專利名稱：肽衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及某些具有藥理學(xué)有用性質(zhì)的新型肽衍生物，它們可用于治療自身免疫性疾病或醫(yī)學(xué)紊亂，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它MHCⅡ類依賴性T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。本發(fā)明也包括所述新肽衍生物的藥用組合物、其生產(chǎn)方法和它們在治療一種或多種上述疾病或醫(yī)學(xué)紊亂方面和生產(chǎn)用于這類醫(yī)學(xué)治療的新型藥物生產(chǎn)方面的用途。
人免疫應(yīng)答的刺激依賴于T細(xì)胞對(duì)蛋白抗原的識(shí)別。然而，T細(xì)胞不能對(duì)單獨(dú)的抗原應(yīng)答，僅當(dāng)抗原與諸如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞之類的抗原提呈細(xì)胞表面上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子復(fù)合時(shí)，才觸發(fā)T細(xì)胞。
MHCⅠ類分子引起T殺傷細(xì)胞導(dǎo)致帶有該抗原的細(xì)胞破壞的反應(yīng)。MHCⅡ類分子引起T輔助細(xì)胞控制選定B細(xì)胞的擴(kuò)張和成熟(即產(chǎn)生抗原特異性抗體)以及巨噬細(xì)胞的激活的反應(yīng)。
免疫系統(tǒng)關(guān)鍵性的要求是區(qū)別“自身”抗原和“非自身”(即外源)抗原的能力。這種辨別要求能夠使免疫系統(tǒng)封固(mount)對(duì)侵入性外源病原體的應(yīng)答，而保持對(duì)自身蛋白的耐受，并由此防止對(duì)正常組織的損害。當(dāng)自身耐受出現(xiàn)障礙使得免疫系統(tǒng)對(duì)諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)之類的自身組織反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生自身免疫疾病。人們認(rèn)為，耐受的保持并由此防止自身免疫病關(guān)鍵取決于MHC分子的功能。
許多自身免疫病與特定MHC等位基因的遺傳相關(guān)的觀察，提示MHC分子在自身免疫病發(fā)病機(jī)理中的重要作用。例如多發(fā)性硬化癥與HLA-DR2的遺傳相關(guān)，胰島素依賴性糖尿病與HLA-DR3和/或HLA-DR4相關(guān)，而橋本甲狀腺炎與HLA-DR5相關(guān)。詳細(xì)地說，在慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素與HLA-DR4Dw4和/或HLA-DR4w14和/或HLA-DR1的遺傳之間存在特別強(qiáng)的聯(lián)系。人們認(rèn)為該自身免疫病相關(guān)的MHC分子與某些自身抗原結(jié)合，并將它們提呈于T細(xì)胞，由此刺激自身免疫應(yīng)答?？梢耘c所述自身免疫相關(guān)的MHC分子結(jié)合和/或或者防止該結(jié)合或者取代已經(jīng)結(jié)合的自身抗原和/或抑制T細(xì)胞(特別是致病T細(xì)胞(例如Th1細(xì)胞)活性)激活和/或增加保護(hù)性T細(xì)胞(例如Th2細(xì)胞)活性的其它肽，或與通過其它作用機(jī)制與MHC分子相互作用以便防止或修飾通過所述MHC分子介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答的肽，可以特異性地抑制自身免疫應(yīng)答。
該種類的藥物可能提供對(duì)該自身免疫疾病的治療，而避免通常的該免疫系統(tǒng)的抑制，由此限制了有害的副作用。該種類的效果對(duì)于諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之類的疾病具有明顯優(yōu)于目前治療的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)代的醫(yī)療實(shí)踐最初用諸如NSAID的癥狀減輕藥物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述藥物對(duì)疾病進(jìn)程沒有有益的作用，而常常伴隨產(chǎn)生不良的副作用。治療更嚴(yán)重的疾病依賴于使用所謂的二線藥物。通常這些藥物是一般的細(xì)胞毒性化合物，它們具有有限的效力，并可以引起嚴(yán)重的毒性問題。因此，合理基礎(chǔ)的不伴隨產(chǎn)生非特異性細(xì)胞毒性的疾病改善藥物在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面可能提供顯著的益處。
在公開號(hào)為WO 92/02543、WO 93/05011和WO 95/07707的國際專利申請(qǐng)中公開了與MHC結(jié)合并抑制T細(xì)胞激活的肽。
盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過與HLA-DR分子結(jié)合而抑制HLA-DR限制的T細(xì)胞激活的許多肽，但仍然需要與這類分析結(jié)合和/或或者防止結(jié)合或取代已經(jīng)結(jié)合的自身抗原和/或抑制T細(xì)胞激活和/或提高保護(hù)性T細(xì)胞活性的其它化合物，或通過另一作用機(jī)制與MHC分子相互作用以便防止或修飾引起上述疾病或紊亂的自身免疫應(yīng)答的刺激。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的肽衍生物(下面陳述的)意外地具有這類藥理學(xué)上有用的性質(zhì)，這是本發(fā)明的基礎(chǔ)。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供式Ⅰ(下文陳述的)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中
P為疏水殘基；AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1、AA4和AA7中的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)選自式Ⅱ(下文陳述的)L-氨基酸殘基，其中n為1、2、3或4的整數(shù)；X為-NH-CO-、-CO-(羰基)或-O.CO-(酯基)；R1和R2選自(A)、(B)和(C)，其中(A)為式-(CH2)a-CO-N(R3)(R4)的基團(tuán)，其中a為1或2的整數(shù)，R3和R4獨(dú)立地選自-[(CH2)bO]m-Ra的基團(tuán)，其中Ra為甲基或乙基，而m為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)m為1時(shí)，b為2或3，而當(dāng)m為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)bO-單位的b值獨(dú)立地選自2和3；(B)為式-(CH2)cO(CH2)d-CO-N(R5)(R6)的基團(tuán)，其中c為2或3的整數(shù)，d為1、2或3的整數(shù)，而R5和R6獨(dú)立地選自基團(tuán)-[(CH2)eO]p-Rb，其中Rb為甲基或乙基，p為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)p為1時(shí)，e為2或3，而當(dāng)p為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)eO-單位中的e值獨(dú)立地選自2和3；以及(C)為式-[(CH2)f-O]g-R7的基團(tuán)，其中R7為甲基或乙基，而g為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)g為1時(shí)，f為2或3，而當(dāng)g為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)fO-單位中的f值獨(dú)立地選自2和3；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA7的一個(gè)或兩個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，并且AA4和AA5一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa(下文陳述的)的基團(tuán)，其中Ra、Rb和Rz獨(dú)立地選自氫和(1-4C)烷基，而A為氧或亞甲基；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA4的一個(gè)或兩個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，而AA6和AA7一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa(下文陳述的)的基團(tuán)，其中Ra、Rb和Rz獨(dú)立地選自氫和(1-4C)烷基，而A為氧或亞甲基；而Q為OH、NH2、NRcRd，其中Rc選自(1-4C)烷基、2-氨甲酰基環(huán)戊基、2-吡啶基甲基、4-氨甲酰基環(huán)己基、4-氨甲酰基環(huán)己基甲基、3-氨甲酰基苯基、4-氨甲酰基苯基、4-(氨甲酰基甲基)苯基、4-(羧甲基)苯基、2-嗎啉代乙基和式-A1-G1的基團(tuán)，其中A1為(3-7C)亞烷基或A1選自(1)式-A2-B2-的基團(tuán)，其中A2為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基，而B2為(1-4C)亞烷基，或A2為亞甲基，而B2為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基；以及(2)式-A3-B3-C3的基團(tuán)，其中A3為亞甲基，B3為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基，而C3為(1-3C)亞烷基；以及G1為式-N=C[N(Rp)2]2的基團(tuán)，其中每個(gè)Rp獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基和丙基；而Rd為氫或(1-4C)烷基；或Q為1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-1-哌嗪基、4-脒基-1-哌嗪基、1-哌啶基或4-取代的-1-吡啶基，其中4-取代基選自羧基、氨甲?；?、N-(2-氨乙基)氨甲酰基和N-(4-氨丁基)氨甲?；?；或Q為1-6個(gè)氨基酸殘基或其酰胺的序列。
按照本發(fā)明的另一方面，提供式Ⅰ(下文陳述的)肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1、AA4和AA7的一個(gè)選自式Ⅱ(下文陳述的)的L-氨基酸殘基，其中n、X、R1和R2具有以上定義的任何含義；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA7的一個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，而AA4和AA5一起形成以上定義的式Ⅲa的基團(tuán)；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA4的一個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，而AA6和AA7一起形成以上定義的式Ⅲa的基團(tuán)；而P和Q具有以上定義的任一值。
應(yīng)該理解，Q的氨基酸獨(dú)立地具有D-或L-立體化學(xué)。此外，當(dāng)Q定義為羥基(OH)時(shí)，這應(yīng)該理解為C-末端氨基酸AA8的羥基。同樣，當(dāng)Q定義為NH2、NRcRd、哌嗪基、哌啶基等時(shí)，這是指C-末端氨基酸AA8的羥基被這一基團(tuán)取代。也應(yīng)該理解，當(dāng)提到氨基酸時(shí)，指α-氨基酸。也應(yīng)該理解，當(dāng)提到L-氨基酸時(shí)，也包括諸如Gly、2,2-二乙基Gly、氮雜丙氨酸和氮雜甘氨酸之類的沒有手性碳原子的氨基酸。還應(yīng)該理解，諸如“烷基”之類的種類術(shù)語當(dāng)所述碳數(shù)允許時(shí)包括，直鏈和支鏈變體。同樣的習(xí)慣用于其它基團(tuán)。
還應(yīng)該意識(shí)到，當(dāng)R1和R2為式(A)的兩個(gè)基團(tuán)時(shí)，R1中的a、R3和R4的值可以與R2中的值相同或不同。同樣，當(dāng)R1和R2為式(B)的兩個(gè)基團(tuán)時(shí)，R1中的c、d、R5和R6的值可以與R2中的值相同或不同；而當(dāng)R1和R2為式(C)的兩個(gè)基團(tuán)時(shí)，R1中的f、g和R7的值可以與R2中的值相同或不同。
本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，具有手性中心的化合物可能以外消旋體(或有多于1個(gè)手性中心時(shí)為非對(duì)映異構(gòu)體的混合物)形式或作為旋光性對(duì)映體或非對(duì)映異構(gòu)體存在。本領(lǐng)域內(nèi)也眾所周知，與外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體混合物相關(guān)的特殊的生物學(xué)活性可以主要或僅僅由單一的旋光性異構(gòu)體產(chǎn)生。因此應(yīng)該理解，本發(fā)明涉及式Ⅰ具有上述藥學(xué)有用性質(zhì)的任何形式的式Ⅰ肽衍生物。本領(lǐng)域眾所周知如何獲得單一的旋光性異構(gòu)體，例如通過采用諸如色譜之類的常規(guī)技術(shù)從含有所述異構(gòu)體的外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體混合物中進(jìn)行分離，或通過采用例如本文例舉的合適的旋光性原料或中間體進(jìn)行手性合成來獲得。本領(lǐng)域也眾所周知如何確定這類外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體混合物和各個(gè)旋光性異構(gòu)體的藥理學(xué)性質(zhì)，例如通過采用本文所述的分析方法來確定。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地獲得具有本文提到的有益藥理學(xué)性質(zhì)的式Ⅰ肽衍生物的特定異構(gòu)體。應(yīng)該理解，本發(fā)明也包括具有本文提到的有益的藥理學(xué)性質(zhì)的式Ⅰ的肽衍生物的任何多晶形式、任何互變體或任何溶劑化物或或它們的任何混合物。
