專利名稱：胰高血糖素樣肽-2 類似物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2 (Glucagon Like Peptide-2, GLP-2)類似物及其在制備用于預(yù)防和/或治療胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥以及減輕化學(xué)療法和放射療法的胃腸道副作用的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
GLP-2 屬于胰高血糖素原衍生肽類(proglucagon-derived peptide, P⑶P)，是胰高血糖素原(proglucagon, PG)被激素原轉(zhuǎn)化酶(prohormone convertase, PC)降解的產(chǎn) 物之一，是由33個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量3900道爾頓，其氨基酸序列在哺乳動(dòng)物中具有高度保守性[Drucker DJ. Glucagon-like peptide 2. J Clin EndocrinolMetab, 2001, 86:1758-1774] 0 GLP-2由腸道L內(nèi)分泌細(xì)胞合成和釋放，并受攝食、神經(jīng)和內(nèi)分泌等因素調(diào)節(jié)，以進(jìn)食含碳水化合物和脂肪的食物對(duì)L內(nèi)分泌細(xì)胞的分泌活動(dòng)的刺激最為重要[Rocca AS. LaGreca J, Kalitsky J, Brubaker PL. Monounsaturated fatty aciddiets improve glycemic tolerance through increased secretion of glucagon-likepeptide-1. Endocrinology, 2001, 142:1148-55]。正常成人餐后 15 分鐘內(nèi)和 I 小時(shí)后兩個(gè)時(shí)期，血循環(huán)中GLP-2的濃度升高最顯著。GLP-2在腸粘膜組織及血液循環(huán)中存在的主要形式是完整的GLP-2，即GLP-2 (1_33)。GLP-2 (1_33)在人體血循環(huán)中的生物半衰期約7分鐘，其代謝主要通過腎臟排泄和腸道刷狀緣上的二酰肽肽酶4 (dipeptidylP印tidase-4，DPP-4)水解其氨基末端前兩個(gè)殘基，形成無活性的GLP-2 (2_33)。飼喂缺少DDP-4作用位點(diǎn)的GLP-2類似物的大鼠，其腸上皮生長(zhǎng)情況明顯好于飼喂天然GLP-2的大鼠。雙側(cè)腎臟切除的大鼠血中GLP-2的清除率明顯低于未切除腎臟大鼠。然而，GLP-2(2-33)最近被證實(shí)是GLP-2受體(GLP-2R)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，能抑制GLP-2 (1-33)和營養(yǎng)誘導(dǎo)的腸粘膜生長(zhǎng)[Shin ED, Estall JL, Izzo A, Drucker DJ, Brubaker PL. Mucosaladaptation to enteral nutrients is dependent on the physiologic actions ofglucagons-like peptide_2in mice. Gastroenterology, 2005，128:1340-53]。以上說明GLP-2的生物學(xué)活性受DDP-4水解，其降解產(chǎn)物拮抗和腎臟清除三者的調(diào)節(jié)。GLP-2對(duì)腸道的作用包括特異性地刺激腸粘膜的生長(zhǎng)，增強(qiáng)腸粘膜損傷后的再生；抑制腸粘膜上皮細(xì)胞和隱窩細(xì)胞的凋亡；增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞基底側(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(glucose transporter-2, GLUT2)的表達(dá)和對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)腸消化和吸收功能；抑制胃腸動(dòng)力和胃酸分泌；增強(qiáng)腸粘膜屏障功能；增加腸道血供。GLP-2對(duì)腸粘膜的作用基本上與年齡和性別無關(guān)，并且靜注、肌注、皮下注射或腹腔注射都有明顯效果[Burrin DG,Petersen Y, Stoll B, et al. Glucagon-like peptide 2:a nutrient-responsive gutgrowth factor. J Nutr, 2001，131:709-712]。
GLP-2受體(GLP-2R)是B型胰高血糖素-胰泌素樣G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，其表達(dá)具有高度組織特異性。免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，GLP-2R在人類腸內(nèi)分泌細(xì)胞、鼠腸神經(jīng)元以及大鼠、小鼠、狨猴的上皮下肌纖維母細(xì)胞上表達(dá)[Yusta B, HuangLj Munroe Dj et al. Enteroendocrine localization of GLP—2 receptor expression inhumans and rodents. Gastroenterology, 119:744-55 ；Bjerknes M，Cheng H. Modulationof specific intestinal epithelial progenitors by enteric neurons. Proc Natl AcadSci. 2001，98:12497-502]。腸細(xì)胞上缺乏GLP-2R的表達(dá)，說明GLP-2R促進(jìn)增生和細(xì)胞保護(hù)作用可能是間接的。GLP-2在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)是通過特異性GLP-2R介導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路實(shí)現(xiàn)的。