專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)各種動(dòng)物及人類(lèi)疾病有療效的免疫治療藥。更具體地講，本發(fā)明是一種不含油的改性分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的制劑，它可以刺激動(dòng)物或人的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體中和、抑制或消除感染、腫瘤及其他疾病。
利用分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的免疫治療在動(dòng)物腫瘤模型、癌癥患者及治療感染性疾病中已得到廣泛評(píng)估。在主動(dòng)免疫治療中，根據(jù)增強(qiáng)內(nèi)源性抵抗腫瘤生長(zhǎng)的想法，將多種免疫刺激物、免疫恢復(fù)劑及腫瘤細(xì)胞疫苗直接給予腫瘤患者。作為一種對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的免疫學(xué)抑制的嘗試，有數(shù)種細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)品已被給予患者。在細(xì)菌當(dāng)中，卡介苗(BCG)、棒桿菌菌種、小棒桿菌，分枝桿菌菌種、棒形細(xì)菌、瘡皰丙酸桿菌(C.parvum)、紅球菌菌種、真桿菌種、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、博德特氏菌種及諾卡氏菌種的提取物已經(jīng)用于這種研究?？偟膩?lái)說(shuō)，使用免疫刺激物進(jìn)行免疫治療成功的要素是對(duì)腫瘤的免疫原性，給予免疫刺激物最佳劑量和方案，及免疫刺激物與腫瘤細(xì)胞的直接接觸。
已有報(bào)道說(shuō)，病灶內(nèi)注射帶油的卡介苗可以使豚鼠真皮內(nèi)已良好建立起來(lái)的帶有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞瘤移植物發(fā)生退化，并能建立全身的腫瘤特異性免疫，來(lái)消除遠(yuǎn)端疾患。用含油的卡介苗對(duì)黑瘤病灶直接注射，注射的瘤產(chǎn)生退化，而未注射的瘤退化程度小得多。這種治療伴有嚴(yán)重的類(lèi)似流感的全身癥狀，在注射后幾小時(shí)內(nèi)開(kāi)始并持續(xù)約24小時(shí)。以后的不利作用是使注射部位的皮膚發(fā)生潰瘍，囊內(nèi)給予卡介苗已使淺表膀胱腫瘤發(fā)生退化。
兩種與所述免疫刺激活性有關(guān)的成分已從卡介苗復(fù)合物中鑒別并分離出來(lái)。N—乙?！邗！滨！?—異谷氨酰胺(胞壁酰二肽或MDP)是分枝桿菌細(xì)胞壁的一種小成分，可以介導(dǎo)福氏完全佐劑的存在油包水乳劑中的完整分枝桿菌產(chǎn)生的佐劑作用。已有報(bào)道說(shuō)，MDP可以激活巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。巨噬細(xì)胞可通過(guò)胞吞作用吞入被脂質(zhì)體包裹的MDP而激活。有報(bào)道說(shuō)，在腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，多次注射脂質(zhì)體包裹MDP可以減少肺及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。海藻糖二霉菌酸酯(TDM)是另一種有佐劑活性的分枝桿菌成分，已報(bào)道說(shuō)其在鼠腫瘤模型中有抗腫瘤活性。
其他化學(xué)物質(zhì)也作為增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷作用的物質(zhì)進(jìn)行了試驗(yàn)，其中有吡喃共聚物及一種驅(qū)蟲(chóng)藥左旋咪唑。左旋咪唑在治療人類(lèi)癌癥中無(wú)明顯有益效果。
對(duì)卡介苗及其他細(xì)菌產(chǎn)品的局部及區(qū)域性效果，人們提出有兩種基本作用。腫瘤細(xì)胞可能被免疫刺激物引起的嚴(yán)重炎性反應(yīng)殺死，或者這些同樣的制劑可以作為佐劑增強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫。與巨噬細(xì)胞接觸(直接被某些細(xì)菌產(chǎn)品激活或通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)物的產(chǎn)生而被間接激活)被認(rèn)為是殺死腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要因素。