當(dāng)α-氨基酸殘基AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8不是式Ⅱ氨基酸殘基時(shí)或形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa基團(tuán)的部分時(shí)，其合適的獨(dú)立的有用基團(tuán)(values)包括例如由遺傳密碼編碼的20種天然存在的氨基酸，特別是丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)和脯氨酸(Pro)的氨基酸殘基。諸如肌氨酸(Sar)、3,3,3-三氟丙氨酸、2,2-二乙基甘氨酸、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2-氨基丁酸(Abu)、高精氨酸、高苯丙氨酸、反式-4-羥脯氨酸(Hyp)、氮雜丙氨酸(H2N-N(CH3)-COOH；Azala)、氮雜甘氨酸[H2N-NH-COOH；Azgly]、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、八氫吲哚-2-羧酸(Oic)、十氫異喹啉-3-羧酸(Dic)之類的氨基酸殘基也是合適的。(這里Dic是指其中環(huán)狀接頭二者都具有R構(gòu)型或都具有S構(gòu)型的形式)。相應(yīng)的N2-甲基化氨基酸殘基也可以使用，其中游離側(cè)鏈羧酸官能團(tuán)被酯化(例如作為(1-6C)烷基酯或芐基酯)和游離側(cè)鏈氨基被烷基化(例如甲基化)、乙?；蜣D(zhuǎn)化為氨基甲酸酯(例如氨基甲酸烷基酯(例如甲酯或乙酯)、苯基酯或芐基酯)的相應(yīng)的氨基酸殘基也可以使用。其它合適的有用基團(tuán)包括例如2-取代甘氨酸的殘基，其中2-取代基為式-(CH2)5NH2的基團(tuán)，其中s為1-3；或式-(CH2)pN(Re)3+.X-基團(tuán)，其中p為2-4,X-為相反離子(例如乙酸根、三氟乙酸根、氫氧化物或氯化物)；或式-(CH2)qN(Re)2基團(tuán)，其中q為0-4；或式-(CH2)rN=C[N(Re)2]2基團(tuán)，其中r為1-4，并其中最后三個(gè)基團(tuán)中每個(gè)Re獨(dú)立地選自氫和(1-4C)烷基(例如甲基或乙基)。
疏水殘基P(應(yīng)該認(rèn)識(shí)到它連接到N-末端氨基酸AA1的氨基上)的合適的有用基團(tuán)包括例如有機(jī)疏水基團(tuán)，諸如5-20個(gè)碳原子(對(duì)于含雜芳族基團(tuán)還有1、2或3個(gè)雜原子，選自氧、硫和氮)的疏水脂族、芳族、雜芳族或混合脂族/芳族或脂族/雜芳族有機(jī)基團(tuán)，例如式R-、R.CO-、R.SO2-、R.O.CO-、R.NHCO-、R.O.CS-、R.S.CO-、RNHCS-、R.S.CS-和R.CS-的基團(tuán)，其中R包括例如(5-10C)烷基、芳基、雜芳基、芳基(2-10C)烷基、雜芳基(2-10C)烷基、二芳基(2-8C)烷基、芳基(2-10C)鏈烯基、芳基環(huán)丙基、(5-10C)環(huán)烷基、(5-10C)環(huán)烷基(2-6C)烷基、3-聯(lián)苯基、4-聯(lián)苯基、4-環(huán)己基苯基、2-萘氧甲基、3-萘氧甲基、苯氧苯基和四氫萘基、其R的有用基團(tuán)可以帶有一個(gè)或多個(gè)(1-4C)烷基、鹵代(halogeno)、氰基或(1-4C)烷氧基取代基的芳基或雜芳基。本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案包括例如式Ⅰ化合物，其中P為以上定義的R.CO-。本發(fā)明另一個(gè)具體實(shí)施方案包括例如式Ⅰ的肽衍生物，其中P為5-20個(gè)碳原子的疏水脂族、芳族或脂族/芳族有機(jī)基團(tuán)。
R的具體有用基團(tuán)當(dāng)R為(5-10C)烷基時(shí)，包括戊基、異戊基、叔戊基、2-甲基戊基、己基、異己基、5-甲基己基和辛基；當(dāng)R為芳基時(shí)，包括例如苯基、萘基和茚基；當(dāng)R為雜芳基時(shí)，包括2-、3-、5-或6-吲哚基、2-、3-、5-或6-二氫吲哚基、2-、3-、5-或6-苯并[b]噻吩基(thiophenyl)、噻吩基、2-、4-或5-苯并噻唑基、2-、4-或5-苯并噁唑基、2-、4-或5-苯并咪唑基、在2-、3-、6-或7-位連接的1,4-苯并二噁烷基和2-、3-、5-或6-苯并呋喃基；當(dāng)R為芳基(2-10C)烷基時(shí)，包括芳基(2-6C)烷基(其中，所述芳基部分包括例如以上給出的芳基的任一具體有用基團(tuán)，所述(2-6C)烷基部分包括例如亞甲基、亞乙基、三亞甲基、四亞甲基和五亞甲基)，諸如2-苯基乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基和5-苯基戊基；當(dāng)R為雜芳基(2-10C)烷基時(shí)，包括雜芳基(2-6C)烷基(其中所述雜芳基部分包括例如以上給出的雜芳基的任一具體有用基團(tuán)，所述(2-6C)烷基部分包括例如亞甲基、亞乙基、三亞甲基、四亞甲基和五亞甲基)，例如在2-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基中的情況；當(dāng)R為二芳基(2-8C)烷基時(shí)，包括二芳基(2-6C)烷基諸如2,2-聯(lián)苯基乙基、3,3-聯(lián)苯基丙基和4,4-聯(lián)苯基丁基；當(dāng)R為芳基(2-10C)鏈烯基時(shí)，包括芳基(2-6C)鏈烯基，諸如苯乙烯基、3-苯基丙烯-2-基和4-苯基丁烯-1-基；當(dāng)R為芳基環(huán)丙基時(shí)，包括苯基環(huán)丙基、1-萘基環(huán)丙基和2-萘基環(huán)丙基；當(dāng)R為(5-10C)環(huán)烷基時(shí)，包括環(huán)戊基、環(huán)己基和1-金剛烷基(adamantyl)；而當(dāng)R為(5-10C)環(huán)烷基(2-6C)烷基時(shí)，包括2-(環(huán)己基)乙基、3-(環(huán)己基)丙基和4-(環(huán)己基)丁基。作為R的芳基上取代基的具體有用基團(tuán)包括例如甲基、乙基、氯代、溴代、碘代、甲氧基、乙氧基和氰基。
疏水殘基P也包括例如疏水L-氨基酸，諸如苯丙氨酸(Phe)及其氫化類似物，諸如環(huán)己基丙氨酸(Cha)、對(duì)氯Phe、3-(2-噻吩基)丙氨酸、酪氨酸(Tyr)、Tyr(O甲基)、色氨酸(Trp)、聯(lián)苯丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸和它們的氫化類似物，諸如3-(1-金剛烷基)丙氨酸(Ada)、Glu(氧芐基)、3-(芐氧基)Ala、3-(芐基硫烷基)Ala和9-芴基Gly，它們每個(gè)可任選地在N-末端含有一個(gè)上述定義或例舉的疏水脂族、芳族、雜芳族或混合脂族/芳族或脂族/雜芳族有機(jī)基團(tuán)?；蛘?，所述疏水氨基酸可任選地含有例如1-3個(gè)氨基酸的另一序列，其中所述氨基酸選自以上定義的AA1-AA8的合適的獨(dú)立有用基團(tuán)。例如，P包括具體序列Ala-Cha、Ala-Ala-Cha、Tyr-Ala-Ala-Cha、Tyr-Ala-Ala-Phe、Ala-Phe-Phe-Phe和Ala-Ala-Ala-Phe。這種1-3個(gè)氨基酸的另一序列的第一個(gè)氨基酸(從左讀到右)可以是L-氨基酸或D-氨基酸，也可任選地含有一個(gè)上述定義或例舉的疏水脂族、芳族、雜芳族或混合脂族/芳族或脂族/雜芳族有機(jī)基團(tuán)。
P的其它具體有用基團(tuán)包括例如3-(芐酯基)丙酰基-Phe、3-(芐酯基)丙?；?Cha、4-(芐酯基)丁?；?Phe、4-(芐酯基)丁?；?Cha、(5-氧代-吡咯烷-2-基)羰基-Phe-Tyr、(5-氧代-吡咯烷-2-基)羰基-Gly(O芐基)-Tyr、乙酰基-Glu(O芐基)-Tyr、二苯甲基.CONH.CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.CONH.CH2CH2.CO-Tyr、二苯甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.CONH.CH2CH2CH2.CO-Tyr、二苯甲基.NHCO.CH2CH2CH2.CO-Cha、二苯甲基.NHCO.CH2CH2CH2.CO- Tyr、芐基.NHCO.CH2CH2.CO-Cha、芐基.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr、N-乙酰基-4-氯代-β-羥基Phe、4-苯氧苯基.NHCO-、芐基.NHCO.CH2CH2.CO.(N-甲基Phe)、芐基.NHCO.CH2CH2.CONH.CH(CHPh2).CO、芐基.NHCO.CH2CH2.CO-Tyr、3,3-二苯基丙?；?、反式-肉桂酰基、5-苯基戊?；?-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)丙?；?br> 特別感興趣的P的有用基團(tuán)包括例如Ph.(CH2)4.CO-(5-苯基戊?；?Phv))、Ph.(CH2)4.CS-和3-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)-丙?；?br> 疏水殘基P的優(yōu)選有用基團(tuán)包括例如3-(2-氰基苯并[b]噻吩-5-基)-丙?；?-苯基戊?；?Phv)，尤其是后者。
當(dāng)Rc為式-A1-G1的基團(tuán)時(shí)，當(dāng)A1為亞烷基時(shí)，A1的具體有用基團(tuán)包括例如亞甲基、亞乙基、亞丙基和亞丁基；當(dāng)B2為(1-4C)亞烷基時(shí)，B2的具體的有用基團(tuán)包括例如亞甲基、亞乙基和亞丙基；當(dāng)C3為(1-3C)亞烷基時(shí)，C3的具體的有用基團(tuán)包括例如亞甲基、亞乙基和亞丙基。
-A1-G1的具體的有用基團(tuán)包括例如3-胍基丙基、4-(2-胍基乙基)苯基、4-(2-嗎啉代乙基.NH.CO.CH2)苯基和4-(4-[2-(2-羥基乙氧基)乙基]哌嗪-1-基.CO.CH2)苯基。
當(dāng)Q為1-6個(gè)氨基酸殘基的序列時(shí)，Q的具體的有用基團(tuán)包括例如獨(dú)立選自以上定義的AA1-AA8的任一合適獨(dú)立的有用基團(tuán)的L-氨基酸殘基序列(諸如Ala-Thr-Gly-OH)或它們的D-類似物或既含有D-氨基酸也含有L-氨基酸的序列或它們的酰胺，諸如由氨、(1-4C)烷基胺(諸如甲胺)或二(1-4C)烷基胺(諸如二甲胺)衍生的酰胺。
Q的優(yōu)選有用基團(tuán)包括例如4-氨基甲?；?1-哌啶基(哌啶-4-甲酰胺的殘基(Pip-NH2))、4-羧基-1-哌啶基(哌啶-4-甲酸的殘基(Pip-OH))、4-(氨基甲?；谆?苯胺基(4-氨基苯基乙酰胺的殘基(Papa-NH2))、4-(羧甲基)苯胺基(4-氨基苯乙酸的殘基(Papa-OH))和4-(2-胍基乙基)苯胺基(2-(4-氨基苯基)乙基胍的殘基(Pape-NHC(=NH)NH2)。Pip-NH2和Papa-NH2為Q特別優(yōu)選的有用基團(tuán)，尤其是Papa-NH2。
本發(fā)明具體的新肽衍生物包括例如以上定義的式Ⅰ的肽化合物，其中
(1)在式Ⅱ中，n=1,X=-CO-；(2)在式Ⅱ中，n=4,X=-NHCO-；(3)在式Ⅱ中，R1和R2為式(A)的基團(tuán)(相同或不同)，其中a=1；(4)在式Ⅱ中，R1和R2為式(A)的基團(tuán)(相同或不同)，其中R3和R4為式-[(CH2)bO]m-Ra的基團(tuán)(相同或不同)，其中b=2；(5)在式Ⅱ中，R1和R2為式(A)的基團(tuán)(相同或不同)，其中R3和R4為式-[(CH2)bO]m-Ra的基團(tuán)(相同或不同)，其中m=1、2或3；(6)在式Ⅱ中，R1和R2為式(B)的基團(tuán)(相同或不同)，其中c=2；(7)在式Ⅱ中，R1和R2為式(B)的基團(tuán)(相同或不同)，其中d=2；(8)在式Ⅱ中，R1和R2為式(B)的基團(tuán)(相同或不同)，其中R5和R6為式-[(CH2)eO]p-Re的基團(tuán)(相同或不同)，其中e=2；(9)在式Ⅱ中，R1和R2為式(B)的基團(tuán)(相同或不同)，其中R5和R6為式-[(CH2)eO]p-Re的基團(tuán)(相同或不同)，其中p=1；(10)在式Ⅱ中，R1和R2為式(C)的基團(tuán)(相同或不同)，其中f=2；以及(11)在式Ⅱ中，R1和R2為式(C)的基團(tuán)(相同或不同)，其中g(shù)=3；并且其中，除非另外說明，否則AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、P和Q具有上文定義的任何含義。
當(dāng)R3、R4、R5和R6以及R1和R2選自式-[(CH2)fO]g-R7的基團(tuán)時(shí)，其具體有用基團(tuán)包括例如-CH2CH2OCH3、-CH2CH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3、-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3、-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2OCH3和-CH2CH2OCH2CH2CH2OCH2CH2CH2OCH3。
其它具體的本發(fā)明新肽衍生物包括例如式Ⅰ的以下肽衍生物(ⅰ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-AA6-AA7-AA8-Q；(ⅱ)P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q；(ⅲ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA6-Ⅱ-AA8-Q；(ⅳ)P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-Ⅱ-AA8-Q；(ⅴ)P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q；和(ⅵ)P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q；其中Ⅱ表示上文定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，Ⅲa表示下文提出的式Ⅲa的基團(tuán)，并且其中除非另外陳述，否則AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、P和Q具有在此定義的任何含義，包括具體和優(yōu)選的有用基團(tuán)。(應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，在出現(xiàn)AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7或AA8的基團(tuán)(ⅰ)-(ⅵ)中，它們?yōu)長-氨基酸殘基，具體指明了式Ⅱ或Ⅲa基團(tuán)的存在和位置)?；鶊F(tuán)(ⅰ)-(ⅵ)為本發(fā)明其它獨(dú)立的方面。
(ⅰ)-(ⅵ)中特別感興趣的肽衍生物包括例如這樣的肽衍生物，其中在式Ⅱ中，n=1或2,X=羰基，以及R1和R2都為式(C)基團(tuán)(尤其其中f=2,g=3和/或R7甲基，諸如-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)或都為式(A)基團(tuán)(尤其其中a=1,b=2,m=1或3和/或Ra=甲基，諸如-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)或-CH2CON[(CH2CH2O)3CH3)]2。在(ⅰ)-(ⅵ)的基團(tuán)中，基團(tuán)(ⅰ)和(ⅴ)的肽衍生物是特別感興趣的。優(yōu)選的肽衍生物包括例如基團(tuán)(ⅴ)的化合物，其中，在式Ⅱ中，n=1,X=羰基，以及R1和R2都為式(A)基團(tuán)。
AA1-AA8的優(yōu)選有用基團(tuán)(當(dāng)AA1、AA4或AA7不是式Ⅱ的氨基酸殘基時(shí)，以及當(dāng)AA4與AA5一起或AA6與AA7一起不是式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基團(tuán)時(shí))包括例如，