GLP-2激活腺苷酸環(huán)化酶，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，后者活化蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可能通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+和/或三磷酸肌醇通路促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件的基因轉(zhuǎn)錄。GLP-2可通過磷酸化型細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)磷酸化體外培養(yǎng)的人腸黏膜上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的兩個(gè)異構(gòu)體ERK-I和ERK-2的蘇氨酸和酪氨酸殘基， 使其活性增加，從而顯著促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖。該作用能分別被特異性的酪氨酸蛋白激酶抑制劑(Genistein)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)抑制劑(LY294002)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑(PD098059)阻斷。另一方面，GLP-2R信號(hào)激活可抑制放線菌酮誘導(dǎo)的BHK-GLP-2R細(xì)胞凋亡，這與其抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶_3 (caspase-3)酶活性，減少多聚ADP核糖聚合酶分裂相關(guān)。并且不論P(yáng)KA抑制劑H289存在與否，GLP-2都能降低放線菌酮誘發(fā)的caspase-3的分裂。放線菌酮給藥后，在兩種激酶抑制劑即磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制劑LY294002和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑TO98054存在的條件下，GLP-2 也能增加細(xì)胞存活率[Yusta B, Estall J, Drucker DJ. Glucagon-Iikepeptide-2 recepter activation engages bad and glycogen synthase kinase-3 in aprotei kinase A-dependent manner and prevents apoptosis following inhibition ofphosphatidyl inositol 3-kinase. J Biol Chem, 2002, 277:24896-24906 ；ffalsh NA, YustaB，DaCambra MP, et al. Glucagon-like peptide-2 recepter activation in the ratintestinal mucosa. Endocrinology, 2003, 144:4385-4392],說明 GLP-2 的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)不完全依賴PI3-K和MAPK途徑。由此可見，GLP-2腸道作用機(jī)制所涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通道很復(fù)雜既包括cAMP依賴的蛋白激酶途徑，也包括酪氨酸激酶途徑、PI3-K和MAPK途徑。GLP-2作用的確切分子機(jī)制目前尚未完全闡明。GLP-2腸保護(hù)作用的人體試驗(yàn)?zāi)壳斑€處于起步階段，局限于短腸綜合征患者的治療性研究。已經(jīng)明確GLP-2具有促營養(yǎng)吸收作用，但是否有減輕腸損傷、促進(jìn)腸修復(fù)的作用還有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)。雖然治療過程中尚未發(fā)現(xiàn)GLP-2的不良作用，但考慮到GLP-2的生物學(xué)作用是在動(dòng)物胰高血糖素誘導(dǎo)腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)的，并且為裸鼠皮下注射胰高血糖素的研究顯示，GLP-2顯著促進(jìn)腸粘膜生長(zhǎng)，因此GLP-2是否會(huì)刺激腸道腫瘤的生長(zhǎng)尚難定論。就短腸綜合征的治療而言，GLP-2的有效性需要大規(guī)模人群隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)。GLP-2治療的最適劑量、給藥途徑、療程和應(yīng)用時(shí)機(jī)等都需要更深入的研究。相信GLP-2特殊的腸保護(hù)作用在防治吸收不良、炎性腸病、應(yīng)激性胃腸粘膜損傷等疾病方面具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。GLP-2以具有以下33個(gè)氨基酸的肽的形式分泌His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。GLP-2在體內(nèi)迅速地被酶DPPIV在氮端的2位丙氨酸(Ala)處切割形成GLP-2(3-33)而失活。除腎清除外，GLP-2 (1-33)的這種快速酶降解機(jī)制導(dǎo)致該肽在人體血循環(huán)中的半衰期為約7分鐘。Drucker等在US5，994，500中描述了 GLP-2拮抗劑及其對(duì)胃腸組織生長(zhǎng)的影響，其提出將所述拮抗劑配制成藥物用于治療增生或誘導(dǎo)發(fā)育不全。美國5，994，500通過突變例如替換和缺失來改變哺乳動(dòng)物GLP-2的結(jié)構(gòu)。US6, 184，208、US5, 789，379 和 US6, 184，201 公開了 GLP-2 類似物及其醫(yī)藥用途。