專利名稱：齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒藥物和試劑研發(fā)領(lǐng)域，尤其是涉及一種齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)嚴(yán)重威脅全人類的健康,全球40%的慢性肝病和80%的肝細(xì)胞癌與HCV有關(guān)。目前沒(méi)有預(yù)防HCV感染的疫苗，目前的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案是聚乙二醇干擾素和病毒唑(Ribavirin)的聯(lián)合治療，這種治療僅對(duì)不足50%的感染者有效。2011年，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)了兩種口服的HCV蛋白酶抑制劑boc印revirand telaprevir。這兩種藥物聯(lián)合聚乙二醇干擾素和病毒唑能顯著提高丙型肝炎患者的病毒清除率，但是，這些藥物有副作用，而且對(duì)難治性丙型肝炎患者的治療效果仍然不理想。 因此研發(fā)新的有效安全的特異性丙型肝炎治療藥物是國(guó)內(nèi)外HCV基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)的熱點(diǎn)和前沿。HCV基因組為正鏈RNA，屬黃病毒科。HCV的開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)3000多個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白前體。該多聚蛋白前體經(jīng)宿主蛋白酶和HCV編碼的蛋白酶切割后產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(core、El和E2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。NS5B蛋白全長(zhǎng)591個(gè)氨基酸，它具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。NS5B的活性喪失會(huì)導(dǎo)致HCV在感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制停止。由于正常的宿主細(xì)胞不存在NS5B或其類似物的表達(dá)，抑制NS5B的活性可特異性地阻斷HCV復(fù)制而不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，因此NS5B成為抗HCV藥物篩選的一個(gè)非常理想的靶點(diǎn)。以NS5B為靶點(diǎn)進(jìn)行抗HCV藥物的研發(fā)已有諸多報(bào)道，但是由于安全性或有效性差等原因，尚沒(méi)有一種以NS5B為靶點(diǎn)的抗HCV藥物進(jìn)入臨床使用。中藥女貞子長(zhǎng)期以來(lái)作為肝保護(hù)劑藥物使用。申請(qǐng)人前期構(gòu)建了以HCV RNA為模板的NS5B活性檢測(cè)系統(tǒng)，利用該活性檢測(cè)系統(tǒng)，在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)女貞子水提取物可顯著抑制NS5B的體外和細(xì)胞內(nèi)活性，揭示女貞子水抽提物有望成為抗HCV藥物的來(lái)源。但是，女貞子水提取物的活性成分及其是否具有抗HCV活性仍然不清楚。女貞子主要含有三萜類化合物、黃酮類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和對(duì)羥基苯乙醇苷類化合物以及多糖、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油、色素、礦物質(zhì)等多種化學(xué)成分。三萜類化合物在女貞子中的含量約為5. 61%，其中，齊墩果酸的含量較高。研究表明齊墩果酸可使變性壞死的肝組織恢復(fù)正常，還具有抗炎、抗人類免疫缺陷病毒(HIV)、抗突變和抗癌等作用。臨床上齊墩果酸作為治療急性黃疸性肝炎和慢性肝炎的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供齊墩果酸的新用途，即齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用，齊墩果酸能顯著抑制HCV在細(xì)胞感染模型中的增殖，體外和細(xì)胞內(nèi)活性抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HCV RNA依賴的RNA聚合酶NS5B是其作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一、材料和方法
1、細(xì)胞和質(zhì)粒
Huh-7. 5. I (美國(guó) Francis V. Chisari 教授惠贈(zèng))，攜帶 HCVJFHl (基因型 2a)全基因組的質(zhì)粒PJFHl (日本Takaji Wakita教授惠贈(zèng))，NS5B細(xì)胞內(nèi)活性檢測(cè)報(bào)告載體pcDNA- (-) Iuc- (-) IRES是通過(guò)把HCV正鏈5' UTR和熒光素酶基因反向連接至真核表達(dá)載體pcDNA3. I (-)獲得。穩(wěn)定表達(dá)NS5B的H印G2-5B細(xì)胞是通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV基因型Ia的H株NS5B至H印G2細(xì)胞獲得。HCV H和JFHl株的NS5B基因表達(dá)載體是通過(guò)把全長(zhǎng)的NS5B基因或C端刪去21氨基酸的NS5B Λ 21基因(確保蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)表達(dá)的可溶性)分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3. I ()或原核表達(dá)載體pET - His獲得。NS5B基因克隆所用引物如表I所示。

H表I本騷究使用的引翁-
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2、女貞子水提取物的制備和分離
女貞子(購(gòu)于江西南華醫(yī)藥有限公司)溶入雙蒸水(50g/1000mL)，放進(jìn)冰箱4° C過(guò)夜。使用功率可調(diào)控電爐，先大火煮沸，然后小火煎熬2小時(shí)。取煎熬的上清，過(guò)濾除去殘余的水不溶性殘?jiān)?。過(guò)濾后的上清用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯層用硅膠薄層層析板層析，展開(kāi)劑為三氯甲烷甲醇=18.5:1.5 (v/v)0使用乙酸乙酯收集5個(gè)層析組分(命名為組分1-5，