選自Ala、Ile、Tyr、Val、Glu、Lys、Arg、Gly、Gap、GapMe4和3,3,3-三氟丙氨酸，特別是Ala、Ile、Arg、Gap、GapMe4，尤其是Ala、Arg和Ile，更尤其是Ala和Arg的AA1；選自Ala、Lys、Glu、Sar、Val、Arg、Gly、Pro、Ile、Tic、3,3,3-三氟丙氨酸和N6-二乙基Lys，特別是Ala、Arg、Ile、Lys和Tic，尤其是Ala、Arg、Ile和Tic，更尤其是Ala和Arg的AA2；選自Ala、His、Gln、Val、Thr、Glu、Gly、Asp、Asn和N3-二乙基Dap，特別是Ala、His、Asp和Asn，尤其是Ala和Asn，更尤其是Ala的AA3；選自Ala、Lys、Asn、Arg、Thr、Glu、Sar、Gly、Pro、His和N6-二乙基Lys，特別是Ala、Arg、Lys和His，尤其是Ala、Arg和His，更尤其是Ala的AA4；選自Thr、Val、Ala、Gly、Dap、Dab、Pro、Hyp、Asn、Ser和N3-二乙基Dap，特別是Thr、Val和Dap，尤其是Thr和Val的AA5；選自Gly、Leu、Lys、Ala、Pro、Glu、Sar、His和Dap(尤其是Ala和Pro)的AA6；選自Pro、Ala、Lys、Arg、Glu、Sar、Gly、Oic和Dic(尤其是Ala和Arg)的AA7；和選自Ala、Gly、Dap、氮雜丙氨酸和氮雜甘氨酸，特別是Ala、Gly和氮雜甘氨酸，尤其是Ala和Gly的AA8。(這里Gap是指-NH.CH[CH2NH.C(=NH).NH2].CO-殘基，這里GapMe4是指-NH.CH(CH2N=C[N(CH3)2]2.CO-殘基)。
本發(fā)明肽衍生物的其它具體獨(dú)立的基團(tuán)包括例如式Ⅰ的肽衍生物，其中AA1、AA4和AA7中的1個(gè)或2個(gè)選自上文定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8中其余的為L-氨基酸殘基(包括以上定義的合適的、具體的和優(yōu)選的有用基團(tuán))。
當(dāng)式Ⅰ肽衍生物含有式Ⅲ、Ⅳ、Ⅳa或Ⅴ的基團(tuán)時(shí)，式Ⅲ中的Ra和Ⅳ和Ⅳa中的Rb以及式Ⅴ中的Rz為烷基時(shí)，它們的具體有用基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基和異丙基。在含有式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa基團(tuán)的肽衍生物中，最好是含有式Ⅲa基團(tuán)的肽衍生物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方面包括含有精氨酸殘基的式Ⅰ肽衍生物，特別是其中AA1或AA2為精氨酸的化合物(諸如部分序列AA1-AA2-AA3為Ala-Arg-Ala或Arg-Ala-Ala的化合物)。
特別感興趣的本發(fā)明的肽衍生物包括例如下文所附的實(shí)施例中提出的具體實(shí)施方案。其中實(shí)施例3和6的肽衍生物特別重要，這些化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為本發(fā)明的其它特征被提供。(SEQ ID NO:3)
實(shí)施例3(SEQ ID NO:6)
實(shí)施例6本發(fā)明的另一方面包括保護(hù)的(例如用Fmoc)或未保護(hù)的式Ⅱ氨基酸，其中n、X、R1和R2具有以上定義的任何有用基團(tuán)，包括具體的和優(yōu)選的有用基團(tuán)。
對(duì)于具有足夠堿性的肽衍生物，例如具有游離氨基的肽衍生物而言，其藥學(xué)上可接受的鹽包括例如與形成生理上可接受的陰離子的酸的鹽，諸如與無機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸例如為鹵化氫(諸如氯化氫和溴化氫)、磺酸和膦酸；和與有機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸例如為乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、對(duì)甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸等等，而對(duì)于足夠酸性的肽衍生物，例如具有游離羧酸基團(tuán)的肽衍生物而言，其藥學(xué)上可接受的鹽包括例如與形成生理上可接受的陽離子的堿的鹽，諸如與堿金屬(諸如鈉和鉀)、堿土金屬(諸如鎂和鈣)、鋁和銨鹽的鹽以及與合適有機(jī)堿的鹽，所述有機(jī)堿諸如乙醇胺、甲胺、二乙胺、異丙胺、三甲胺等等。
如上所述，式Ⅰ的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在溫血?jiǎng)游?包括人類)的多種自身免疫疾病或紊亂中將具有有益的藥理學(xué)作用，以治療癥狀或作為疾病改善劑或作為預(yù)防性治療。這類疾病可以包括例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、Goodpasture氏綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜、少年性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹腔疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、Sjogren綜合征、重癥肌無力、1型(胰島素依賴性)糖尿病、Hashimoto氏病、Grave氏病、Addison氏病、硬皮病、多肌炎、皮膚肌炎、尋常性天皰瘡、大皰性類天皰瘡、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、腎小球性腎炎、移植排斥等等，尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥。
可以采用各種各樣的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)和臨床研究，包括國際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO92/02543、WO93/05011和WO95/07707(或其修改)中描述的和下述的試驗(yàn)或研究，評(píng)價(jià)式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)用性。式Ⅰ肽衍生物在一個(gè)或多個(gè)這類試驗(yàn)或研究中表現(xiàn)出顯著活性。
試驗(yàn)A純化的HLA-DR肽的體外結(jié)合試驗(yàn)。(該試驗(yàn)可以用來證明式Ⅰ的肽衍生物與疾病相關(guān)MHCⅡ類分子的結(jié)合。)將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的30μl 800nM的生物素-FHA307-320(用長鏈生物素在N末端衍生的FHA(307-320)肽，生物素-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)與30μl濃度為0.5-5μg/ml的純化HLA-DR4Dw4，在V形孔的微量滴定板(Nunc)中孵育48小時(shí)，其中加或不加抑制劑肽。孵育結(jié)束時(shí)，將100ul濃度為10μg/ml的孵育物轉(zhuǎn)移至先前包被抗MHC抗體(Lampson和Levy(1980)J.Immunol.125,293-299中所述的L243-美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)HB55)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)板(Nunc)上，于室溫下孵育1小時(shí)，此后用PBS和0.05％Tween20中的1％牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)。再過1小時(shí)后，洗去未結(jié)合的肽，加入具有諸如NP-40(Sigma)的0.01％的合適洗滌劑的稀釋度為1/4,000的PBS中的抗生蛋白鏈菌素過氧化物酶(Sigma)，于室溫下孵育2小時(shí)。再次洗滌后，在每塊板中加入四甲基benzidene(TMB)底物溶液(10ml 0.1M pH6.0檸檬酸鹽/乙酸鹽緩沖液中1片TMB(Sigma)，和36μl過氧化氫脲(UHPO)(Fluka))。加入2M硫酸(每孔10μl)終止反應(yīng)，于450nm下讀出吸收值，以定量測定結(jié)合肽的量。通過將吸收值對(duì)濃度作圖，獲得肽的抑制活性。
可以如下獲得所述純化HLA-DR4Dw4(ⅰ)HLA-DR在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)在昆蟲細(xì)胞中由桿狀病毒載體表達(dá)重組蛋白是一個(gè)已建立的獲得高產(chǎn)量重組蛋白的方法[Luckow,VA和Summers,MD(1988)Biotechnology,6,47-551]。為了能夠表達(dá)異二聚體HLA-DR，例如HLA-DR4Dw4，由單重組桿狀病毒載體(與具有分別用于α和β鏈的重組病毒，然后進(jìn)行共感染不同)構(gòu)建攜帶α和β兩條鏈的雙重組桿狀病毒。
將編碼α多肽序列的cDNA克隆到轉(zhuǎn)移載體pacYM1[Matsuura,Y；Possee,RD；Overton,HA和Bishop,DHL(1987),J.Gen.Virol.68,1233-1250]中，將該蛋白的表達(dá)置于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制之下。通過同源重組，將該單位插入Sf21昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒基因組中，以產(chǎn)生用于α鏈的單重組桿狀病毒。Summers MDD和Smith GE(1987)[A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect CellCulture Procedures；Texas Agricultural Experiment Station,Bulletin No.1555]全面描述了用于培養(yǎng)和感染昆蟲細(xì)胞、用于同源重組和監(jiān)測/分離重組病毒的技術(shù)。同樣，在所述文獻(xiàn)中可容易地得到用來構(gòu)建所述重組載體的分子遺傳技術(shù)，Sambrook,J；Fritsch,EF和Maniatis T,(1989)[分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版.冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社]最全面地描述了這些技術(shù)。
為了產(chǎn)生雙重組桿狀病毒，將編碼β鏈的cDNA克隆到轉(zhuǎn)移載體pAcUW1[Weyer,U；Knight,S和Possee,RD(1990)J.Gen.Virol.,71,1525-1534]中，以將該蛋白的表達(dá)置于P10啟動(dòng)子的控制之下。然后將該單位插入攜帶α鏈的單重組桿狀病毒的基因組中。通過將用從所述轉(zhuǎn)染物中隨機(jī)挑選的病毒感染的昆蟲細(xì)胞點(diǎn)在膜上，將其與例如L243的單克隆抗體反應(yīng)，檢測雙重組病毒，所述L243特異性地識(shí)別HLA-DR異二聚體。采用在所述文獻(xiàn)中容易得到的標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測該抗體與Sf21昆蟲細(xì)胞的結(jié)合。噬斑純化表達(dá)HLA-DR的穩(wěn)定的雙重組桿狀病毒。(ⅱ)從昆蟲細(xì)胞純化HLA-DR所用方法為Gorga等1987(Gorga等，1987.J.Biol.Chem.262,16087-16094)所述方法的修改方法。通過用特氟隆玻璃勻漿器進(jìn)行10個(gè)沖程勻化，將表達(dá)HLA-DR的桿狀病毒/Sf21細(xì)胞(10L，大約等于2×1010細(xì)胞)溶于100ml 5mM EDTA(鈉鹽)、50mM Tris-HCl pH8.5、2％NP40、150nM NaCl、1mM碘乙酰胺、1mM PMSF中。將勻漿液以100,000g離心1小時(shí)，收集上清液。將以50mg L243對(duì)10ml A蛋白-快速瓊脂糖(Sepharose fast flow)(Pharmacia)的比率共價(jià)偶聯(lián)并與10mM Tris-HCl pH8.0、0.1％NP-40預(yù)孵育的抗HLA-DR單克隆抗體LB3.1(Gorga等1986,Cell.Immunol.103,160-172)與所述上清液孵育過夜。然后將該樹脂放入柱中，用10mM Tris-HCl pH8.0、0.01％NP-40(20個(gè)柱體積)洗滌，然后用0.15M NaCl、50nM Na2HPO4pH7.0、1％辛基葡糖苷(20個(gè)柱體積)洗滌。用50mM二乙胺pH11.0、0.15M NaCl、1％辛基葡糖苷洗脫HLA-DR。柱流分立即用1MTris-HCl pH8.0中和，并通過centricon-10膜超速離心濃縮。通過BCA蛋白測定(Pierce)測定蛋白含量，通過SDA-PAGE電泳測定純度。
一般而言，在試驗(yàn)A中測試的以上定義的式Ⅰ肽衍生物在大約10μM或低得多的濃度下表現(xiàn)出顯著的抑制。
本發(fā)明另一優(yōu)選的方面包括不與HLA-DR3結(jié)合而與HLA-DR1和/或HLA-DR4Dw4和/或HLA-DR4Dw14結(jié)合的式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。HLA-DR3為與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎無關(guān)的普通HLA-DR等位基因。因此，在攜帶HLA-DR3作為其中一個(gè)等位基因的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人(大約為總的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中的三分之一)中。這種式Ⅰ肽衍生物不干擾HLA-DR3在宿主防御功能中的正常作用。因此，由于使用這種肽衍生物導(dǎo)致的免疫抑制低于用非選擇性DR結(jié)合物發(fā)生的免疫抑制，用這種肽衍生物對(duì)于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人特別有利。