所述類似物全是通過人GLP-2的替換和或缺失得到的。DaCambra 等(BiochemiStry2000, 39，8888-8894)描述了 GLP-2 活性的結(jié)構(gòu)決定簇。這樣的決定簇的實(shí)例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5據(jù)信對(duì)GLP-2受體結(jié)合和活化 是至關(guān)重要的。Drucker等在W097/39031中公開了 GLP-2類似物[Gly2]GLP_2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPPIV切割。顯示丙氨酸的取代提高所述肽的穩(wěn)定性和效能。該專利申請(qǐng)描述了如何使用GLP-2類似物對(duì)抗腸上皮粘膜炎癥和損傷相關(guān)的疾病。這些疾病包括大規(guī)模小腸切除、炎性腸病、化學(xué)療法誘發(fā)的粘膜炎以及缺血性損傷。W002/066511描述了體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的GLP-2類似物及其作為治療胃腸病癥如炎性腸病的藥物的用途。W001/14779描述了 h [Gly2] GLP-2用作抑制化學(xué)療法誘導(dǎo)的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的預(yù)處理的藥物的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以下通式(I )代表的GLP-2類似物，及其可藥用鹽及它們的衍生物，該衍生物包括經(jīng)長(zhǎng)鏈脂肪酸和/或聚乙二醇和/或其他長(zhǎng)效化修飾所產(chǎn)生的GLP-2類似物的衍生物，或GLP-2類似物的可藥用鹽的衍生物Rl-Zl-Xl-X2-X3-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-X10-Xll-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-X25-Leu-IIe-Gln-Thr-Lys-IIe-Thr-Asp-(Z2)-R2(I )，其中Z1、Z2、R1或R2為不存在，或?yàn)樘烊换蚍翘烊话被?，或?yàn)橛商烊缓?或非天然氨基酸組成的具有2至33個(gè)氨基酸單位的肽序列，而且XI、X2、X3、X10、XII、X15、X16、X24或X25為天然或非天然氨基酸。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式(I )代表的GLP-2類似物中，Xl是His或D_His。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X2是D-Ala或Gly。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，XlO為Nle或Met。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X15為Glu或Asp。優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X3是Glu或Asp，并且X3以α羧基或者β羧基與Gly形成肽鍵。具體而言，本發(fā)明更優(yōu)選具有下列序列的GLP-2類似物D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala—Arg-Asp-Phe—Ile-Asn-Trp-Leu—Ile-Gln-Thr-Lys—Ile—Thr—AspοHis-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala—Arg-Asp-Phe-Ile—Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile—Thr—Asp。His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala—Arg-Asp-Phe-Ile—Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile—Thr—Asp。D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-AspoD-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Aspo根據(jù)本發(fā)明的記載，本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明所述的GLP-2類似物的制備方法，其特征在于該GLP-2類似物采用固態(tài)合成法制備并用反相液相色譜法純化。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種包括治療有效劑量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物藥物組合物，其包括藥學(xué)上可接受的載體和/或者癌癥化學(xué)療法藥物。
所述組合物的劑型優(yōu)選為注射劑或者緩釋劑。本發(fā)明還涉及該藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征癥、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學(xué)療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學(xué)治療劑引起的胃腸粘膜損傷或DPP-IV (二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述GLP-2類似物在制備用于預(yù)防和/或治療胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學(xué)療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、或者毒劑或者化學(xué)治療劑引起的胃腸粘膜損傷或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。