專利名稱：一種抗血栓和血小板聚集的小肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類由5個(gè)氨基酸組成的小肽，尤其涉及一類由5個(gè)氨基酸為核心序列的具有抗血小板聚集、抗血栓形成作用的小肽衍生物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓形成是多種心腦血管疾病共同的病理過程，包括心腦血管性血栓性栓塞、肺栓塞和深靜脈血栓形成等，是指在一定條件下，血液有形成分在血管(多數(shù)為小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞、相應(yīng)部位血供障礙的病理過程而形成的一系列綜合征。隨著社會(huì)的發(fā)展和人口老齡化的進(jìn)程，血栓性疾病的發(fā)病率逐年增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有1500萬(wàn)人死于血栓性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年的發(fā)病人數(shù)有1000萬(wàn)，病死人數(shù)有100萬(wàn)，致殘率也很高。血栓性疾病已經(jīng)占據(jù)全球疾病總死亡率的第一位。提高血栓性疾病的防治水平，減少其發(fā)病率，降低致殘率、死亡率，降低由此而產(chǎn)生的社會(huì)問題，已成為當(dāng)務(wù)之急。血栓形成主要有動(dòng)脈血栓形成和靜脈血栓形成兩種。大部分心肌梗死及80%的中風(fēng)是由于動(dòng)脈血栓形成引起，而心血管疾病引起死亡的病因中，靜脈血栓栓塞位列第三位。一般說來，以血小板為靶點(diǎn)的藥物用于治療動(dòng)脈血栓，而以凝血因子為靶點(diǎn)的藥物對(duì)治療靜脈血栓有顯著優(yōu)勢(shì)?？寡“逅幬铮S生素K拮抗劑，肝素及低分子量肝素是用于防治血栓形成最常用的藥物。但是，這些藥物的安全性、有效性使其臨床應(yīng)用受到很大的限制。例如，抗血小板藥物阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(Prasugrel)等，GPIIbIIIa抑制劑阿昔單抗(abciximab)、伊替巴肽(印tifibatide)等在抑制血小板聚集和血栓素A2合成的同時(shí)，具有胃腸道刺激和出血傾向等不良反應(yīng)。而肝素的抗凝效應(yīng)具有很大的個(gè)體差異，必需密切監(jiān)控出凝血時(shí)間。此外，不良反應(yīng)血小板減少癥雖然少見卻可嚴(yán)重威脅病人生命，進(jìn)一步限制了肝素和低分子量肝素在臨床的使用。維生素K拮抗劑具有更多的局限性，諸如與其他藥物的相互作用以及反應(yīng)性的個(gè)體差異。因此，研究開發(fā)新的高效低毒的抗血栓藥物具有十分重要的臨床意義。血小板參與血液凝固的過程并在血栓形成的啟動(dòng)和擴(kuò)大中起著十分重要的作用。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮下大分子物質(zhì)如膠原和凝血酶暴露，血小板可粘附其上，進(jìn)一步引發(fā)血小板聚集和血小板顆粒內(nèi)容物的釋放。多種血小板激活劑，如ADP，凝血酶和5-羥色胺等加強(qiáng)血小板反應(yīng)性。血小板活化后，血小板P選擇素和GPIIb/IIIa活性位點(diǎn)的暴露，促進(jìn)血小板和白細(xì)胞募集，而使血栓進(jìn)一步擴(kuò)大。隨機(jī)設(shè)計(jì)的大型臨床實(shí)驗(yàn)已證明血小板是心腦血管疾病的治療靶點(diǎn)，通過抑制血小板反應(yīng)性可顯著改善急性冠脈綜合征和經(jīng)皮血管再通術(shù)病人的愈后。但是，由于現(xiàn)有的抗血小板藥物存在著出血并發(fā)癥、血小板減少癥和藥物抵抗等不良反應(yīng)，新型抗血小板藥物仍然是目前的研究重點(diǎn)。通過前期大量的活性篩選，首次發(fā)現(xiàn)了由5個(gè)氨基酸組成的核心小肽序列具有抗血小板聚集、抗體內(nèi)血栓形成作用。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種小肽，可抑制血栓形成和血小板聚集?？捎糜谥苽淇寡ê脱“寰奂乃幬?。技術(shù)方案一種抗血栓和血小板聚集的小肽，序列為X-Arg-Y-X-Lys (X-精氨酸-Y-X-賴氨酸)，其中，χ為非極性氨基酸，所述非極性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表極性氨基酸，所述極性氨基酸為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。上述結(jié)構(gòu)組成核心序列的任意位置用有機(jī)物或無機(jī)物進(jìn)行修飾所產(chǎn)生的系列衍生物。