作為試驗(yàn)A的變體，如下評(píng)價(jià)本發(fā)明肽與一種或多種HLA-DR分子結(jié)合的能力(ⅰ)從細(xì)胞系中純化HLA-DR類型所用方法為Gorga等(1987.J.Biol.Chem.262,16087-16094)所述方法的修改方法。通過免疫親和色析從不同的細(xì)胞系純化人HLA-DR抗原。簡單地說，用特氟隆玻璃勻漿器進(jìn)行10個(gè)沖程的勻化，將1×109-5×109選自Hom2(DR1來源)、BBF(DR2來源)、AVL-B(DR3來源)、JAH(DR4Dw4來源)、JHAF(DR4Dw13來源)或PE117(DR4Dw14)的合適細(xì)胞系的沉淀細(xì)胞于大約4℃溶于50ml的5mMEDTA(鈉鹽)、50mM Tris-HCl pH7.4、2％NP40、150mM NaCl、1mM碘乙酰胺、1mM PMSF中。將勻漿液以100,000g離心1小時(shí)，收集上清液。將共價(jià)偶聯(lián)到CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)上的抗HLA-DR單克隆抗體LB3.1(Gorga等1986,Cell.Immunol.103,160-173)與150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、0.1％NP-40預(yù)平衡，并與所述上清液孵育過夜。然后將該樹脂裝入柱中，用0.15M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、1％辛基葡糖苷(20個(gè)柱體積)洗滌。用50mM二乙胺pH11.0、0.15M NaCl、1％辛基葡糖苷洗脫出所述HLA-DR。柱流分立即用0.5M HEPES NaOH pH7.4中和。通過Biorad蛋白測定法測定蛋白含量，通過SDS-PAGE電泳測定純度。(ⅱ)肽的選擇性結(jié)合測試將磷酸緩沖鹽水(PBS)中的200nM生物素-FHA307-320在具有或不具有測定緩沖液(PBS,0.01％NP40(Sigma))中的抑制肽的V形孔微量滴定板(Nunc)中或者與純化的HLA-DR1、DR2、DR4Dw4、DR4Dw13或者與DR4Dw14(2-20μg/ml)孵育。對(duì)于DR3抑制而言，將400nM生物素-Ahx-(D)Ala-Ala-Ala-Che-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-(D)Ala-OH與純化的DR3(20μg/ml)一起孵育并按上述孵育。48小時(shí)后，處理所述孵育物，按試驗(yàn)A中所述取吸收讀數(shù)。采用PC上的Microcal Origin軟件計(jì)算肽的抑制活性，以IC50值表示。
試驗(yàn)B:T細(xì)胞激活的體外抑制。(該測試可以用來證明式Ⅰ肽衍生物抑制通過MHCⅡ類分子介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力)。
測試抑制肽阻斷B52.24鼠T細(xì)胞雜交瘤系對(duì)由HLA-DR4Dw4分子提呈的FHA307-320肽(H-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Th-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH)反應(yīng)的刺激的能力。通過按Woods等(1994)(J.Exp.Med.180,173-181)概述的，并按照Current Protocols inImmunology，第2卷，7.21中給出的用于產(chǎn)生T細(xì)胞雜交瘤的通用方法，將取自FHA307-320免疫的HLA-DR4Dw4轉(zhuǎn)基因小鼠(國際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO95/03331)的淋巴結(jié)T細(xì)胞與BW5147鼠T細(xì)胞淋巴瘤系(White等(1989)J.Immunol.143,1822)融合，生產(chǎn)B52.24。
通過在96孔微量滴定板(Nunc)中的PRM1-1640培養(yǎng)基(Gibco)中稀釋，將濃度為100-0.1μM(或更低)的抑制肽與或者濃度為100-1.0μM或者為10μM固定濃度的抗原肽FHA307-320混合，最終體積為100μl。通過在1％戊二醛(Sigma)中懸浮，用戊二醛以4×106細(xì)胞/ml將諸如JAH EBV轉(zhuǎn)化類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系(歐洲培養(yǎng)物保藏中心ECACC85102909)的表達(dá)HLA-DR4Dw4的B細(xì)胞、或取自HLA-DR4Dw4純合個(gè)體并用EB病毒按照Current Procotols in Immunology 7.22.1中所述方法轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞固定30秒，此后，加入等體積的200mM賴氨酸(Sigma)3分鐘。通過以300g離心收集細(xì)胞，在PRMI-1640中洗滌，以每孔2×105細(xì)胞濃度加入含有抗原和抑制化合物的微量滴定板中。將所述微量滴定板于37℃和5％CO2下孵育2小時(shí)。
然后通過以300g離心并吸出2次，將所述微量滴定板在PRMI-1640中洗滌，然后加入培養(yǎng)基(PRMI-1640,10％胎牛血清(Gibco)和2mM谷氨酰胺(Gibco))中的每孔105細(xì)胞的B52.24T細(xì)胞雜交瘤系。然后將微量滴定板于37℃和5％CO2下再孵育2天。然后將所述板以300g離心10分鐘，從所有孔取出150μl上清液，在生物測試IL-2含量之前于-20℃冷凍。
將含待分析上清液的培養(yǎng)板于室溫下放置解凍，將100ml上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔圓底板中。用培養(yǎng)基(PRMI-1640(Gibco)、10％胎牛血清(Advanced Protein Products)、100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和50μM 2-巰基乙醇(Sigma))將IL-2進(jìn)行1∶1連續(xù)稀釋，產(chǎn)生最后的250單位/ml-0.04單位/ml IL-2的標(biāo)準(zhǔn)曲線。收集諸如CTLL-2細(xì)胞(Nature(1977)268 154-156)或HT-2細(xì)胞(J.Immunol.Methods(1987)94-104)的IL-2依賴性細(xì)胞系，在以5×104細(xì)胞/ml再懸浮之前，用培養(yǎng)基洗滌2次。向標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和測試樣品的每孔中加入100μl IL-2依賴性細(xì)胞懸浮液。將培養(yǎng)板于37℃和5％CO2下孵育72小時(shí)。此后，每孔加入20μl(1mCi)3H-胸苷(Amersham International)，將所述板放回培養(yǎng)箱中16小時(shí)。在玻璃纖維濾墊(filter mat)上收獲每板的內(nèi)容物，用β板(betaplate)閃爍計(jì)數(shù)器測定放射活性。
一般而言，在試驗(yàn)B中測試的以上定義的式Ⅰ肽衍生物在大約10μM或低得多的濃度下表現(xiàn)出顯著的抑制。
試驗(yàn)C:BALB/C小鼠中肽刺激的DTH(遲發(fā)型超敏反應(yīng))。(該試驗(yàn)可以用來證明式Ⅰ肽衍生物在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性)。用0.1ml與弗氏完全佐劑(Sgima)1∶1(v/v)混合的卵清蛋白(Sigma)(鹽水中2mg/ml)乳液在每組5只的Balb/c雌性小鼠(18-20g)的脅腹皮下免疫。7天后，用雙徑卡尺測微計(jì)(dual caliper micrometer)測量爪墊的厚度，然后在一只后爪墊足底下注射30μl鹽水中的1％熱聚集卵清蛋白進(jìn)行激發(fā)。抗原激發(fā)后24小時(shí)，測量爪墊，按與對(duì)側(cè)對(duì)照爪墊相比，以注射爪墊的爪墊厚度增加的百分比計(jì)算DTH反應(yīng)。通過在抗原激發(fā)前24小時(shí)植入的3天微型滲透泵(Alzet)給與抑制劑，劑量范圍為10mg/kg/天-0.1μg/kg/天。通過用給與溶媒的對(duì)照減去抑制劑處理的爪墊的腫脹值，除以該對(duì)照值再乘以100％，計(jì)算抑制程度。
一般而言，在試驗(yàn)C中測試的以上定義的式Ⅰ肽衍生物在大約1mg/kg/天或低得多的劑量下表現(xiàn)出顯著的抑制，而沒有任何明顯的毒理學(xué)作用或其它不適當(dāng)?shù)乃幚韺W(xué)作用。
試驗(yàn)D(該測試可以用來證明式Ⅰ肽衍生物在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性)。
通過皮下注射0.1ml含等體積鹽水中2mg/ml甲基化牛血清白蛋白(met-BSA,Sigma)和弗氏完全佐劑(Sigma)的乳液，在第0天免疫Balb/c雌性小鼠(19-21g,5-10/組)，并在第7天加強(qiáng)，所述弗氏完全佐劑補(bǔ)充2.5m/ml結(jié)核分支桿菌(MTB，菌株C、DT和PN、MAFF,Weybridge,Surrey)，因此產(chǎn)生的MTB終濃度為3.5mg/ml。同時(shí)腹膜內(nèi)注射另外0.1ml鹽水中的109百日咳桿菌生物(Wellcome Pertussis疫苗)。14天后，用30號(hào)針頭和hamilton注射器，在一個(gè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射含100ug met-BSA的10μl鹽水激發(fā)動(dòng)物。對(duì)側(cè)膝蓋注射相似體積的鹽水用作對(duì)照。13天后，通過用雙徑卡尺測微計(jì)測量，測定與雙膝相關(guān)的炎癥/腫脹程度。通過用平頭剪刀和鑷子，在所述膝蓋上下大約5mm的皮膚做一切口并繼續(xù)沿該膝蓋側(cè)，形成一片，然后將其小心地切下，暴露下面的關(guān)節(jié)來做到這一點(diǎn)。保持在固定位置中的彎曲肢上測量該膝蓋水平面的最寬部分。按照下式計(jì)算與對(duì)照相比注射抗原膝蓋中炎癥增加的百分比[注射抗原的膝蓋厚度-注射鹽水的膝蓋厚度/注射鹽水的膝蓋厚度]×100。采用抗原激發(fā)前24小時(shí)植入的14天微型滲透泵(Alzet)給與抑制劑，其劑量范圍為10mg/kg/天-0.1ug/kg/天。從給與溶媒的對(duì)照的腫脹值減去抑制劑處理組的腫脹值，除以對(duì)照值再乘以100，計(jì)算炎癥/腫脹的抑制百分比。疾病的其它評(píng)價(jià)包括1)在用蘇木精和曙紅染色的固定膝蓋切片上進(jìn)行炎癥、滑膜炎和軟骨/骨侵蝕的組織學(xué)評(píng)價(jià)，以及2)測定血清中的急性相反應(yīng)物、血清淀粉狀蛋白P和/或觸珠蛋白水平。
以上定義的式Ⅰ肽衍生物在試驗(yàn)D中在大約10mg/kg/天或低得多的劑量下可以表現(xiàn)出顯著的抑制。
通過說明特定的式Ⅰ肽衍生物的藥理學(xué)活性，實(shí)施例3和實(shí)施例6的化合物在不高于0.1微摩爾的濃度下表現(xiàn)出與試驗(yàn)A(或上文所述試驗(yàn)A的變體)中的HLA-DR4Dw4顯著結(jié)合，在試驗(yàn)C中在＜0.1mg/kg/天下有活性。實(shí)施例3的化合物也表現(xiàn)出與HLA-DR4Dw14顯著結(jié)合，但用實(shí)施例3或?qū)嵤├?化合物沒有發(fā)現(xiàn)與HLA-DR1、HLA-DR2或HLA-DR3顯著結(jié)合(IC50＞100微摩爾)。提取的聚合物貯存制劑形式的兩種化合物在pH3和pH7.6下都表現(xiàn)出良好的水穩(wěn)定性，表現(xiàn)出最低限度的由擠壓降解引起的損失和從這種貯存制劑中釋放時(shí)最低限度的降解。
用本領(lǐng)域已知的可用于類似肽合成的肽化學(xué)的任何方法制備式Ⅰ的肽衍生物。
例如可以用Atherton和Sheppard的“Solid Phase Peptide Synthesis:Apractical approach”(由牛津大學(xué)出版社的IRL出版社出版，1989)中公開的類似方法，獲得式Ⅰ的肽衍生物。Stewart和Young(由PierceChemical Company,Illinois出版，1984)的“Solid Phase PeptideSynthesis”、“Principles of Peptide Synthesis”(由Springer-Verlag,Berlin出版，1984)和一系列書“Amino Acids,Peptides and Proteins”(第1-25卷；1994年出版的第25卷)(由the Royal Society of Chemistry,Cambridge,UK出版)。
最好是，通過固相連續(xù)合成制備式Ⅰ的肽衍生物。采用該技術(shù)，保護(hù)待成為該肽C末端氨基酸的氨基酸的α-氨基，必要時(shí)保護(hù)側(cè)鏈中的氨基，將所述氨基酸偶聯(lián)到固相載體上，所述固相載體如果在裂解后需要游離羧酸，則例如為2-氯三苯甲基氯樹脂或Merrifield樹脂(氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯)，或如果裂解后需要甲酰胺，則為Rink酰胺樹脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基樹脂)或Rink酰胺MBHA樹脂(N-(4-[2’,4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨?；?-4-甲基二苯甲胺樹脂(所有都可得自Calbiochem-Novabiochem)，此后除去α-氨基上的保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)待連接到C末端氨基酸的氨基酸的α-氨基，必要時(shí)保護(hù)側(cè)鏈中的氨基，將所述氨基酸偶聯(lián)到仍連接到該固相載體上的碳末端氨基酸上。重復(fù)所述α-氨基的去保護(hù)和偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸的分步過程，產(chǎn)生連接到該固相載體上的保護(hù)或未保護(hù)的多肽。例如，按所述實(shí)施例中所述或按下文的流程Ⅰ中說明的方法，或與其類似的方法，采用對(duì)稱或非對(duì)稱的式R1R2NH胺，可以獲得式Ⅱ的保護(hù)氨基酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，例如所述實(shí)施例中所述的或在下文流程2中說明的方法，或與其類似的方法，獲得式R1R2NH胺。用來進(jìn)行流程1和2反應(yīng)步驟的試劑和條件是本領(lǐng)域已知的，并在標(biāo)準(zhǔn)教科書中進(jìn)行了描述，所述反應(yīng)步驟諸如為醇類和胺類的烷基化、胺和羧酸形成酰胺的偶聯(lián)、形成脲和氨基甲酸酯和保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)和去保護(hù)。采用適當(dāng)保護(hù)的(3-氨基-2-氧代-吡咯烷-1-基)鏈烷酸(對(duì)于含Ⅲ的肽化合物，其中A=亞甲基)，或按J.Med.Chem.,1993,36,256-263中所述方法或通過與其類似的方法獲得的相應(yīng)的氧雜類似物(對(duì)于其中A為氧的含Ⅲ肽化合物)，或(6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基)鏈烷酸(對(duì)于含Ⅳ的肽化合物)取代保護(hù)的氨基酸，將式Ⅲ或Ⅴ的基團(tuán)加入該序列中。采用按J.Med.Chem.,1993,36,256-263中所述方法(或通過與其類似的方法)或按下文實(shí)施例中所述方法(或與其類似的方法)獲得的適當(dāng)保護(hù)的3-氨基-2-氧代全氫化吖庚因-1-鏈烷酸，可以將式Ⅴ的基團(tuán)加入該序列中。用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如采用三氟乙酸、三乙基硅烷和水的混合物，從該固相載體釋放所述保護(hù)或未保護(hù)的多肽。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以在用來從該固相載體釋放該多肽的條件下裂解側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，或可以在從該固相載體釋放該多肽之前或之后作為單獨(dú)的步驟進(jìn)行裂解。也應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以通過在具體的偶聯(lián)步驟中采用2個(gè)或多個(gè)適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的序列，修改構(gòu)建該多肽的方法。該合成可以采用人工技術(shù)或例如采用Applied Biosystems 431A或430A肽合成儀、Advanced Chemtech ACT357肽合成儀或相似的自動(dòng)肽合成儀自動(dòng)進(jìn)行，或可以采用兩種技術(shù)的組合。