由此可見，本發(fā)明涉及的是一種新的GLP-2類似物。與公知的GLP-2相比，本發(fā)明所述的GLP-2類似物的序列中一個(gè)或多個(gè)位置的氨基酸被替換，這樣使得本發(fā)明所述的GLP-2類似物具有體內(nèi)生物活性的改善和或化學(xué)穩(wěn)定性改善的特點(diǎn)。具體而言，優(yōu)選地，本發(fā)明所述的GLP-2類似物包含GLP-2序列I位、2位、3位、10位、11位、15位、16位、24位或25位中的一個(gè)或多個(gè)位置上的替換和/或替換組合。本發(fā)明提供具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性和或生物活性的GLP-2類似物。因此，本發(fā)明提供通式I代表的GLP-2類似物或其可藥用鹽或它們的衍生物Rl-Zl-Xl-X2-X3-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-X10-Xll-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-IIe-X24-X25-Leu~IIe-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Z2)-R2 (通式I)，其中Z1、Z2，R1或R2為不存在，或?yàn)樘烊换蚍翘烊话被?，或?yàn)橛商烊换蚍翘烊话被峤M成的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列，而且X1、X2、X3、X10、X11、X15、X16、X24或X25為天然或非天然氨基酸。本發(fā)明所述的GLP-2類似物還具有提高的化學(xué)穩(wěn)定性，例如針對(duì)酸水解、氧化和脫酰胺作用的穩(wěn)定性。X3位的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物對(duì)酸水解的穩(wěn)定性，XlO位的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物的氧化穩(wěn)定性。XII、X16和或X24位中一個(gè)或多個(gè)位置的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物針對(duì)脫酰胺作用的穩(wěn)定性。因此，相對(duì)于Gly2-GLP-2，本發(fā)明所述的GLP-2類似物可顯示出針對(duì)酸性溶液中降解，針對(duì)脫酰胺作用和/或針對(duì)氧化降解的穩(wěn)定性的增強(qiáng)。X15位的替換可提高用化學(xué)合成法制備本發(fā)明所述的GLP-2類似物的產(chǎn)率。GLP-2類似物經(jīng)長(zhǎng)鏈脂肪酸和/或聚乙二醇或其他長(zhǎng)效化修飾可延長(zhǎng)其在生物體內(nèi)的半衰期。聚乙二醇修飾能有效地掩飾類似物母體，減少類似物被體內(nèi)免疫系統(tǒng)和體內(nèi)蛋白酶的辯識(shí)，從而降低了類似物的免疫原性和被體內(nèi)蛋白酶水解的幾率，從而延長(zhǎng)GLP-2類似物在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含與載體混合的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物為可藥用組合物，所述載體為藥學(xué)上可接受的或者藥用載體。本發(fā)明所述的GLP-2肽類似物可是本發(fā)明所述的GLP-2類似物的可藥用酸加成鹽。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于治療的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽。 在另一方面中，本發(fā)明涉及GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物用于制備治療和/或預(yù)防胃腸相關(guān)病癥的藥物中的用途，比如治療患有腸功能受損、骨質(zhì)疏松癥或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的新生兒。例如，所述胃和腸相關(guān)病癥選自消化道潰瘍、胃炎、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征、小腸損傷或短腸綜合征?？捎帽景l(fā)明所述的GLP-2類似物治療或可使用GLP-2類似物進(jìn)行預(yù)防或治療的其它病癥包括放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎以及由于毒劑或其它化學(xué)診斷治療劑引起的小腸損傷。這可能需要與化學(xué)療法或放射療法的藥物同時(shí)或在后施用GLP-2類似物，以降低化學(xué)療法或放射療法的副作用例如腹瀉、腹部痛性痙攣或嘔吐，以及降低由化學(xué)療法或放射療法引起的腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷。本發(fā)明還涉及一種治療藥盒，其包含癌癥化學(xué)療法藥物、本發(fā)明所述的GLP-2類似物以及使用說明書。特別是，在治療藥盒中，其包含作為治療劑的癌癥化學(xué)療法藥物、本發(fā)明所述的GLP-2類似物以及使用說明書，并且每一種所述的藥物或者類似物均任選的與可藥用載體組合。所述治療劑可以分開包裝以分別使用，或可以在同一組合物中提供。因此，本發(fā)明還涉及包含與可藥用載體組合的癌癥化學(xué)療法藥物和本發(fā)明GLP-2類似物的藥物組合物。胃腸粘膜瘤形成風(fēng)險(xiǎn)提高的患者可能期望選擇化合物以降低副作用或消除副作用的風(fēng)險(xiǎn)。例如，選擇用于治療患有結(jié)腸瘤形成，或預(yù)防有發(fā)生結(jié)腸瘤形成風(fēng)險(xiǎn)的患者發(fā)生結(jié)腸瘤形成藥物時(shí)，選擇對(duì)小腸的選擇性高于結(jié)腸的藥物比非選擇性藥物或?qū)Y(jié)腸的選擇性高于小腸的藥物可能更合適。