無(wú)論使用大分子如肽聚糖類(lèi)或脂多糖還是小分子如胞壁酰二肽，佐劑作用的機(jī)制都是激活巨噬細(xì)胞。用佐劑刺激巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)抗原攝入、細(xì)胞毒作用、細(xì)胞吞噬作用、過(guò)氧化氫的產(chǎn)生、增強(qiáng)花生四烯酸代射、酶脫粒作用和多肽細(xì)胞因子的合成及釋放。多肽細(xì)胞因子起重要作用，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓煌?xì)胞中都有強(qiáng)生物學(xué)性能。迄今為止，這些細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1、a—干擾素、腫瘤壞死因子(cachectin)及集落刺激因子。每種細(xì)胞因子可刺激其他細(xì)胞產(chǎn)生有生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。
在那些證明分枝桿菌細(xì)胞壁提取物活性的研究當(dāng)中，這種提取物在給予受體之前都要先與油混合，通常作為一種乳劑。據(jù)信需要油去有效地將細(xì)胞壁成分遞呈給免疫系統(tǒng)中的適當(dāng)細(xì)胞。但是制劑中油的存在使這類(lèi)制劑作為治療藥的使用大大復(fù)雜化了。分枝桿菌細(xì)胞壁提取物制劑中存在油有導(dǎo)致在注射部位發(fā)生嚴(yán)重反應(yīng)的危險(xiǎn)。另外，油可導(dǎo)致肉芽形成。細(xì)胞壁提取物制劑中的油導(dǎo)致的嚴(yán)重反應(yīng)使這種制劑作為一種治療藥對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō)難以接受。
因此，需要一種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物，它可以刺激人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)且不產(chǎn)生由于制劑中油的存在而導(dǎo)致的反應(yīng)。這一制劑的免疫刺激作用應(yīng)與油乳劑中的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物制劑的作用相似。此外，不含油的細(xì)胞壁提取物允許對(duì)成品進(jìn)行終產(chǎn)物消毒(高壓消毒)，產(chǎn)生一種無(wú)菌產(chǎn)品。
本發(fā)明通過(guò)提供一種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的懸液解決了上述問(wèn)題，這種懸液可以在無(wú)油或類(lèi)油物質(zhì)存在下給予人或動(dòng)物，并可全面刺激人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。這種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物優(yōu)選從包括草分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌屬種中提取。此外，棒桿菌菌種和諾卡氏菌種也是分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的優(yōu)選來(lái)源。人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)受到上述懸液的刺激可導(dǎo)致對(duì)感染物的中和/或阻礙癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
給予本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物可使免疫系統(tǒng)受到全面刺激。例如，當(dāng)一種病毒感染由于使用分枝桿菌細(xì)胞壁提取物而被抑制的時(shí)候，由病毒復(fù)制和繼發(fā)性細(xì)菌感染所產(chǎn)生的癥狀和體征也顯著減少或消失，因?yàn)椴《緩?fù)制被打斷中斷了感染周期。