在裝配所述肽期間，用各種官能團(tuán)保護(hù)不參加所述反應(yīng)的氨基酸官能團(tuán)。例如采用9-芴基甲酯基(Fmoc)、叔丁酯基(Boc)、聯(lián)苯基異丙酯基(Bpoc)、2-[3,5-二甲氧基苯基]丙-2-酯基(Ddz)、金剛烷酯基(Adoc)、烯丙酯基(Aloc)、2,2,2-三氯乙酯基(Troc)、芐酯基和各種取代芐酯基保護(hù)N-末端和側(cè)鏈的氨基。需要時(shí)，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如酸或堿處理、催化氫解和Pd(O)處理或鋅/乙酸處理)裂解這些保護(hù)基團(tuán)。
用來保護(hù)含有精氨酸殘基的肽中側(cè)鏈胍基的合適的保護(hù)基團(tuán)包括硝基、金剛烷酯基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?Mtr)、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)和(尤其是)2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。
用來保護(hù)側(cè)鏈羥基的合適的保護(hù)基團(tuán)包括叔丁基、芐基和三苯甲基(Trt)。用于含組氨酸殘基肽的側(cè)鏈咪唑基的合適的保護(hù)基團(tuán)包括三苯甲基、芐基、甲苯磺?；?、二硝基苯基、Adoc、Boc或Fmoc基團(tuán)。
用來保護(hù)側(cè)鏈羧基的合適的保護(hù)基團(tuán)包括各種酯(例如甲酯、乙酯、叔丁酯、芐酯、硝基芐酯、烯丙酯和9-芴基甲酯)。
進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)裂解反應(yīng)的溫度可以為4-40℃(最好在周圍溫度下或其附近)，時(shí)間為10分鐘至24小時(shí)。
用來偶聯(lián)所述各個(gè)氨基酸的合適的偶聯(lián)方法包括常用的疊氮化物、對(duì)稱酸酐、混合酐和各種活性酯和碳二亞胺。在各種碳二亞胺的情況下(例如二環(huán)己基-碳二亞胺或二異丙基-碳二亞胺)，也可以加入多種添加劑(例如1-羥基苯并三唑(HOBT)和N-羥基琥珀酰亞胺)。另外，通過采用多種其它試劑，例如六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基-氧代-三吡咯烷基(pyrrolidino)鏻(PyBOP)、四氟硼酸(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(uronium)(TBTU)和四氟硼酸(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(HBTU)。進(jìn)行所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為-20℃至40℃，時(shí)間為10分鐘至24小時(shí)。進(jìn)行所述偶聯(lián)反應(yīng)的合適介質(zhì)包括例如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。特別合適的方法包括使用DMF中的HBTU、HOBT和二異丙基乙胺。
在本文引用的國際專利申請(qǐng)中例舉了肽合成的這些方法和其它方法。為式R-、R.CO-、R.SO2-、RO.CO-、R.NHCO-、R.O.CS-、R.S.CO-、R.NHCS-、R.S.CS-和R.CS-基團(tuán)(或作為P末端氨基上的取代基存在的基團(tuán)，這里P為疏水氨基酸或帶有其它氨基酸的疏水氨基酸)的疏水殘基P可以作為最后一步，通過烷基化、?；蚱渌┒税被臉?biāo)準(zhǔn)官能團(tuán)修飾而加入。當(dāng)需要C末端修飾(以獲得特定的Q的特定有用基團(tuán))時(shí)，它們可以在合成所述肽后，采用常規(guī)的官能團(tuán)修飾進(jìn)行?；蛘?，可以通過適當(dāng)選擇最初的起始樹脂和/或首先偶聯(lián)到該樹脂上的保護(hù)的實(shí)體(例如通過采用適當(dāng)保護(hù)的式H-Q的基團(tuán))，獲得Q特定的有用基團(tuán)。下文的實(shí)施例中提供制備Ⅰ肽化合物的典型實(shí)例。
測定本發(fā)明肽衍生物穩(wěn)定性的典型方法如下，其中為了最大限度地減小微生物污染和降解，用來制備肽溶液的所有設(shè)備都在高壓滅菌器中滅菌，所有材料的轉(zhuǎn)移都在Ⅱ類層流室中進(jìn)行。采用無菌0.22μm的過濾裝置和20ml注射器，將大約20ml pH3或pH7.6、含0.02％疊氮化鈉的McIlvaine氏檸檬酸-磷酸鹽緩沖液過濾到50ml瓶中。在帶蓋管制瓶中精確地稱量大約1.2mg肽。用無菌移液吸頭，將足夠的緩沖液加入該管制瓶的所述肽中，使得肽濃度為0.1mg/ml。將該管制瓶蓋上蓋子，震蕩以溶解該肽。采用無菌移液吸頭，將大約1ml的數(shù)等份所述肽溶液轉(zhuǎn)移到10個(gè)HPLC管制瓶中，然后將管制瓶蓋上蓋子。將5個(gè)管制瓶貯存于-18℃,5個(gè)管制瓶貯存于37℃。在初始和于-18和37℃貯存1、2、3和4周后，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用含有雙份樣品注射液的新管制瓶，采用合適的標(biāo)準(zhǔn)品，通過HPLC測定該溶液肽峰的面積。從每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所述肽峰面積與初始面積之比，測定于37℃貯存后在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的剩余肽百分比。優(yōu)選的本發(fā)明肽衍生物在于37℃、pH3和pH7.6貯存后，剩余的肽高于90％，最好高于95％。
正如藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，一般為了治療或預(yù)防，將藥用組合物形式的式Ⅰ肽衍生物給與需要這種治療的溫血?jiǎng)游?包括人類)。
按照本發(fā)明的另一特征，提供藥用組合物，它包含式Ⅰ的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
所述藥用組合物可以采用適于口服使用的形式，例如片劑、膠囊、水溶液或油溶液、懸浮液或乳液；適于鼻使用的形式，例如為嗅劑、噴鼻劑或滴鼻劑；適于陰道或直腸使用的形式，例如為栓劑；適于吸入給藥的形式，例如為細(xì)粉末或液體氣霧劑；適于舌下或頰使用的形式，例如為片劑或膠囊；或適于胃腸外使用(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)的形式，例如為無菌水溶液或油溶液或懸浮液。所述組合物可以采用適于局部給藥的形式，例如為乳油、膏劑和凝膠。也設(shè)想皮膚貼劑。在Comprehensive Medicinal Chemistry，第5卷，第25.2章(Hansch等編輯，Pergamon Press 1990)中描述了一般的制劑。
一般而言，可以采用常規(guī)賦形劑，以常規(guī)方式制備以上組合物。然而，在口服給藥組合物的情況下，所述組合物包含包衣以保護(hù)所述多肽活性組分不受胃中酶作用可能是便利的。
優(yōu)選的本發(fā)明組合物是適于口服的單位劑量形式的組合物，例如每單位劑量含有2.5-500mg，最好含有10-100mg多肽的片劑或膠囊；或適于胃腸外給藥的組合物，它每毫升含有0.5-100mg多肽，最好每毫升含有1-10mg多肽。
胃腸外組合物最好為等滲鹽水中的溶液或等滲葡萄糖緩沖的溶液，必要時(shí)pH為5-9?；蛘?，所述胃腸外組合物可以為設(shè)計(jì)用于緩釋的組合物，在這種情況下，每單位劑量的多肽量一般高于所用常規(guī)注射制劑所需的量。優(yōu)選的緩釋制劑為連續(xù)釋放制劑，例如歐洲專利說明書58481號(hào)中描述類型的制劑，或?qū)τ诤辽僖粋€(gè)堿性基團(tuán)的式Ⅰ肽衍生物而言，為國際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO93/24150中所述的制劑。本發(fā)明的某些肽衍生物具有溶解度特性，使得它們特別適于緩釋胃腸外制劑、特別是含有諸如聚交酯的生物可降解聚酯制劑的生產(chǎn)和加工，也適于提供具有有益釋放分布的緩釋制劑。此外，含有一個(gè)或多個(gè)堿性基團(tuán)、特別是精氨酸的本發(fā)明肽衍生物，也可以與諸如聚交酯的酸封端聚酯形成肽-聚合物鹽，這類肽和肽-聚合物鹽構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。某些這類鹽具有溶解度特性，使得它們特別適于例如WO93/24150中所述的緩釋胃腸外制劑的生產(chǎn)和加工，也適于提供具有有益釋放分布和貯存穩(wěn)定性特性的緩釋制劑。優(yōu)選的緩釋胃腸外制劑每單位劑量含有1-100mg(諸如5-50mg)多肽。優(yōu)選的緩釋胃腸外制劑也是設(shè)計(jì)在至少5天內(nèi)緩釋的制劑。
本發(fā)明的優(yōu)選肽衍生物包括采用擠壓聚合物貯存(depot)制劑時(shí)表現(xiàn)出最小的擠壓時(shí)降解損失的那些肽衍生物，或從這種貯存制劑釋放時(shí)表現(xiàn)出最少降解的肽衍生物。測定本發(fā)明肽降解水平的典型方法如下肽的擠壓聚合物貯存制劑的制備精確稱量大約20mg肽，加入足夠的聚合物(50/50％(摩爾)聚(D,L-乳酸/乙醇酸)共聚物產(chǎn)生大約20％(w/w)的混合物，其中所述共聚物的重均分子量通過大小排阻色譜測定相對(duì)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物大約為20kD，多分散性大約為1.7。將其溶于無酸酐的冰醋酸中，產(chǎn)生大約10％(w/v)的溶液。將該溶液冷凍干燥，將產(chǎn)生的冷凍干燥產(chǎn)物在使用前真空下貯存。
將大約100mg冷凍干燥材料加到小型實(shí)驗(yàn)室擠壓機(jī)機(jī)筒中，壓下柱塞以凝固該樣品。將擠壓機(jī)加熱至90-95℃，于該溫度保持10分鐘，然后在壓力下擠出所述冷凍干燥材料，產(chǎn)生直徑大約為1mm的圓柱形擠出物。肽的擠壓聚合物貯存制劑的肽含量分析精確稱量2個(gè)大約長5mm的含肽的擠壓聚合物貯存制劑，將每個(gè)制劑在單獨(dú)的25ml量瓶中溶于1ml無酸酐冰醋酸。大約1.5小時(shí)后，將每個(gè)制劑的體積用蒸餾水加至25ml，使得所述聚合物沉淀。用0.5μm Millex PTFE濾器濾出所述固體，并收集溶液A。
由0.5mg/ml的蒸餾水中的肽貯液和2.5mg/ml的無酸酐冰醋酸中的聚合物貯液，用蒸餾水將每種溶液制成10ml，如下制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液
將每種標(biāo)準(zhǔn)物通過5μm Millex PTFE濾器過濾，將采用雙份樣品注射，通過HPLC分析連同數(shù)等份溶液A的一等份濾液。由溶液A中肽的濃度計(jì)算擠壓聚合物貯存肽制劑的肽含量，溶液A的肽濃度通過將溶液A的所述肽峰面積與所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的所述肽峰面積比較而測定。優(yōu)選的本發(fā)明肽衍生物表現(xiàn)出最少的擠壓降解損失，因此所述擠壓聚合物貯存制劑的肽含量接近大約20％(w/v)的理論值。
體外由擠壓聚合物貯存物釋放時(shí)肽的降解將含有0.02％疊氮化鈉的pH7.6 McIlvaine氏檸檬酸-磷酸鹽緩沖液的溶液通過0.22μ濾器過濾，并于4℃下貯存。將大約10mg含肽擠壓聚合物貯存物置于2個(gè)小管制瓶中，加入2ml所述緩沖液。然后給管制瓶加蓋，于37℃水浴中貯存1個(gè)月。在1個(gè)月內(nèi)的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)，從每個(gè)管制瓶中取出三等份各0.6ml的釋放介質(zhì)，在通過HPLC分析之前，或者通過HPLC分析或者于-18℃冷凍貯存在HPLC管制瓶中。將1.8ml所述緩沖液加入每個(gè)含所述貯存物的管制瓶中，以取代在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)已經(jīng)取出的釋放介質(zhì)。
采用雙份樣品注射，通過HPLC，將所述釋放介質(zhì)中的肽峰面積與已知肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的肽峰面積相比，測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所述釋放介質(zhì)中完整肽的平均量。通過HPLC，將所述釋放介質(zhì)中的其它新峰面積與已經(jīng)肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的肽峰面積相比，并且假定該消光系數(shù)未改變，測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所述釋放介質(zhì)中肽降解產(chǎn)物的大致平均量。由每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所述釋放介質(zhì)中完整肽和肽降解產(chǎn)物的量確定完整肽和總肽(完整肽和肽降解產(chǎn)物)的體外平均累積釋放分布。優(yōu)選的本發(fā)明肽衍生物表現(xiàn)出體外釋放時(shí)最小的降解，并由此表現(xiàn)出于37℃下在pH7.6的McIlvaine氏緩沖液中體外釋放1個(gè)月后，總肽降解產(chǎn)物低于總肽的10％，最好低于5％。
本發(fā)明的組合物一般給與人類，使得例如對(duì)于70kg病人而言，日劑量為10微克至5000mg，最好為0.1-100mg，必要時(shí)以均分量給與。按照醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的原則，給與的組合物的準(zhǔn)確量和給藥途徑和形式可以取決于待治療病人的體重、年齡和性別，取決于待治療的特定疾病或癥狀極其嚴(yán)重性。
為了治療和預(yù)防，也可能最好將式Ⅰ的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽與一種或多種其它藥物一起給與，所述藥物是本領(lǐng)域一般已知可以治療或減輕一種或多種上文提到的疾病或病況的癥狀(或作為疾病改善劑)的藥物，諸如NSAID(諸如布洛芬或炎痛喜康)、鎮(zhèn)痛藥(諸如對(duì)乙酰氨基酚)、皮質(zhì)類固醇、肌松藥、脂氧合酶抑制劑、甲胺蝶呤、硫唑嘌呤、D-青霉胺、環(huán)胞菌素A或單克隆抗體療法(諸如抗CD-4或抗THF)。在糖尿病中，所述肽化合物可以與胰島素或其它用于糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的其它療法(諸如醛糖還原酶抑制劑)一起共同給與。應(yīng)該理解，這種聯(lián)合療法構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