在其他方面中，本發(fā)明還涉及GLP-2類似物在用于制備治療和/或預(yù)防營養(yǎng)不良的藥物中的用途。在另一方面中，本發(fā)明涉及通過使用治療有效量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物在用于治療患者胃腸相關(guān)病癥的藥物中的用途。在另一方面中，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防有此需要的患者中化學(xué)療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括使用用治療有效量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物。在另一方面中，本發(fā)明提供治療和或預(yù)防有此需要的患者中營養(yǎng)不良的方法，所述方法包括使用治療有效量的本發(fā)明定義的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的固相合成技術(shù)合成本發(fā)明所述的GLP-2類似物肽，其基本原理是先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂(固相載體)相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨 基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合一洗滌一去保護(hù)一洗滌一下一輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中縮合和去保護(hù)反應(yīng)步驟的中間控制采取的是茚三酮檢測(cè)的方法，即當(dāng)樹脂肽鏈上有游離的氨基時(shí)，經(jīng)茚三酮試劑檢測(cè)會(huì)顯藍(lán)色，沒有游離氨基時(shí)不顯色(茚三酮試劑本身為黃色)。因此在進(jìn)行縮合反應(yīng)完畢后，通過茚三酮檢測(cè)，如果顯黃色(茚三酮試劑本身的顏色)，則說明本步偶合完畢可以進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的偶合前的脫保護(hù)操作，如果顯藍(lán)色，則證明肽鏈上還有些游離氨基，需進(jìn)一步的重復(fù)偶合或改變現(xiàn)有的縮合劑直至樹脂肽經(jīng)茚三酮檢測(cè)為黃色。本發(fā)明中涉及的GLP-2類似物的激動(dòng)活性的檢測(cè)原理是GLP-2R是與Gs蛋白偶聯(lián)的受體，當(dāng)受體與激動(dòng)劑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高。本實(shí)驗(yàn)在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染GLP-2R和cAMP反應(yīng)元件調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，當(dāng)化合物與受體結(jié)合并激活受體時(shí)，熒光素酶表達(dá)就會(huì)增加。通過對(duì)熒光素酶活性的檢測(cè)即可獲知化合物對(duì)GLP-2R的激活狀況。
具體實(shí)施例方式為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明，給出下列實(shí)施例。但本發(fā)明的保護(hù)范圍并非限定于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)方案結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的方法，替換相關(guān)的氨基酸完成本發(fā)明，得到通式I限定出來的衍生物。實(shí)施例I陽性化合物Teduglutide的固相合成陽性化合物Teduglutide的序列為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH( I)固相合成樹脂的干燥及溶脹稱量真空干燥24 小時(shí)的 Fmoc-Asp (OtBu)-Wang 樹脂(O. 5mmol/g) 40g (20mmol)置于2L鼓泡瓶中，加入400mLDMF溶脹樹脂30分鐘，抽掉DMF溶液；(2) Fmoc-Asp (OtBu) -Wang 樹脂脫除 Fmoc 保護(hù)基向裝有Fmoc-Asp (OtBu) -Wang樹脂的鼓泡瓶中加入200mL 20%哌啶/DMF溶液，反應(yīng)5分鐘后抽出，再加入200mL 20%哌啶/DMF溶液室溫反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用DMF200mL洗滌樹脂四次。(3) Teduglutide 的固相合成①縮合Fmoc-Thr (tBu) -OH稱量50mmol Fmoc-Thr (tBu) _0H，加入 125mL O. 4M HOBt/DMF 溶解，再加入 150mL
O.4M DIC/DCM室溫下攪拌反應(yīng)10分鐘；將上 述溶液加入到樹脂中，室溫下通入N2反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，依次用DMF，IPA和DMF洗滌樹脂。②肽鏈的延長(zhǎng)按照Teduglutide中氨基酸從羧基端(C-端)到氨基端(N-端)的順序(H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-AIa-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH),氨基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Thr (tBu) -OH相同，保護(hù)氨基酸分別是Fmoc-Thr (tBu) -OH>Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Gln (Trt)-OH、Fmoc-Leu-0H、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu) -OH、Fmoc-Arg (Pbf) -OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc_Ser (tBu) -0H、Fmoc_Gly-0H和Fmoc-His (Trt) -OH,重復(fù)縮合和脫保護(hù)兩步反應(yīng)，合成 His (Trt) -Ala-Asp (OtBu) -Gly-Ser (tBu) -Phe-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp (OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys (Boc) -Ile-Thr (tBu) -Asp (OtBu) -Wang 樹脂。