本發(fā)明包括一種改性分枝桿菌細(xì)胞壁提取物在鹽水或其他水溶液中不含油的懸液。這種細(xì)胞壁提取物可以從卡介苗(BCG)、棒桿菌屬種、小棒桿菌、分枝桿菌菌種、棒形細(xì)菌、瘡皰丙酸桿菌、紅球菌菌種、真桿菌菌種、單核細(xì)胞增生李斯特菌、博德特氏菌種或諾卡氏屬種中提取。簡(jiǎn)要地說(shuō)，細(xì)菌在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并收集。細(xì)胞壁是通過(guò)破裂細(xì)菌并通過(guò)離心沉降收集而制備的。細(xì)胞壁成分(由離心步驟中得到的沉淀物)用蛋白分解酶消化而去蛋白。剩下的部分用去垢劑處理并沖洗，處理過(guò)的不溶部分進(jìn)行凍干。這種提取物在水溶液(例如鹽水)中懸浮，注射給動(dòng)物或人以刺激其免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的一個(gè)基本要素在于這種改性的細(xì)胞壁成分不被油成分吸附或與之混合。出人意外地發(fā)現(xiàn)，這種改性的細(xì)胞壁提取物在制劑中不使用油的情況下療效很高。
去蛋白的細(xì)胞壁提取物可用來(lái)治療多種由病毒、細(xì)菌或細(xì)胞內(nèi)生物引起的感染，包括但不限于由皰疹病毒引起的感染如馬鼻肺炎、傳染性牛鼻氣管炎、單純皰疹、帶狀皰疹、眼皰疹、貓病毒性鼻氣管炎，及感染貓呼吸道的皰疹病毒。本發(fā)明在輔助治療幼犬的細(xì)小病毒感染時(shí)也有效。本發(fā)明的分枝菌細(xì)胞壁提取物對(duì)治療人的生殖器皰疹及獲得性免疫缺陷綜合癥以及治療其他動(dòng)物或人的病毒感染有效。本發(fā)明對(duì)治療多種人及動(dòng)物的癌癥也有效。腫瘤可以是原發(fā)的，也可是轉(zhuǎn)移的。
本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液與傳統(tǒng)的治療不同，本發(fā)明非特異性地激活免疫系統(tǒng)，對(duì)抗多種微生物感染及抗腫瘤提供保護(hù)。因此，本發(fā)明對(duì)治療對(duì)感染物沒(méi)有免疫力的動(dòng)物的感染有效。
綜上所述，本發(fā)明的目的是提供一種不含油成分，但仍能有效地刺激人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分對(duì)治療多種微生物感染有效的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含有可能對(duì)接受者具有毒性作用的油成分的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分的不使接受者對(duì)皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)敏感的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種對(duì)治療腫瘤有效的不含油成分的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不油成分可以長(zhǎng)期貯存而保持有效的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分因而導(dǎo)致微栓形成的危險(xiǎn)低的細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分因此不會(huì)導(dǎo)致肉芽脂肪栓的細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分不會(huì)使接受者產(chǎn)生反應(yīng)的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
本發(fā)明的另一目的是在免疫耐受和免疫抑制情況下重新刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生正常免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油的經(jīng)過(guò)終產(chǎn)物消毒的(高壓消毒)無(wú)菌產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不會(huì)在給藥部位導(dǎo)致反應(yīng)的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分不會(huì)在注射部位導(dǎo)致嚴(yán)重反應(yīng)的細(xì)胞壁提取物水懸液。
本發(fā)明的另一目的是提供一種不含油成分的不會(huì)導(dǎo)致超敏反應(yīng)的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
閱讀以下公開(kāi)的實(shí)施方案的具體描述及所附權(quán)利要求后，本發(fā)明的這些及其它目的、特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得很明顯。