按照本發(fā)明的另一方面，提供治療MHCⅡ類依賴性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病或炎癥性疾病的方法，所述疾病例如本文提到的一種或多種疾病或病況，該方法包括給與需要這種治療的溫血哺乳動(dòng)物(包括人類)有效量的式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明也提供式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療MHCⅡ類依賴性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病或炎癥性疾病的藥物中的用途。
除上述在人類醫(yī)療中的用途外，式Ⅰ肽衍生物也可用于影響有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的溫血?jiǎng)游锏南嗨萍膊〉墨F醫(yī)治療中，所述動(dòng)物諸如狗、貓、馬和牛。對(duì)于這種治療而言，式Ⅰ的肽衍生物一般以類似于上述用于給與人類的量和方式給與。在開發(fā)用于評(píng)價(jià)MHCⅡ類分子在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(諸如貓、狗、兔、猴、大鼠和小鼠)中的作用的試驗(yàn)系統(tǒng)并將其標(biāo)準(zhǔn)化中作為藥理學(xué)工具及作為繼續(xù)尋找新的、改進(jìn)治療劑或作為診斷試劑，式Ⅰ的肽衍生物也是有價(jià)值的。
現(xiàn)在將通過以下非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明，其中，除非另外陳述，否則(ⅰ)通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮和蒸發(fā)；(ⅱ)于18-26℃的室溫下進(jìn)行操作；(ⅲ)給出收率時(shí)，僅僅是為了幫助讀者，不必是通過努力可得到的最大值；(ⅳ)使用以下縮寫(以及在流程1和流程2中)Phv=5-苯基戊酰基；Boc=叔丁酯基；tBu=叔丁基；DMF=N,N-二甲基亞砜；HOBT=1-羥基苯并三唑；Met=甲硫氨酸；Fmoc=9-芴基甲酯基；Fmoc-Pip-OH=N-(9-芴基甲酯基)哌啶-4-甲酸；Fmoc-Papa-OH=4-[N-(9-芴基甲酯基)氨基]苯乙酸；Z或CbZ=芐酯基；Pmc=2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基；Pbf=2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?；Trt=三苯甲基；THF=四氫呋喃；DMSO=二甲基亞砜；HBTU=六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；DIPEA=二異丙基乙胺；TFA=三氟乙酸；HPLC=高壓液相色譜；以及RP-HPLC=反相高壓液相色譜(除非另外陳述，否則在Vydac C18柱218TP54,4.6×250mm上進(jìn)行)；(ⅴ)在得自德國E Merck,Darmstadt的Merck Kiesegel 60(Art No.9385)上進(jìn)行快速層析和硅膠層析；(ⅵ)1H NHR譜用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，在CDCl3或d6-二甲基亞砜(d6-DMSO)中于200Mhz下測定，并以相對(duì)于TMS的每百萬中的份數(shù)表示化學(xué)位移(δ)值，采用命名主峰的常規(guī)縮寫s，單峰；m，多重峰；t，三峰；br，寬峰，d，雙峰；(ⅶ)用以下Fmoc保護(hù)的氨基酸介紹Lys、Thr、Arg或His殘基對(duì)于Lys:Fmoc-Lys(Boc)-OH；對(duì)于Thr:Fmoc-Thr-(OtBu)-OH；對(duì)于Arg:Fmoc-Arg(Pmc)-OH或Fmoc-Arg(Pbf)-OH；及對(duì)于His:Fmoc-His(Trt)-OH；(ⅷ)式中出現(xiàn)-Ⅱ-時(shí)，這是指下文提出的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，n、X、R1和R2的特定值已給出；以及(ⅸ)式中出現(xiàn)-Ⅲa-時(shí)，這是指下文提出的式Ⅲa基團(tuán)。實(shí)施例1制備Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:1)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)1.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺的制備
(a)在氮?dú)庀?，?-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(30g)加入四氫呋喃(100ml)中的N-芐基二乙醇胺(10g)中。然后分次加入氫化鈉(5.3g 60％的礦物油中的分散液)，同時(shí)在水浴中冷卻。加入完成后，將該混合物攪拌2小時(shí)，再分次加入氫化鈉(4.4g 60％的礦物油中的分散液)。然后，讓該混合物于周圍溫度下攪拌16小時(shí)。小心地將水(50ml)加入該反應(yīng)混合物中，以破壞過量的氫化鈉，蒸發(fā)該混合物，以除去有機(jī)溶劑。將水(100ml)加入該殘余物中，用濃鹽酸將該混合物酸化至大約pH2，然后用乙醚(2×100ml)萃取。棄去萃取液。然后，加入濃氫氧化鈉液，將水層調(diào)至大約pH12，用乙醚(2×150ml)萃取。合并醚萃取液，用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)并蒸發(fā)至干。通過硅膠層析，采用用濃氨水飽和的氯仿→5％甲醇/氯仿的梯度純化該殘余物。收集適當(dāng)?shù)牧鞣?，將其蒸發(fā)至干，產(chǎn)生膠狀物(12g)。加入甲醇(100ml)，然后加入10％碳鈀(2.5g)和甲酸銨(7.2g)，在氮?dú)狻?0℃下攪拌該混合物1小時(shí)。然后將該混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)至干。通過硅膠層析，采用濃氨水飽和的氯仿→10％甲醇/氯仿的梯度純化該殘余物。收集適當(dāng)?shù)牧鞣?，將其合并蒸發(fā)至干，產(chǎn)生作為膠狀物的N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺(7.1g)；NMR(CDCl3):2.8(m,4H),3.3(s,6H),3.45(m,4H),3.6(m,16H)。
(b)邊攪拌邊將N-甲基嗎啉(1.6g)、N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-芐酯(2.6g)、羥基苯并三唑(2.16g)和鹽酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1.68g)加入二甲基甲酰胺(12ml)中的N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺(2.5g)中。將該混合物攪拌16小時(shí)，然后加入到水(50ml)中的2％乙酸中。用乙醚(2×50ml)萃取該混合物，合并的有機(jī)相用碳酸氫鈉溶液洗滌并干燥(MgSO4)。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)生作為膠狀物的N2-叔丁酯基-N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺α-芐酯(2.8g)；NMR(CDCl3):1.4(s,9H),2.9(m,1H),3.2(m,1H),3.4(s,6H),3.6(m,24H),4.6(m,1H),5.2(q,2H),5.8(d,1H),7.4(s,5H)。
(c)將10％鈀碳(0.8g)和環(huán)己烯(1.6g)加入N2-叔丁酯基-N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺α-芐酯(2.6g)的甲醇(20ml)溶液中，將該混合物于55℃加熱2小時(shí)。然后將該混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)。將丙酮(20ml)和水(8ml)加入該殘余物中，加入濃鹽酸(2ml)。將該混合物于55℃加熱1小時(shí)，冷卻并用過量的固體碳酸氫鈉調(diào)至大約pH7。加入碳酸9-芴基甲基琥珀酰亞胺基(succinimidyl)酯(1.36g)，將混合物攪拌16小時(shí)。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，在水(25ml)和乙醚(50ml)之間分配該殘余物。分離水層，用濃鹽酸將其酸化至大約pH3。然后用二氯甲烷(50ml)萃取該混合物。有機(jī)萃取液用水洗滌、干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)，產(chǎn)生作為膠狀物的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)-L-天冬酰胺[下文稱為Fmoc-Asp(PE)-OH](2g)；NMR(CDCl3):2.8(q,1H),3.4(q,1H),3.4(s,6H),3.6(m,24H),4.2-4.6(m,4H),6.3(d,1H),7-42(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。1.2 Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2的制備(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)通過Fmoc固相合成，由Fmoc Rink酰胺MBHA樹脂(Novabiochem,0.50g,0.25mmole)開始，通過混合物的自動(dòng)合成和手動(dòng)合成，用Bond Elut管(Varian,15ml，底部備有濾器)制備所述肽。
首先采用ABI431自動(dòng)肽合成儀，通過按照廠商建議的如下的用于引入HBTU/HOBT化學(xué)的單酰化條件，用Fmoc-Pip-OH(353mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)和Fmoc-Val-OH(339mg,1mmole)去保護(hù)該樹脂并且連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)，獲得Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-樹脂。去保護(hù)后，該樹脂用DMF(10×10-20ml)洗滌。用DMF中的HBTU(1當(dāng)量)、HOBT(1當(dāng)量)和DIPEA(2當(dāng)量)活化該羧酸(1mmole)約11分鐘，然后將其轉(zhuǎn)移至該樹脂上。?；M(jìn)行大約60分鐘，然后該樹脂用DMF(10×10-20ml)洗滌。每個(gè)階段的Fmoc去保護(hù)用DMF中的20％哌啶溶液(用5ml處理2次，每次10分鐘)進(jìn)行。每次去保護(hù)后，用DMF(5×10ml)徹底洗滌該樹脂。
手動(dòng)相繼偶聯(lián)并去保護(hù)該序列中剩余的殘基。加入合適的N-Fmoc-保護(hù)的氨基酸(1mmole)、DMF(1.5ml)、HOBT(165mg,1mmole)和二異丙基碳二亞胺(155微升，1mmole)溶液至該樹脂中進(jìn)行偶聯(lián)。該偶聯(lián)物放置大約30分鐘，用DMF(5×10ml)洗滌，用Kaiser試驗(yàn)(E.Kaiser等，(1970),Anal.Biochem.34,595)檢查該樹脂小部分的偶聯(lián)完成情況。按上述進(jìn)行去保護(hù)。這樣，將Fmoc-Asp(PE)-OH(323mg,0.5mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)和5-苯基戊酸(178mg,1mmole)連續(xù)偶聯(lián)到該樹脂上。該苯戊酸需要雙偶聯(lián)，以獲得Kaiser試驗(yàn)陽性結(jié)果。
用三氟乙酸(7.9ml)和三乙基硅烷(0.395ml)的混合物，從該樹脂裂解該肽。2小時(shí)后，用二氯甲烷(大約150ml)洗滌該樹脂，將產(chǎn)生的溶液蒸發(fā)至干。產(chǎn)生的固體在乙醚(25ml)和水(25ml)之間分配，然后用另外數(shù)份水(2×25ml)萃取該乙醚。將水相合并并冷凍干燥。
用制備型RP-HPLC(Vydac 218TP1022柱，250mm×22mm)，將10ml 20％乙腈/水中的粗物質(zhì)上柱，純化該粗產(chǎn)物。用含0.1％TFA的乙腈-水梯度，以12ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫。合并含產(chǎn)物的部分，將其冷凍干燥，產(chǎn)生白色固體的Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(其中Ⅱ?yàn)槭舰騆-氨基酸的殘基，其中n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)(83mg)。
該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(Vydac C18柱，218TP54,4.6×250mm，用含0.1％TFA的乙腈和水洗脫，在30分鐘內(nèi)采用10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/min)，表明純度為94％，保留時(shí)間為23.29分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1220.7(MH+)。
氨基酸分析(用含1％苯酚的6N HCl溶液于130℃酸水解24小時(shí))產(chǎn)生Ala5.82,Val0.98,Asp1.19。
通過類似于E.Atherton和R.C.Sheppard所述(“Solid phase peptidesynthesis:a practical approach”,IRL press,1989，第51頁)用于N-Fmoc-L-甲硫氨酸方法的方法獲得Fmoc-Pip-OH。
Fmoc-Pip-OH:NMR(DMSO-d6)1.3(m,2H),1.7(m,2H),2.5(m,2H),2.9(t,2H),3.7(m,1H),4.2(t,1H),4.4(d,2H),7.4(m,4H),7.7(d,2H),7.9(d,2H)；質(zhì)譜m/e(ES+)352.2(MH+)實(shí)施例2制備Phv-Ⅱ-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:2)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)
