的聚集。表1.在固定高壓均質(zhì)壓力800 bar條件下，不同高壓均質(zhì)時間對乳滴粒徑的影響。
權(quán)利要求
1.一種疏水藥物-白蛋白-葡聚糖納米乳液，其特征在于該納米乳液中乳滴的結(jié)構(gòu)是以包含疏水藥物的油相為內(nèi)核，白蛋白為油水界面膜，葡聚糖位于油滴外部以保持油滴在水相中的穩(wěn)定性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米乳液，其特征在于所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他動物血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米乳液，其特征在于所述的葡聚糖的分子量在 2000-70000 之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米乳液，其特征在于所述的疏水藥物為油溶性的疏水藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米乳液，其特征在于所述的疏水藥物為紫杉醇、阿霉素或喜樹堿。
6.如權(quán)利要求1所述的疏水藥物_白蛋白_多糖納米乳液的制備方法，其特征是利用 Maillard反應制備白蛋白-葡聚糖共價復合物；將白蛋白-葡聚糖復合物溶解在水溶液中，將疏水藥物溶解或者分散在大豆油中；將上述制備的水性溶液和油性溶液混合，通過高壓均質(zhì)方法制得水包油納米乳液；再加熱制得的水包油納米乳液，形成穩(wěn)定的白蛋白油水界面膜，從而得到穩(wěn)定的載藥納米乳液；其中(1)白蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比在1:0.4到1:2之間；(2)白蛋白-葡聚糖復合物溶解在水中，其中白蛋白濃度為1-50mg/ml，調(diào)節(jié)溶液pH 在3. 0-8. 0區(qū)間；(3)將疏水藥物溶解于大豆油中，濃度為1-500mg/ml ；(4)混合白蛋白-葡聚糖復合物水溶液和疏水藥物油溶液，油溶液與水溶液的體積比在1:2到1:15之間；(5)通過高壓均質(zhì)制備納米乳液，其中高壓均質(zhì)的壓力大于500bar，高壓均質(zhì)時間大于2分鐘；(6)加熱制得的水包油納米乳液，溫度在80°C以上，加熱時間至少30分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的疏水藥物-白蛋白-葡聚糖納米乳液在制備疏水藥物注射制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種疏水藥物-白蛋白-葡聚糖納米乳液及其制備方法和應用。本發(fā)明的納米乳液中乳滴的結(jié)構(gòu)是以包含疏水藥物的油相為內(nèi)核，白蛋白為油水界面膜，葡聚糖位于油滴外部以保持油滴在水相中的穩(wěn)定性。制備方法包括利用Maillard反應制備白蛋白-葡聚糖共價復合物，將白蛋白-葡聚糖復合物溶解在水溶液中，將疏水藥物溶解或者分散在大豆油中；將兩種溶液混合，通過高壓均質(zhì)方法制得水包油納米乳液；再加熱制得的水包油納米乳液，形成穩(wěn)定的白蛋白油水界面膜，從而得到穩(wěn)定的載藥納米乳液。本發(fā)明納米乳液中蛋白質(zhì)油-水界面膜穩(wěn)定，乳滴不易聚集，因而能滿足注射制劑要求，可以作為疏水藥物注射制劑予以應用。
文檔編號A61K31/337GK102302450SQ20111026150
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者姚萍, 戚佳寧 申請人:復旦大學