本發(fā)明涉及一種對(duì)治療人及動(dòng)物的免疫系統(tǒng)有效的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。這種水懸液內(nèi)可任選地含有葡糖氨基聚糖如透明質(zhì)酸作為一種成分。本發(fā)明是一種不含油或類(lèi)油物質(zhì)的改性細(xì)菌細(xì)胞壁的水制劑。因?yàn)榻M成本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液中不合油，所以在現(xiàn)有技術(shù)中那些細(xì)胞壁制劑中出現(xiàn)的所不希望的副反應(yīng)被消除了。這種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液可以刺激人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，使機(jī)體中和或抑制感染，或阻礙或消除腫瘤生長(zhǎng)。
本發(fā)明對(duì)接受者不引起陽(yáng)性結(jié)核菌素反應(yīng)并在反復(fù)注射時(shí)很少引起超敏反應(yīng)。本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液可用來(lái)治療人或動(dòng)物的多種疾病。
需要理解的是，本發(fā)明并非是一種免疫接種方法，而是一種能夠全面刺激動(dòng)物或人的免疫系統(tǒng)從而使個(gè)體自身免疫系統(tǒng)能很快消除疾病的藥物。因此，本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液非常適用于治療正在進(jìn)行中的病毒感染，與傳統(tǒng)的預(yù)防免疫接種相比，是一種新的免疫治療藥物。
對(duì)被給予這種水懸液的動(dòng)物或人來(lái)說(shuō)，這種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物對(duì)全面刺激免疫系統(tǒng)是有作用的。特別是，本發(fā)明對(duì)治療微生物引起的傳染性疾病有作用，特別是病毒感染。另外，本發(fā)明對(duì)阻礙或消除包括原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的多種腫瘤的生長(zhǎng)有作用。當(dāng)用來(lái)治療原發(fā)腫瘤時(shí)，這種水懸液可直接注射到腫瘤中，也可全身給藥。
本發(fā)明包含一種不含油或類(lèi)油物質(zhì)的改性的分枝桿菌細(xì)胞壁制劑的水懸液。這種水懸液可以任選地含有葡糖氨基聚糖(GAG)作為一種成分。例如包括但不限于多硫酸化的葡糖氨基聚糖、和包括透明質(zhì)酸鈉在內(nèi)的透明質(zhì)酸鹽。優(yōu)選的葡糖氨基聚糖是雞冠或鏈球菌來(lái)源的透明質(zhì)酸。從鏈球菌得到的透明質(zhì)酸分子量范圍是300,000到2,000,000道爾頓(D)，優(yōu)選范圍是500,000到1,200,000D，濃度范圍是0.001％到1.0％，優(yōu)選0.01％到0.1％。
優(yōu)選微生物是草分枝桿菌。但任何分枝桿菌菌種都可用來(lái)制備本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁水懸液。其他可用作細(xì)胞壁來(lái)源的細(xì)菌包括但不限于卡介苗(BCG)、棒桿菌菌種、小棒桿菌、分枝桿菌菌種、棒形細(xì)菌、瘡皰丙酸桿菌(C.parvum)、紅球菌菌種、真桿菌種、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、博德特菌種和諾卡氏菌種。
本發(fā)明基本上是這樣來(lái)制備的將微生物如草分枝桿菌經(jīng)過(guò)在Petragnani培養(yǎng)基(Difco Labs，Detroit，MI)或Lowenstein—Jensen培養(yǎng)基(Difco Labs，Detoit，MI)上初步培養(yǎng)10—20天后，在Bocto AC肉湯培養(yǎng)基(Difco Labs，Detroit，MI)上生長(zhǎng)10—20天。通過(guò)離心沉降收集細(xì)胞并用壓力或超聲波使細(xì)胞破裂。細(xì)胞破裂就是使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂從而使細(xì)菌的可溶性?xún)?nèi)容物釋放到周?chē)h(huán)境中。離心收集破裂的細(xì)胞并重新懸浮在蒸餾水中。細(xì)胞/水懸液先在高速混合器中處理，再在超聲波發(fā)生器如Branson超聲波350細(xì)胞破碎器(Branson Sonic Power Co.，Danbury，CT)中破裂細(xì)菌細(xì)胞。也可用高壓細(xì)胞破碎器如Ribi細(xì)胞破碎器來(lái)破裂細(xì)胞，這種特殊的細(xì)胞破碎器已不再生產(chǎn)，但為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所熟知。細(xì)菌細(xì)胞被放在高壓細(xì)胞破碎器的一個(gè)小室內(nèi)，然后對(duì)小室加壓到高于30,000磅/平方英寸的壓力，然后快速減壓使細(xì)胞破裂。