采用類似于實(shí)施例1.2所述的方法,通過將Fmoc-Lys(Boc)-OH(468mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Ala-OH(311mg,1mmole)、Fmoc-Asp(PE)-OH(323mg,0.5mmole)和5-苯基戊酸(178mg,1mmole)連續(xù)偶聯(lián)(手動(dòng))到Fmoc-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH-樹脂(采用手動(dòng)偶聯(lián)獲得的)上，進(jìn)行該合成。用與實(shí)施例1所述的相似的條件，從該樹脂上裂解該肽并純化該粗產(chǎn)物。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的20-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/min)的保留時(shí)間為16.4分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1277.8(MH+)。
氨基酸分析給出Asp1.07,Lys1.05,Ala4.9,Val0.92。實(shí)施例3制備Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:3)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)3.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺的制備
(a)將N-甲基嗎啉(2g)、羥基苯并三唑(4g)、雙(2-甲氧基乙基)胺(3.5g)和鹽酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(3.8g)加入二甲基甲酰胺(15ml)中的N-(芐酯基)亞氨基二乙酸(2.7g)中，將該混合物攪拌16小時(shí)。通過蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，將該殘余物在水和二氯甲烷之間分配。用水洗滌有機(jī)萃取液、干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。通過硅膠層析，采用氯仿→10％甲醇/氯仿的梯度純化該殘余物，產(chǎn)生作為膠狀物的N-(芐酯基)亞氨基二-[N,N-雙(2-甲氧基乙基)]乙酰胺(2.3g)；NMR(d6-DMSO):3.1-3.4(由于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體有4個(gè)單峰，12H),3.5(m,16H),4.2(s,4H),5.05(s,2H),7.3(m,5H)。(b)將10％鈀碳(0.2g)和環(huán)己烯(2ml)加入N-(芐酯基)亞氨基二-[N,N-雙(2-甲氧基乙基)]乙酰胺(3.5g)的乙醇(20ml)溶液中，在氮?dú)庀聦⒃摶旌衔镉?5℃攪拌4小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物冷卻、過濾并蒸發(fā)。邊攪拌邊將N-甲基嗎啉(1.4g)、羥基苯并三唑(1.85g)、N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-芐酯(2.4g)和鹽酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1.6g)加入在二甲基甲酰胺(15ml)中的該殘余物溶液中。將該混合物攪拌16小時(shí)，然后加入到含2％乙酸的水溶液(50ml)中，用乙醚(2×50ml)萃取。將合并的有機(jī)萃取液用碳酸氫鈉溶液洗滌、干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)，產(chǎn)生作為膠狀物的N2-叔丁酯基-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺α-芐酯(4.1g)；NMR(d6-DMSO):1.4(s,9H),2.6(m,2H),3.2(由于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體產(chǎn)生的重疊單峰，12H),3.4(m,16H),4.0-4.4(m,5H),5.1(s,2H),6.8(d,1H),7.4(s,5H)。(c)采用類似于實(shí)施例1的(c)部分所述的步驟，但采用N2-叔丁酯基-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠-L-天冬酰胺α-芐酯(4g)作為原料，因此獲得作為膠狀物的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基]-L-天冬酰胺(下文稱為FMoc-Asp(TE)-OH)(3g)；NMR(CDCl3):2.8(m,1H),3.1(m,1H),3.3(由于旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體產(chǎn)生的重疊單峰，12H),3.6(m,16H),4.2-4.8(m,8H),6.4(d,1H),7.4(m,4H),7.6(d,2H),7.8(d,2H)。3.2 Phv-Ala-Arg-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2的制備(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用類似于實(shí)施例1.2所述的方法，通過用Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、(2S)-[(3R)-3-(N-9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH)、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TE)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH和5-苯基戊酸在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)階段去保護(hù)該樹脂并且連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)，進(jìn)行該合成，所有步驟都手動(dòng)進(jìn)行。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/min)保留時(shí)間為21.88分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1395.8(MH+)。
氨基酸分析給出Asp1.04,Thr0.93,Ala3.12,Arg0.92。
通過類似于E.Atherton和R.C.Sheppard所述(“Solid phase peptidesynthesis:a practical approach”,IRL press,1989，第51頁)用于N-Fmoc-L-甲硫氨酸方法的方法獲得Fmoc-Papa-OHFmoc-Papa-OH:NMR(DMSO-d6)3.5(s,2H),4.25(t,1H),4.5(d,2H),7.1(d,2H),7.4(m,6H),7.75(d,2H),7.9(d,2H),9.6(s,1H)；質(zhì)譜m/e(ES-)372.1(M-H)-如下獲得(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH):(Ⅰ)Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe的合成
將N-甲基嗎啉(5.6g)、鹽酸L-丙氨酸甲酯(3.9g)、HOBt(4.6g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(5.3g)加入在干燥DMF(50ml)中的Boc-(D)-甲硫氨酸(7g,0.028mol)的溶液中。攪拌該混合物過夜。通過蒸發(fā)除去溶劑，將該殘余物在二氯甲烷(100ml)和5％乙酸水溶液(50ml)之間分配。放置時(shí)，HOBt結(jié)晶，并通過過濾將其除去，分離有機(jī)層，用碳酸氫鈉水溶液洗滌、干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。通過在燒結(jié)玻璃漏斗中的快速色譜，用二氯甲烷和乙醚(0-100％乙醚)的混合物洗脫，純化該殘余物(8.5g)。合并并蒸發(fā)含產(chǎn)物的部分，產(chǎn)生放置時(shí)結(jié)晶的作為膠狀物的Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(7.2g)；NMR(CDCl3):1.4(d,3H),1.45(s,9H),1.95(m,1H),2.1(s,3H),2.1(m,1H),2.6(m,2H),3.75(s,3H)4.3(bs,1H),4.6(m,1H),5.3(m,1H),6.9(bs,1H)。(ⅱ)(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯的合成
注意該反應(yīng)必須在干燥條件下用干燥溶劑進(jìn)行，否則將發(fā)生差向異構(gòu)。將甲基碘(10ml)加入含Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe(8g)的DMF(20ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中，將該混合物靜置16小時(shí)，然后蒸發(fā)至干。再加入二氯甲烷(2×50ml)，蒸發(fā)除去殘留的甲基碘，將該殘余物溶于DMF(300ml)和二氯甲烷(300ml)的混合物中。將該混合物冷卻至～5℃，一次性加入氫化鈉(0.76g 80％的礦物油中的分散體)，于該溫度下將該混合物攪拌2小時(shí)。加入飽和氯化銨溶液(50ml)，將該混合物蒸發(fā)至干，然后在水和乙醚之間分配。乙醚萃取液用鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)，產(chǎn)生的膠狀物通過在燒結(jié)漏斗上進(jìn)行快速色譜進(jìn)行純化(25％乙酸乙酯∶己烷至100％乙酸乙酯)，產(chǎn)生靜置時(shí)結(jié)晶的作為膠狀物的(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯(4.2g):NMR(CDCl3):1.4(s,9H),1.4(d,3H),1.8(m,1H),2.6(m,1H),3.4(m,2H),3.7(m,3H),4.2(m,1H),4.9(q,1H),5.2(bs,1H)。(ⅲ)(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(Fmoc-Ⅲa-OH)的合成
將(2S)-2-[(3R)-3-(N-[叔丁酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯(4g)在丙酮(60ml)、水(40ml)和濃鹽酸(24ml)的混合物中回流3小時(shí)，然后將該混合物蒸發(fā)至干。加入水，重復(fù)蒸發(fā)。將該殘余物溶于水(15ml)中，加入過量的固體碳酸氫鈉。加入含9-芴基甲基琥珀酰亞胺基碳酸酯(5.2g)的丙酮(30ml)。將該混合物攪拌16小時(shí)，然后蒸發(fā)除去溶劑，將該殘余物在水和乙醚之間分配。分離水層，用鹽酸將其pH調(diào)至～3，用二氯甲烷萃取。有機(jī)層用水洗滌，干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)，產(chǎn)生白色泡沫，用乙醚研磨結(jié)晶，產(chǎn)生(2S)-2-[(3R)-3-(N-[9-芴基甲酯基]氨基)-2-氧代-吡咯烷-1-基]丙酸(4.2g)白色固體，熔點(diǎn)191-3℃(分解)；NMR(CDCl3):1.4(d,3H),2.0(m,1H),2.6(m,1H),3.4(m,2H),4.2(t,1H),4.4(m,3H),4,9(m,1H),5.8(bs,1H),7.4(m,4H),7.6(d,2H),7.7(d,2H)。實(shí)施例4制備Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Val-Ala-Ala-Ala-Pip-NH2(SEQ ID NO:4)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用與實(shí)施例2所述方法相似的方法，在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)階段用Fmoc-Asp(TE)-OH代替Fmoc-Asp(PE)-OH，進(jìn)行該合成。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/分鐘)保留時(shí)間=23.9分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1274.7(MH+)。
氨基酸分析給出Asp1.03,Ala5,94,Val0.98。實(shí)施例5制備Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅲa-Ala-Ⅱ-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:5)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)采用與實(shí)施例1.2所述方法相似的方法，通過連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)(手動(dòng))Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(PE)-OH、Fmoc-A1a-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Ala-OH(2次)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和5-苯基戊酸，然后從該樹脂上裂解，通過制備型RP-HPLC進(jìn)行純化。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/分鐘)保留時(shí)間=20.45分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)656.4(M+2H++)。
氨基酸分析給出Arg1.06,(Ala+Ⅲa)4.85,Asp1.09實(shí)施例6制備Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:6)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]26.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙[N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲?；谆鵠-L-天冬酰胺的制備
采用類似于實(shí)施例3.1中所述的步驟，制備Fmoc-Asp(TE)-OH，但在部分(a)中用按比例量的雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)胺代替雙(2-甲氧基乙基)胺，由此獲得作為油的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙[N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲?；谆鵠-L-天冬酰胺(下文稱為Fmoc-Asp(TPE)-OH；NMR(CDCl3):2.9(m,1H),3.1(m,1H),3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.2-4.6(m,8H),7.4(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。