③Teduglutide樹脂肽的后處理將②所得到的樹脂肽依次用DMF，IPA和DMF洗滌樹脂，用無水乙醚洗滌兩次后真空干燥，得樹脂肽。(4) Teduglutide 粗品肽的制備取干燥后的樹脂肽，加入新鮮配制的10mL/g樹脂肽的TFA:乙二硫醇(EDT) :TIS:水=92. 5:2. 5:2. 5:2. 5(體積比)的裂解液，室溫下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后過濾，用TFA洗滌樹脂二次，收集并合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/3，加入大量冰無水乙醚析出Teduglutide,離心后真空干燥得白色粗品。(5) Teduglutide的反相液相色譜制備取粗品肽5g溶于一定量的水中，經(jīng)0.45 μ m膜過濾后用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行分離，流動(dòng)相為A O. 1%TFA/H20, B O. 1%TFA/乙腈。其中，色譜柱為DenaliC-18柱(粒徑8. 3 μ m，5 X 30cm)，柱溫45度，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，流速120mL/分鐘。收集產(chǎn)物峰，減壓濃縮除去大部分乙腈后凍干得Teduglutide成品I. Og，純度98. 5%，收率20. 0%。實(shí)施例2化合物I的固相合成化合物I的序列為D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-IIe-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Gly，X3 是 ASP，XlO 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Asp，X16 是 Asn，X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。
實(shí)施例3化合物2的固相合成化合物2的序列為D-His-Gly-Glu-Gly-Ser -Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Gly，X3 是 Glu，XlO 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Asp，X16 是 Asn，X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例4化合物3的固相合成化合物3的序列為H-D-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-IIe-Asn-Trp-Leu-IIe-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Ala，X3 是 Asp，X10 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn,X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例5化合物4的固相合成化合物4的序列為H-D-His-Ala-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-I Ie-Asn-Trp-Leu-I Ie-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Ala，X3 是 Glu，X10 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn,X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例6化合物5的固相合成化合物5的序列為H-D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Ala，X3 是 Asp, XlO 是 Nle，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是Asn，X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例7化合物6的固相合成化合物6的序列為H-D-His-D-Ala-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 D-Ala，X3 是 Glu，XlO 是 Nle，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16是 Asn，X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例8化合物7的固相合成化合物7的序列為H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Gly，X3 是 Asp, XlO 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn，X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例9化合物8的固相合成化合物8的序列為His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-AIa-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 