然后洗滌細(xì)胞壁部分并與未破裂細(xì)胞分離，流出物或超聲裂解產(chǎn)物被移至離心管中，在15℃時(shí)用中速離心機(jī)以27,500xg離心1小時(shí)。離心后，棄去上清液，沉淀的粗制細(xì)胞壁被轉(zhuǎn)移到一混合器內(nèi)。在這一步中，棄去最底層白色的未破裂細(xì)胞的沉淀非常重要。將細(xì)胞壁懸浮在去離子無(wú)菌水中并通過(guò)離心沖洗。洗過(guò)的細(xì)胞壁重新在無(wú)菌去離子水中懸浮，并且低速(約350至500xg)離心去掉任何未破裂細(xì)胞。低速離心后，用27500xg離心使上清液中細(xì)胞壁沉淀出來(lái)。
然后用幾種蛋白酶處理粗制的細(xì)胞壁使之脫蛋白。應(yīng)認(rèn)識(shí)到在此步細(xì)胞壁改性方法中可使用許多不同的蛋白酶，甚至化學(xué)提取方法。優(yōu)選的細(xì)胞壁去蛋白方法是用胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶連續(xù)處理細(xì)胞壁。粗制細(xì)胞壁在水緩沖液如0.05MTris—HCl，pH7.5中重新懸浮，并加入胰蛋白酶(胰蛋白酶，Sigma，chemical Co.，St.LouisMO)，混合物在室溫下攪拌6到24小時(shí)。用胰蛋白酶處理后，加入鏈霉蛋白酶(灰色鏈霉菌蛋白酶，Sigma Chomical Co.，St.LouisMO)，并在室溫下孵育這一懸液6—24小時(shí)。
然后細(xì)胞壁部分可任選地用去垢劑或苯酚處理以萃取可能出現(xiàn)在細(xì)胞壁中的任何核酸和/或脂類(lèi)。優(yōu)選的萃取混合物是尿素、Tri-tonX—100和苯酚。例如，在每升去蛋白細(xì)胞壁懸液中加入40—80克尿素，0.5—4.0ml 100％TritonX—100和50—150克苯酚。將懸液加熱到60—80℃并攪拌1小時(shí)，與苯酚和去垢劑加熱處理后，懸液在GSA轉(zhuǎn)子的中速離心機(jī)的帶蓋離心管中，以16000Xg離心10分鐘。潷去上清液，小心去除沉淀物下深色的酚溶液。細(xì)胞壁沉淀用離心方法再洗幾次以除去任何殘余的酚。
然后將這種改性的細(xì)胞壁沉淀物凍干，凍干是一種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法。凍干后的細(xì)胞壁沉淀物可在干燥器中在-20℃下無(wú)限期保存。可任選地加入硫柳汞(乙基汞硫代水楊酸，Sig-ma Chemical Co.，St，Louis MO)作為防腐劑。優(yōu)選的硫柳汞濃度為大約0.1g/l。硫柳汞和其他緩沖液可任選地加入乳化的細(xì)胞壁中，然后在60—80℃下混合1小時(shí)。
使凍干的細(xì)胞壁提取物在鹽溶液中重新懸液后，提取物可用下列兩個(gè)方法之一處理。首先，提取物可在無(wú)菌條件下操作，將提取物裝入小瓶并無(wú)菌密封。另一方法是對(duì)提取物進(jìn)行終產(chǎn)物消毒(高壓消毒)以避免在處理提取物的過(guò)程中所需的無(wú)菌條件。
不合油的制劑可進(jìn)行終產(chǎn)物消毒。而且，經(jīng)過(guò)終產(chǎn)物消毒的制劑可以保證是無(wú)菌的，而無(wú)菌操作的制劑都不能達(dá)到這種肯定程度，有可能被污染。因此，不含油的細(xì)胞壁提取物的更進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是它可以保證是無(wú)菌的，可降低費(fèi)用并較易于制備。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，從草分枝桿菌分離分枝桿菌細(xì)胞壁提取物(MCW)的方法簡(jiǎn)述如下1.細(xì)胞生長(zhǎng)
a.鑒別種子培養(yǎng)物為純的草分枝桿菌。
b.接種到錐形瓶?jī)?nèi)肉湯培養(yǎng)基上。
c.36℃孵育7—14天。
2.全細(xì)胞濃縮a.離心。
3.全細(xì)胞沖洗a.在蒸餾水中反復(fù)離心。
4.細(xì)胞滅活與破裂a(bǔ).Branson超聲儀(或)b.Ribi細(xì)胞破碎器。
5.破碎細(xì)胞的解毒a.在去離子水中反復(fù)離心。
6.粗制分枝桿菌細(xì)胞壁的濃縮a.離心。
7.粗制分枝桿菌細(xì)胞壁的去蛋白a.懸浮于酸性溶液中。