上述結(jié)構(gòu)組成核心序列的上游和/或下游添加任意1 5個(gè)氨基酸序列所產(chǎn)生的衍生物。用上述結(jié)構(gòu)的小肽及其衍生物單獨(dú)或組合使用作為其它藥物的輔料或添加劑。一種抗血栓和血小板聚集的小肽，優(yōu)選序列為Ile Arg Thr Pro Lys。上述蛋白質(zhì)在制備抗血栓形成和血小板聚集藥物中的應(yīng)用。有益效果通過體外血小板聚集試驗(yàn)、體內(nèi)血栓形成試驗(yàn)表明，該小肽能以濃度依賴的方式抑制血小板聚集；同時(shí)，可明顯抑制大鼠體內(nèi)動(dòng)靜脈旁路血栓的形成。該小肽及其衍生物可以用于抗血小板聚集、抗血栓形成治療。綜上，該小肽可用于制備抗血栓和血小板聚集的藥物。


圖1. HPLC法分析純度；圖2. LC/MS確定分子量；圖3.對(duì)血小板聚集的抑制作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1小肽的固相合成以FMOC (9-芴甲氧羰基)為保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行固相合成，用95% (ν/ν)三氟乙酸、2. 5% (ν/ν)水和2. 5% (ν/ν)三異丙甲硅烷(TIA)將其從樹脂上裂解。用乙醚沉淀3次后，通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化多肽，以含0. 05% (ν/ν)三氟乙酸的0% 60%(ν/ν)乙腈為流動(dòng)相，3mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫。洗脫后樣品進(jìn)行冷凍干燥，以高效液相色譜法(HPLC)鑒定純度為95% (圖1)，用液-質(zhì)聯(lián)用分析儀(LC-MS)確定分子量為613. 76 (圖2)，與理論分子量一致。實(shí)施例2體外抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)人肘靜脈穿刺抽血，用A⑶液(9 1) (ν/ν)抗凝，150g離心8min，吸取富血小板血漿，再以650g離心IOmin ；棄去上清液，加入含lg/L的牛血清白蛋白的羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPEQ緩沖液吹散沉淀，調(diào)整血小板數(shù)至QOO 300)X109/L，每次測(cè)試取300 μ L，加入不同濃度的小肽10 μ L (0 2. Ommol/L)，最后加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)15 μ L至終濃度5 μ mol/L ；在LBY-NJ4血小板凝集儀(北京普利生)上連續(xù)測(cè)定60s，180s，300s，及最大血小板聚集率(RPA)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；同時(shí)計(jì)算血小板聚集抑制率{抑制率=[1-(RPA未加藥-RPA加藥后)/RPA未加藥]XlOO% }。結(jié)果顯示，隨小肽(IRTPK)濃度的增加，60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)逐漸減小，呈濃度依賴特性；IC50約為lmmol/L(圖3)。在小肽N 端或 C 端修飾 H2N- (CH2) 即 H2N- (CH2) 7-IRTPK 和 IRTPK- (CH2) 7-H2N(由上?？齐墓竞铣?，用上述相同方法考察修飾產(chǎn)物對(duì)血小板聚集的影響，結(jié)果顯示，修飾物對(duì)60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影響與核心序列一致。在小肽C端修飾氨基(即IRIPK-H2N)(由上?？齐墓竞铣?，用上述相同方法考察修飾產(chǎn)物對(duì)血小板聚集的影響，結(jié)果顯示，對(duì)60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影響與核心序列一致。在小肽N端或C端修飾磷酸基團(tuán)(即p-IRIPK和IRIPK-p)(由上?？齐墓竞铣?，用上述相同方法考察修飾產(chǎn)物對(duì)血小板聚集的影響，結(jié)果顯示，對(duì)60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影響與核心序列一致。在小肽N端和C端修飾氨基酸序列ISKPI (即ISKPIIRTPK和IRIPKISKPI)(由上?？齐墓竞铣?，用上述相同方法考察修飾產(chǎn)物對(duì)血小板聚集的影響，結(jié)果顯示，對(duì)60s、180s、300s及最大血小板聚集率(Max)的影響與核心序列一致。