圖1)，凍干，-70° C冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，每種凍干組分溶入含2% 二甲基亞砜(DMSO)的DMEM培養(yǎng)基。3、其它試劑
齊墩果酸、熊果酸和紅景天苷購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。女貞苷和榭皮素購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司。這些標(biāo)準(zhǔn)品的純度> 98%?？诜凝R墩果酸片購(gòu)于九芝堂股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H50020241，齊墩果酸凈含量 26 %)，口服的熊果酸膠囊購(gòu)于三九醫(yī)藥貿(mào)易有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000115，熊果酸凈含量^ 11 %)，病毒唑(Ribavirin)購(gòu)于Sigma-Aldrich0 HCV NS5B 抑制劑 2’-O-Me-CTP 購(gòu)于 Tri I ink。HCV NS3/4A 蛋白酶抑制劑ITMN-191和MK-7009分別購(gòu)于Axon Medchem BV和Merck。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每種試劑溶入含2%DMSO的DMEM培養(yǎng)基。4、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
噻唑藍(lán)(MTT)測(cè)定試劑的細(xì)胞毒性，具體步驟如下每孔細(xì)胞加入5mg/mL的MTT，37° C孵育4 一 6小時(shí)，然后加入終濃度為50%的DMS0，振蕩10分鐘，讓還原產(chǎn)物充分溶解，顯微鏡下觀察著色顆粒消失后，在20分鐘內(nèi)，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度(0D)。測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為630nm。試劑未處理組的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照(100%)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。5、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的NS5B活性
試劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)的NS5B活性抑制效果通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定。報(bào)告載體P cDNA-(-)luc-(-)IRES用Pst I酶切，回收酶切的約6. Okb大片斷(命名為CLI，該片斷中螢火蟲(chóng)熒 光素酶基因和HCV 5'非翻譯區(qū)依次反向連接在CMV啟動(dòng)子后面)。CLI (O. Iyg/孔)和內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒PRL — CMV (O. OOlyg/孔)共轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HCV基因型Ia H株NS5B的H印G2-5B細(xì)胞或瞬時(shí)表達(dá)HCV基因型2a JFHl株NS5B的Huh7. 5. I細(xì)胞。6小時(shí)后，各種試劑以不同濃度處理細(xì)胞，2天后，收獲細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。6、體外NS5B活性抑制實(shí)驗(yàn)
6. I、體外轉(zhuǎn)錄制備(-)3' TRNA模板
以質(zhì)粒pUCRT/ T7-5' U TR(美國(guó)羅廣湘教授惠贈(zèng))為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含負(fù)鏈3'末端區(qū)[(_) 3' terminal region，簡(jiǎn)稱為(_) 3' T]序列的DNA片段。擴(kuò)增的(-)T序列是自負(fù)鏈RNA3,端開(kāi)始Int到578nt的序列，對(duì)應(yīng)于正鏈RNA中Y UTR和其下游Core蛋白的部分編碼區(qū)。(_) 3' T序列實(shí)質(zhì)上是HCV 5' U TR及其下游序列反向插入到質(zhì)粒的克隆位點(diǎn)區(qū)。PCR擴(kuò)增片段克隆至質(zhì)粒P GEM3Zf ( + )中，獲得重組質(zhì)粒P GEM2 (-) T0 P GEM-(-) T質(zhì)粒經(jīng)PstI酶切后，用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄按照T7 RNA聚合酶的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。I. 5 %甲醛變性凝膠電泳用于分離和鑒定體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(圖2)。RNA回收試劑盒The RNaid Kit用于RNA的純化。RNA濃度通過(guò)測(cè)定A260值確定。6. 2、NS5B蛋白的表達(dá)和純化
將攜帶H株或JFHl株的NS5BA21表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Ni-NTA層析柱純化NS5B Λ 21蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析蛋白的表達(dá)與純化如圖3和圖4所示。6. 3、NS5B催化的體外RNA合成實(shí)驗(yàn)
反應(yīng)體積 50 μ L，含 20mmol/ L HEPES (p H8. O)，I. 5mmol/ L MnCl2，IOOmmoI/ LN H4AC，ImmoI/ LDDT，500 μ mol/ L GTP，各 250 μ mol/ L 的 CTP、A TP 和 U TP，40URNasin (Biostar ,) , 300ng NS5B蛋白，2_6mg/ L RNA模板和不同濃度的各種測(cè)試試齊U。30 °C反應(yīng)2h，加入10 μ L IOOmmoI/ L的EDTA終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)等體積酚/氯仿(IV/ IV)抽提，-70 °C乙醇沉淀，離心干燥后置于-20 °C保存，在檢測(cè)前，將干燥的產(chǎn)物用DEPC-H2O溶解。6. 4 Northern blot 檢測(cè) NS5B 催化合成的 RNA 產(chǎn)物