b.在胰蛋白酶中降解6—24小時(shí)。
c.在鏈霉蛋白酶中降解6—24小時(shí)。
d.在尿素/苯酚中孵育1小時(shí)。
8.60°—80℃巴氏滅菌1小時(shí)9.去蛋白并純化的分枝桿菌細(xì)胞壁的濃縮a.離心。
10.穩(wěn)定化a.凍干。
b.任選加硫柳汞。
11.鹽水中重新懸浮a.無(wú)菌裝填(或)b.高壓終產(chǎn)物消毒。
本發(fā)明的優(yōu)選使用方法是單劑量肌肉注射。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明在皮下注射、靜脈注射或腫瘤內(nèi)給藥、囊內(nèi)給藥，局部給藥或口服給藥時(shí)也有效。治療原發(fā)癌時(shí)，分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液可直接注入腫瘤中。對(duì)于某些疾病，可能需要多次治療。本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液的最適劑量根據(jù)被治療的動(dòng)物或人的大小而變化。只需要足夠刺激免疫系統(tǒng)的量。通常單劑量是約0.25—5.0ml懸液，每毫升懸液含細(xì)胞壁500μg到10mg。優(yōu)選的單劑量是一種每毫升含有約300μg到6mg細(xì)胞壁的乳液。最優(yōu)劑量是100μg—2mg細(xì)胞壁/ml，總體積約0.25到5ml的乳液。
本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵方面是這種分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液不含任何油或類(lèi)油物。發(fā)明者們所知道的現(xiàn)有技術(shù)中所有分枝桿菌細(xì)胞壁提取物制劑都含有油成分或類(lèi)油成分。出乎意料的是根據(jù)本發(fā)明制作的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物不需為在人或動(dòng)物中有免疫刺激活性而含有油。本發(fā)明的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液的抗感染或抗腫瘤的特異性活性一般等同于或稍小于現(xiàn)有技術(shù)中的油包水制劑的特異活性。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)增加水溶液中的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物濃度不會(huì)引起任何不希望的副作用。
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但同時(shí)不構(gòu)成任何限制。正相反，應(yīng)清楚認(rèn)識(shí)到，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，讀完下面的描述，會(huì)使他們?cè)诓幻撾x本發(fā)明的精神和/或所附權(quán)利要求的范圍的情況下，采取各種不同的實(shí)施方案、改進(jìn)措施及其等同手段。實(shí)施例I草分枝桿菌是從西德Borstel的Institute for ExperimentalBiologic and Medizin得到的，并懸于-60℃消毒牛奶中保存。分離的細(xì)菌在1976到1985年間約傳代11次，而改性細(xì)胞壁的免疫刺激活性沒(méi)有任何減小。草分枝桿菌在Petragnani培養(yǎng)基((DifcoLabs，Detroit，MI)中培養(yǎng)。
實(shí)施例II細(xì)菌細(xì)胞壁通過(guò)Ribi細(xì)胞破碎器制備。每次使用前，要擦凈、安裝Rib圓筒活塞和閥門(mén)等元件。將約400克濕細(xì)胞團(tuán)放入容積約1200毫升的潔凈混合器中。將細(xì)胞團(tuán)高速混勻30到60秒。混勻后，加入6毫升吐溫80及200到400毫升無(wú)菌水。然后整個(gè)細(xì)胞懸液在混合器中低速混勻約10秒鐘。將此細(xì)胞懸液冷凍，在每次填充Ribi圓筒前，重新混勻。裝有細(xì)胞懸液的Ribi圓筒在破碎器中以33000磅/平方英寸的壓力處理。然后重新填充圓筒并重復(fù)，這一過(guò)程直至處理完全部細(xì)胞懸液。在破碎過(guò)程中從Ribi圓筒中流出的物質(zhì)貯存在冰上的無(wú)菌燒瓶中。