His，X2 是 Gly，X3 是 Glu，XlO 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn，X24 是Asn, X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例10化合物9的固相合成化合物9的序列為H-D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-IIe-Asn-Trp-Leu-IIe-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH,即在通式(I)中，Xl 是 D-His，X2 是 Gly，X3 是 Glu，X10 是 Met，Xll 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn,X24 是 Asn，X25 是 Trp。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例11化合物10的固相合成化合物10的序列為H-His-Gly-Asp*(Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-I le-Asn-Trp-Leu-I le-Gln-Thr-Lys-I le-Thr-Asp-OH,即在通式
(I)中，Xl 是出8，父2是617，父3是六8 ，乂10是]^扒父11 是 Asn，X15 是 Glu，X16 是 Asn，X24是 Asn, X25 是 Trp。其中 X3 處 Asp* :Fmoc-Asp_0tBu。制備方法同實(shí)施例I。實(shí)施例12對(duì)GLP-2受體(GLP-2R)的激動(dòng)活性檢測(cè)GLP-2R是與Gs蛋白偶聯(lián)的受體，當(dāng)受體與激動(dòng)劑結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高。本實(shí)施例在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染GLP-2R和cAMP反應(yīng)元件調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，當(dāng)GLP-2類似物與受體結(jié)合并激活該受體時(shí)，熒光素酶表達(dá)就會(huì)增加。通過對(duì)熒光素酶活性的檢測(cè)即可獲得GLP-2類似物對(duì)GLP-2R的激活狀況。待測(cè)各GLP-2類似物的相關(guān)信息如下表I所示表I進(jìn)行GLP-2R激動(dòng)活性檢測(cè)的各GLP-2類似物的分子量、質(zhì)量及終濃度
權(quán)利要求
1.一種胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp ;或者，D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala—Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu—Ile-Gln-Thr-Lys—Ile—Thr—Aspο
2.—種權(quán)利要求I所述的胰高血糖素樣肽-2類似物的制備方法，其特征在于該胰高血糖素樣肽-2類似物采用固相合成法制備并用反相液相色譜法純化。
3.一種包括治療有效劑量的權(quán)利要求I所述的胰高血糖素樣肽-2類似物的藥物組合物，其包括藥學(xué)上可接受的載體和/或癌癥化學(xué)療法藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其劑型為注射劑或者緩釋劑。
5.一種如權(quán)利要求3或4所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥的藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學(xué)療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學(xué)治療劑引起的胃腸粘膜損傷，或二肽基肽酶-IV介導(dǎo)的病癥。
6.一種如權(quán)利要求I所述的胰高血糖素樣肽2類似物在制備用于預(yù)防和/或治療胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關(guān)病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胃腸粘膜損傷導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學(xué)療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學(xué)治療劑引起的胃腸粘膜損傷，或二肽基肽酶-IV介導(dǎo)的病癥。
7.一種治療藥盒,其包含癌癥化學(xué)療法藥物、權(quán)利要求I所述的胰高血糖素樣肽-2類似物以及使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2類似物及其制備方法和用途，本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)類似物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種含有GLP-2類似物及其可藥用鹽的藥物組合物。本發(fā)明提供的GLP-2類似物或含有GLP-2類似物及其可藥用鹽的藥物組合物能在預(yù)防或治療與粘膜損傷有關(guān)的胃腸道相關(guān)病癥以及減輕化學(xué)療法和放射療法的胃腸道副作用中廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P1/04GK102942626SQ20121042522
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者王亞里, 孫長(zhǎng)安, 王瑞軍, 姜濤 申請(qǐng)人:連云港恒邦醫(yī)藥科技有限公司