采用體外轉(zhuǎn)錄方法制備地高辛標(biāo)記的(_) 3' T探針。探針DNA模板系Pst I線性化的P GEM-(-) 3' T質(zhì)粒。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用T7 RNA聚合酶進(jìn)行，在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中添加了終濃度為50μπιΟ1/ L的Dig-ll-u TP。RNA產(chǎn)物經(jīng)I. 5 %甲醛變性凝膠電泳，用下行毛細(xì)管吸附法轉(zhuǎn)移到正電尼龍膜上。轉(zhuǎn)移完成后，正電尼龍膜120 °C交聯(lián)30min。探針雜交用 DIGEasy Hyb Granules 試劑盒完成,顯帶反應(yīng)用 DIGNucleic Acid Detection kit(NBT/ BCIP)試劑盒完成。7、HCVjrai 抑制實(shí)驗(yàn)
以質(zhì)粒PJFHl為模板體外轉(zhuǎn)錄制備HCVJFH-I基因組，該基因組轉(zhuǎn)染Huh7. 5. I細(xì)胞，10天后，收獲HCV JFHl，一 80 V保存。取ΙΟΟμΙ JFHl病毒感染24-well板培養(yǎng)的Huh_7. 5. I細(xì)胞，不同濃度的測(cè)試試劑處理細(xì)胞2天。收獲細(xì)胞分成兩組，一組用于實(shí)時(shí)RT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒RNA水平，實(shí)時(shí)RT-PCR所用引物如表I所示；另一組用于Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)HCVJFHlCore蛋白水平。8、HPLC 實(shí)驗(yàn)
五種女貞子水提取物分離組分齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、女貞苷和榭皮素使用Waters Alliance 2690 HPLC和C18反相HPLC柱分析。移動(dòng)相，流速和測(cè)試波長(zhǎng)如圖6和7所示。9、統(tǒng)計(jì)分析
相對(duì)定量方法用于分析實(shí)時(shí)定量RT-PCR，熒光素酶和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。抑制效果或細(xì)胞毒性效果用試劑處理組相對(duì)于試劑未處理組的百分比表示。不同實(shí)驗(yàn)組之間差異統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 11. 5軟件的ANOVA分析，P < O. 05為組間差異顯著。50%抑制濃度(IC50)和 50% 細(xì)胞毒性濃度(CC50)使用 SPSS11. 5 軟件的 probit analysis of regression 計(jì)
笪
ο二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
I、女貞子水提取物分離組分對(duì)HCV基因型la NS5B活性的影響組分I和2劑量依賴地抑制細(xì)胞內(nèi)的NS5B活性(p〈0. 001)，而組分3，4和5在測(cè)試的劑量?jī)?nèi)沒(méi)有任何抑制效應(yīng)(圖5A)。組分I和2的IC50分別是33. 8 μ g/ml和5· 5 μ g/ml (表2)，顯示組分2有比組分I更強(qiáng)的抑制NS5B活性能力。作為陽(yáng)性對(duì)照，NS5B抑制劑2’-O-Me-CTP在本實(shí)驗(yàn)中的IC50為8. 4 μ g/ml (表2).使用另外兩批女貞子水提取物分離組分也獲得了類似的結(jié)果。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)五種分離組分在高達(dá)200 μ g/ml時(shí)也沒(méi)有細(xì)胞毒性(表3)。NS5B催化的體外RNA合成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組分I和2劑量依賴地抑制NS5B活性，與細(xì)胞內(nèi)活性抑制效果一致，組分2比組分I有更強(qiáng)的抑制體外NS5B活性能力。作為陽(yáng)性對(duì)照，2 μ g/ml的2’ -O-Me-CTP顯著抑制NS5B活性(圖5B)。這些結(jié)果表明女貞子水提取物分離組分I和2直接抑制NS5B的RNA依賴的RNA聚合酶活性，而且組分2比組分I有更強(qiáng)的抑制體外NS5B活性能力。
權(quán)利要求
1.齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用。
2.齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒試劑中的應(yīng)用。
3.齊墩果酸在制備丙型肝炎病毒聚合酶NS5B抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了齊墩果酸在抗丙型肝炎病毒方面的一種新用途，即齊墩果酸在制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑中的應(yīng)用。齊墩果酸能顯著抑制丙型肝炎病毒在細(xì)胞感染模型中的增殖，體外和細(xì)胞內(nèi)活性抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶NS5B是其作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。齊墩果酸廣泛分布于植物界中,來(lái)源豐富,毒副作用小，齊墩果酸在細(xì)胞水平的抗HCVJFH1復(fù)制實(shí)驗(yàn)中的選擇指數(shù)(CC50/IC50)超過(guò)目前使用的治療藥物ribavirin。因此,齊墩果酸的這種新用途可用于制備抗丙型肝炎病毒藥物和試劑及其復(fù)制的聚合酶NS5B的抑制劑，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)效益。本發(fā)明具有較好的HCV研究和治療應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102872025SQ201210415268
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者孔令保, 李珊珊, 孫瑞娜, 吳曉玉, 汪俊 申請(qǐng)人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)