實(shí)施例III在實(shí)施例II中從破碎器流出的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到250ml離心管中用GSA轉(zhuǎn)子的中速離心機(jī)在15℃下，以27,500xg離心1小時(shí)。潷出并棄去離心上清液。最下層未破裂細(xì)胞的白色沉淀也棄去。將沉淀下來(lái)的粗制細(xì)胞壁部分轉(zhuǎn)入混合器中，低速混合，懸浮在無(wú)菌、去離子水中。粗制細(xì)胞壁部分通過(guò)重新懸浮和離心(27500Xg，1小時(shí)，15℃)進(jìn)行中洗，棄去最下面未破裂細(xì)胞的白色塊。
粗制細(xì)胞壁洗過(guò)后，使沉淀物重新在無(wú)菌去離子水中懸浮，以350Xg離心5分鐘沉淀未裂解細(xì)胞，同時(shí)使細(xì)胞壁保持在上清液中。潷出上清液，在15℃以27,500Xg離心1小時(shí)以沉淀粗制細(xì)胞壁。
實(shí)施例IV實(shí)施例III中的粗制細(xì)胞壁用蛋白水解酶消化去蛋白。從400克全細(xì)胞中得到的細(xì)胞壁通過(guò)低速混合重新懸浮在1升0.05M的Tris—HCl，ph75中。當(dāng)這種粗制細(xì)胞壁在Tris緩沖液中徹底重新懸浮以后，加入50mg胰蛋白酶(胰蛋白酶Sigma Chemical Co.，St.Lauis MO)，在室溫下用磁力攪拌器攪拌24小時(shí)。用胰蛋白酶處理后，在每升胰蛋白酶消化過(guò)的細(xì)胞壁懸液中加入50mg鏈霉蛋白酶(灰色鏈霉菌蛋白酶Sigma Chamical Co.，St.Louis MO)，在室溫下，用磁力攪拌器攪拌24小時(shí)。
實(shí)施例V實(shí)施例IV中用蛋白酶消化過(guò)的細(xì)胞壁用去垢劑和苯酚處理。每升細(xì)胞壁懸液中加60g脲(J.T.Baker Chemical Co.Phillips-burg，NJ)、2.0毫升100％Triton X100(聚乙烯醚Sigma ChemicalCo.，St.Louis MO)和100g苯酚晶體(Fisher Scientific，F(xiàn)airLawn，NJ)。裝有懸液的燒瓶用鋁箔松散地蓋住并加熱到60—80℃，攪拌1小時(shí)。去蛋白的細(xì)胞壁在GSA轉(zhuǎn)子(IVan Sorvall，Inc.，Norwalk，CT)中以16,000xg離心10分鐘，潷出并棄去上清部分，用一次性的移液管將沉淀物下的深色液體移去。將細(xì)胞壁沉淀物在約1升無(wú)菌水中重新懸浮洗滌三次，在GSA轉(zhuǎn)子中以16,000xg離心10分鐘。
實(shí)施例VI
將含有洗凈的改性細(xì)胞壁沉淀物的懸液移入裝有少量無(wú)菌去離子水的凍干燒瓶中凍干。每30克濕細(xì)胞壁原料放入一個(gè)300ml的凍干燒瓶?jī)?nèi)。通過(guò)在干冰冷卻的乙醇內(nèi)旋轉(zhuǎn)燒瓶將細(xì)胞壁懸液進(jìn)行薄膜冷凍。燒瓶?jī)?nèi)容物凝固以后，將燒瓶與凍干機(jī)(Virtis Co.，Inc.，Gardiner，NY)連結(jié)。樣品被凍干后，移入無(wú)菌的有螺旋蓋子的容器內(nèi)。在有無(wú)水硫酸鈣的干燥器內(nèi)于-12℃保存這些物質(zhì)。
實(shí)施例VII為檢驗(yàn)不含油的細(xì)胞壁制劑的效力，進(jìn)行了小鼠脾大效力試驗(yàn)。使用7—8周齡、體重20—30g的雌性CD1小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。將動(dòng)物隨機(jī)分為11組，每組20只。每5只裝入一籠。自由攝食和水。從實(shí)施例VI中所得分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的終濃度為400μg/ml。在臨注射試驗(yàn)物質(zhì)前，將3ml成品用4.5ml PBS或PBS—D稀釋。PBS—D的組成如下16.5ml 0.2M NaH2PO4，33.5ml 0.2MNa2HPO4，7.4g NaCl，最后用水稀釋到1升。
動(dòng)物取背臥位，頭向下，用27號(hào)標(biāo)準(zhǔn)1/2英寸針頭在腹膜下注入0.5ml試驗(yàn)物質(zhì)。
20只小鼠注射試驗(yàn)物質(zhì)組合物(0.5ml，400μg/ml)，另20只對(duì)照組小鼠注射0.5ml鹽水(PBS)。其他各組的20只小鼠分別注射表1中所列的其他各種試驗(yàn)物質(zhì)各0.5ml。每天記錄任何反常規(guī)象(厭食，痛苦，聚堆，皮毛粗糙或死亡)。
每1000ml水包油懸液(乳液對(duì)照組)的組成如下1000μg分枝桿菌細(xì)胞壁提取物(MCWE)、2％礦物油、100mg/L硫柳汞和975PBS—D。所有懸液注射前要混勻。