實(shí)施例3小肽單獨(dú)使用或與阿司匹林合用對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠15只，體重250_280g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK (浙)2008-0033。(2)實(shí)驗(yàn)過程將大鼠隨機(jī)分為8組，每組3只，分別為空白對(duì)照組(給予等體積的生理鹽水)，陽(yáng)性藥對(duì)照阿司匹林組(Sigma，10mg/kg)，低、中、高劑量小肽(IRTPK)組(0. 65,1.3,2. 6mg/kg)及低、中、高劑量與阿司匹林合用(10mg/kg阿司匹林+0. 65，1. 3，2.6mg/kg小肽)組。給藥容積為0.5mL/100g，除阿司匹林組灌胃給藥外，其余組均股靜脈注射給藥。手術(shù)前，在三段聚乙烯管的中段放入一根長(zhǎng)5cm的1號(hào)手術(shù)絲線，絲線兩端各多出0. 5cm固定于兩端聚乙烯管外，將生理鹽水溶液充滿聚乙烯管，作為插管。大鼠給予阿司匹林Ih后，其他組給藥5min后，用20% (ν/ν)烏拉坦按lg/kg麻醉，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及左頸外靜脈，將聚乙烯管一端插入右側(cè)頸總動(dòng)脈，另一端插入左頸外靜脈，打開動(dòng)脈夾，血液從右頸總動(dòng)脈經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜脈。開放血流15min后停止，迅速取出絲線，用濾紙吸取血栓表面的血液，精確稱重，總重量減去絲線重量，即為血栓濕重。以t檢驗(yàn)同生理鹽水組進(jìn)行比較，同時(shí)計(jì)算出血栓抑制率。血栓抑制率(％ )=
血栓濕重(生理鹽水組)_血栓濕重(試驗(yàn)組)-χ100%
血栓濕重(生理鹽水組)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了低劑量組，陽(yáng)性藥阿司匹林、高、中劑量小肽組及阿司匹林與小肽合用組能使血栓濕重顯著下降，與生理鹽水組比較，差異顯著(P < 0. 05)(表1)；且劑量與血栓形成抑制率呈明顯正相關(guān)(r = 0. 997 ；P < 0. 05)。表1對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓形成的影響(n = 3)
權(quán)利要求
1.一種抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于序列為X-Arg-Y-X-LyS，其中，X為非極性氨基酸，所述非極性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表極性氨基酸，所述極性氨基酸為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于在上述結(jié)構(gòu)組成核心序列的任意位置用有機(jī)物或無機(jī)物進(jìn)行修飾所產(chǎn)生的系列衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于在上述結(jié)構(gòu)組成核心序列的上游和/或下游添加任意廣5個(gè)氨基酸序列所產(chǎn)生的衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于用上述結(jié)構(gòu)的小肽及其衍生物單獨(dú)或組合使用作為其它藥物的輔料或添加劑。
5.一種抗血栓和血小板聚集的小肽，其特征在于優(yōu)選序列為Ile Arg Thr Pro Lys0
6.權(quán)利要求1或5所述蛋白質(zhì)在制備抗血栓形成和血小板聚集藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗血栓和血小板聚集的小肽，序列為X-Arg-Y-X-Lys，其中，X為非極性氨基酸，所述非極性氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸或苯丙氨酸；Y代表極性氨基酸，所述極性氨基酸為甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。通過體外血小板聚集試驗(yàn)、體內(nèi)血栓形成試驗(yàn)表明，該小肽能以濃度依賴的方式抑制血小板聚集；同時(shí)，可明顯抑制大鼠體內(nèi)動(dòng)靜脈旁路血栓的形成。該小肽及其衍生物可以用于抗血小板聚集、抗血栓形成治療。綜上，該小肽可用于制備抗血栓和血小板聚集的藥物。
文檔編號(hào)A61P7/02GK102391360SQ20111034129
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者吳國(guó)球 申請(qǐng)人:東南大學(xué)