7天后，斷頸或二氧化碳中毒處死全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，稱(chēng)量體重。處死后，立即沿體中線解剖小鼠，打開(kāi)腹壁，暴露內(nèi)臟。剪開(kāi)腹膜，移走腸以及脾周?chē)钠鞴?。在確保不含其他組織的情況下摘出脾臟，用敏感度至少為0.001g的天平對(duì)每個(gè)脾臟稱(chēng)重。
用下面的公式把每只動(dòng)物脾重轉(zhuǎn)變?yōu)閙g脾/100g體重來(lái)確定脾和體重的關(guān)系
對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的每個(gè)脾重(mg)/100g體重的值取平均值。用方差分析(ANOVA)比較對(duì)照組與產(chǎn)品試驗(yàn)組的平均脾重。統(tǒng)計(jì)顯著性p＜0.01時(shí)，認(rèn)為是陽(yáng)性效力試驗(yàn)。
表1
a.MCWE＝如實(shí)施例I—IV中所述的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物。
b.23E＝為陽(yáng)性對(duì)照的產(chǎn)品序號(hào)No.Lot921123E；常規(guī)MCWE水包油懸液。
c.HA＝來(lái)自雞冠或鏈球菌的透明質(zhì)酸。
如表I所示，不含油的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物幾乎與傳統(tǒng)的水包油乳劑的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物制劑一樣有效。
當(dāng)然，應(yīng)認(rèn)識(shí)到前述只涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，在不脫離本發(fā)明的精神和如所附權(quán)利要求所述范圍的情況下，可以進(jìn)行各種改動(dòng)或變化。
權(quán)利要求
1.一種刺激人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的方法，包括給予人或動(dòng)物有效量的不合油的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物水懸液。
2.權(quán)利要求1的方法，其中分枝桿菌細(xì)胞壁提取物是從包括卡介苗(BCG)、小棒桿菌、分枝桿菌菌種、棒桿菌菌種、棒形細(xì)菌、瘡皰丙酸桿菌(C.parvum)、紅球菌菌種、真桿菌菌種、單核細(xì)胞增生李斯特菌、博德特菌菌種及諾卡氏菌菌種的菌組中提取的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中分枝桿菌細(xì)胞壁提取物是從草分枝桿菌中提取的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中分枝桿菌細(xì)胞壁提取物還含有葡糖氨基聚糖。
5.權(quán)利要求4的方法，其中葡糖氨基聚糖是透明質(zhì)酸。
6.一種免疫刺激組合物，它包含一種不含油的分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的水懸液。
7.權(quán)利要求6的組合物，它還含有葡糖氨基聚糖。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中葡糖氨基聚糖是透明質(zhì)酸。
9.權(quán)利要求6的組合物，其中分枝桿菌細(xì)胞壁提取物是從包括分枝桿菌菌種、棒形菌菌種、卡介苗(BCG)、小棒桿菌、棒形細(xì)菌、瘡皰丙酸桿菌(C.parvum)、紅球菌菌種、真桿菌菌種、單核細(xì)胞增生李斯特菌、博德特菌菌種及諾卡氏菌菌種的菌組中提取的。
10.權(quán)利要求6的組合物，其中分枝桿菌細(xì)胞壁提取物是從草分枝桿菌提取的。
11.權(quán)利要求6的組合物，其中組合物經(jīng)過(guò)終產(chǎn)物消毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)治療多種動(dòng)物及人類(lèi)疾病都有效的免疫治療藥。更具體講，本發(fā)明是一種不含油的改性分枝桿菌細(xì)胞壁提取物的制劑，它可以刺激人或動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體中和、抑制或消除感染、腫瘤及其他疾病。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1118574SQ94191293
公開(kāi)日1996年3月13日 申請(qǐng)日期1994年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月29日
發(fā)明者S·J·阿克馬德, G·麥克雷 申請(qǐng)人:維特里制藥有限公司