進(jìn)行步驟(a)和(b)時(shí)分別獲得以下中間產(chǎn)物N-(芐酯基)亞氨基二-[N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-乙酰胺；NMR(CDCl3):3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.3(s,2H),4.4(s,2H),5.05(s,2H),7.3(s,5H)。
N2-叔丁酯基-N4,N4-雙[N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲?；谆鵠-L-天冬酰胺α-芐酯；NMR(CDCl3):1.9(s,9H),2.7(m,1H),3.05(m,1H),3.4(m,12H),3.6(m,48H),4.4(m,5H),5.2(s,2H),5.9(bd,1H),7.4(m,5H)。6.2 Phv-Arg-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Ⅲa-Ala-Papa-NH2的制備(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3)采用類似于實(shí)施例1.2所述的方法，通過連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)(手動(dòng))Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TPE)-OH、Fmoc-Ala-OH(2次)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH和5-苯基戊酸，然后從該樹脂上裂解，通過制備型RP-HPLC純化，進(jìn)行該合成。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/分鐘)保留時(shí)間為23.61分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1748.0(MH+)。
氨基酸分析給出Arg1.01,Ala3.18,Ⅲa1.05,Asp0.97,Thr0.78實(shí)施例7制備Phv-Ala-Ala-Ala-Ⅱ-Thr-Pro-Arg-Gly-Papa-NH2(SEQ ID NO:7)(式Ⅱ:n=1；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用類似于實(shí)施例1.2所述的方法，通過連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)(手動(dòng))Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(TE)-OH、Fmoc-Ala-OH(3次)和5-苯基戊酸，然后從該樹脂上裂解，通過制備型RP-HPLC純化，進(jìn)行該合成。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的20-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/分鐘)保留時(shí)間為16.07分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1395.7(MH+)。
氨基酸分析給出Arg1.01,Ala3.06,Asp1.02,Thr0.92,Pro0.92,Gly1.05實(shí)施例8制備Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-Ⅲa-Ala-Papa-NH2(SEQ ID NO:8)(式Ⅱ:n=2；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)8.1 N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠-L-谷氨酰胺的制備
采用類似于實(shí)施例3.1中所述的步驟，制備Fmoc-Asp(TE)-OH，但在部分(b)中用按比例量的N-叔丁酯基-L-谷氨酸α-芐酯代替N-叔丁酯基-L-天冬氨酸α-芐酯，由此獲得作為油的N2-(9-芴基甲酯基)-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠-L-谷氨酰胺(下文稱為Fmoc-Glu(TE)-OH)；NMR(CDCl3):2.0-2.4(m,4H),3.3(m,12H),3.5(m,16H),4.2-4.6(m,8H),7.4(m,4H),7.6(m,2H),7.8(d,2H)。
進(jìn)行步驟(b)時(shí)獲得以下中間產(chǎn)物作為膠狀物的N2-叔丁酯基-N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠-L-谷氨酰胺α-芐酯；NMR(CDCl3):1.4(s,9H),2.0(m,1H),2.2(m,1H),2.4(m,2H),3.3(s,12H),3.5(m,16H),4.1-4.5(m,5H),5.2(s,2H),7.3(s,5H)。8.2 Phv-Ⅱ-Arg-Ala-His-Val-Ⅲa-A1a-Papa-NH2的制備(式Ⅱ:n=2；X=羰基；R1=R2=-CH2CON(CH2CH2OCH3)2)采用類似于實(shí)施例1.2所述的方法，通過連續(xù)偶聯(lián)和去保護(hù)(手動(dòng))Fmoc-Papa-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ⅲa-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(TE)-OH和5-苯基戊酸，然后從該樹脂上裂解，通過制備型RP-HPLC純化，進(jìn)行該合成。該產(chǎn)物通過HPLC、質(zhì)譜和氨基酸分析鑒定如下。
RP-HPLC(30分鐘內(nèi)的10-50％乙腈的梯度，流速為1.0ml/分鐘)保留時(shí)間=22.23分鐘。
質(zhì)譜，m/e(ES+)1472.2(MH+)。
氨基酸分析給出Arg0.95,Ala2.17,His0.98,Glu0.99,Val0.92,Ⅲa0.96實(shí)施例9對(duì)于治療和預(yù)防使用，將常規(guī)藥用組合物形式的本發(fā)明化合物給與諸如人類的溫血?jiǎng)游?，其典型?shí)例包括以下內(nèi)容注射液將0.01-100mg活性組分溶于多至2ml的含水注射溶媒中，使活性組分的濃度為0.01-100mg/ml。所述含水注射溶媒用藥學(xué)上可接受的緩沖液(例如磷酸鹽或乙酸鹽)緩沖至pH5-8，該溶液含有加入以達(dá)到等滲性的藥學(xué)上可接受的張力調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉或葡萄糖)。該溶媒也可任選地含有其它藥學(xué)上可接受的賦形劑，諸如增溶劑(例如DMSO、乙醇、丙二醇或聚乙二醇)、防腐劑和抗氧化劑。所述活性組分通?？梢允巧衔拿枋龅膶?shí)例，可以便利地以藥學(xué)上可接受的鹽形式存在。注釋(1)對(duì)于含式Ⅳ基團(tuán)的肽而言，可以如下獲得(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(Fmoc-Ⅳ-OH)(ⅰ)(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)脯氨酸的合成
在氮?dú)庀?，?78℃將含N-芐酯基脯氨酸甲酯(13g)的THF(20ml)滴加到二異丙基氨化鋰(27.5ml,2M在己烷/THF中的THF(100ml)的溶液中)。將該混合物攪拌30分鐘，然后滴加烯丙基碘(5.5ml)，將該化合物再攪拌30分鐘，然后讓其溫?zé)嶂林車鷾囟取Ｈ缓髮⒃摶旌衔锛尤氲铰然@水溶液(200ml)中，用乙醚(2×200ml)萃取。蒸發(fā)乙醚層，采用己烷→20％乙酸乙酯∶己烷的梯度，通過硅膠層析純化該殘余物。將合適的部分蒸發(fā)至干，產(chǎn)生作為油的(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)脯氨酸甲酯(9g)。
將8.5g該物質(zhì)溶于甲醇(40ml)，加入水(20ml)中的氫氧化鈉(4.5g)，將該化合物回流60分鐘。然后用濃鹽酸將該混合物的pH調(diào)至7，通過蒸發(fā)除去甲醇。將該混合物的pH調(diào)至3，用乙醚(2×50ml)萃取該混合物。蒸發(fā)合并的乙醚萃取液，產(chǎn)生作為膠狀物的(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)脯氨酸；NMR(d6-DMSO(373K)):1.9(m,2H),2.1(m,2H),2.6(q,1H),2.9(q,1H),3.4(m,1H),3.6(m,1H),5.0(m,4H),5.75(m,1H),7.3(m,5H).(ⅱ)[(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯的合成
將HOBt(7.7g)、N-甲基嗎啉(6.6g)、鹽酸L-丙氨酸甲酯(4.5g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺(5.7g)加入含(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)脯氨酸(6.5g)的DMF(30ml)中，將該混合物攪拌18小時(shí)，然后蒸發(fā)。將該殘余物在乙醚和水之間分配，過濾除去HOBt，并分離有機(jī)層。蒸發(fā)有機(jī)層，采用己烷中20％乙酸乙酯增至己烷中50％乙酸乙酯的梯度，通過硅膠層析純化該殘余物。合并適當(dāng)?shù)牟糠植⒄舭l(fā)至干，產(chǎn)生[(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯(7g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非對(duì)映異構(gòu)體的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.3(2d,3H),1.75,(m,2H),2.2(m,2H),2.65(m,1H),2.9(m,1H),3.4(m,1H),3.65(2s,3H),3.7(m,1H),4.3(2q,1H),5.0(m,4H),5.7(m,1H),7.3(m,5H),7.4和7.5(bs,1H)。(ⅲ)(S)-2-(1-芐酯基-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸甲酯的合成。(CbZ-Ⅳ-OMe)
將四氧化鋨(1.5ml 4％的水溶液)加入含[(RS)-2-烯丙基-N-(芐酯基)]脯氨酰-(S)-丙氨酸甲酯(1.45g)的乙醇(30ml)和水(20ml)的混合物中。在氬氣下將該混合物攪拌10分鐘，然后分次加入高碘酸鈉(2.45g)。將該混合物攪拌2小時(shí)，然后加入水(100ml)，用乙酸乙酯(2×70ml)萃取該混合物。干燥并蒸發(fā)合并的萃取液，產(chǎn)生1.4g膠狀物。將該膠狀物溶于二氯甲烷(30ml)和三乙基硅烷(0.65g)中，然后滴加三氟乙酸(4g)。將該混合物攪拌3小時(shí)，蒸發(fā)，將該殘余物在碳酸氫鈉溶液和乙醚之間分配。分離乙醚萃取液，將其蒸發(fā)至干。采用己烷中25％乙酸乙酯增至100％乙酸乙酯的梯度，通過硅膠層析純化該殘余物。合并適當(dāng)?shù)牟糠植⒄舭l(fā)至干，產(chǎn)生(S)-2-(1-芐酯基-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸甲酯(0.8g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非對(duì)映異構(gòu)體的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.35(2d,3H),1.95(m,6H),3.1-3.5(m,4H),3.6和3.65(2s,3H),4.5和4.65(2q,1H),5.05(m,2H),7.25(m,5H)。(ⅳ)(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(H-Ⅳ-OH)的合成
將碳酸鉀(2.5g)加入含(S)-2-(1-芐酯基-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基)丙酸甲酯(3.3g)的甲醇(40ml)和水(40ml)的混合物中，將該混合物于周圍溫度下攪拌10小時(shí)。用濃鹽酸將pH調(diào)至～5，將該混合物蒸發(fā)至干。將該殘余物溶于水(40ml)中，用濃鹽酸將pH調(diào)至3。然后用二氯甲烷(2×50ml)萃取該混合物。將合并的萃取液干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)，產(chǎn)生泡沫物(2.8g)。將該泡沫物溶于甲醇(20ml)中，加入環(huán)己烯(0.7g)，然后加入10％Pd/C(0.5g)。該混合物回流2小時(shí)，冷卻，過濾，將濾液蒸發(fā)，產(chǎn)生作為泡沫物的(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(1.9g)；NMR(d6-DMSO)由于非對(duì)映異構(gòu)體的混合物使得峰有某些加倍，1.25和1.3(2s,3H),1.8(m,4H),2.0(m,2H),3.0(m,2H),3.3(m,2H),4.5(m,1H)。(ⅴ)(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(Fmoc-Ⅳ-OH)的合成
將過量的固體碳酸氫鈉加入含(S)-2-(6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(0.42g)的水(2ml)中，然后加入含9-芴基甲基琥珀酰亞胺基碳酸酯(0.7g)的丙酮(3ml)。將該混合物攪拌18小時(shí)。然后將該混合物加入水(10ml)中，用乙醚(10ml)萃取，并分離水層。(棄去乙醚萃取液)。用濃鹽酸將水層的pH調(diào)至～3，然后用二氯甲烷(2×10ml)將其萃取。分離合并的萃取液，干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)，產(chǎn)生作為白色泡沫物的(S)-2-[1-(9-芴基甲酯基)-6-氧代-1,7-二氮雜螺[4.4]壬-7-基]丙酸(0.62g)；NMR(d6-DMSO(373K))由于非對(duì)映異構(gòu)體的混合物使得峰有某些加倍，1.3(2d,3H),1.6-2.0(m,6H),3.05(m,1H),3.2-3.45(m,3H),4.2-4.4(m,1H),4.5(m,1H),6.2(s,2H),7.35(m,4H),7.8(m,4H)。(2)對(duì)于含式Ⅴa基團(tuán)的化合物而言，可以如下獲得(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸(Fmoc-Ⅴa-OH)(ⅰ)將(3S)-3-氨基-ε-己內(nèi)酰胺(25g)和三乙胺(19.7g)溶于THF(200ml)中，并冷卻至5℃。在30分鐘內(nèi)滴加含氯甲酸芐酯(33g)的THF(50ml)。將該反應(yīng)混合物于周圍溫度下攪拌18小時(shí)，然后倒入水(500ml)中。該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。將合并的萃取液干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。用乙醚(40ml)研磨該殘余物，將其過濾，產(chǎn)生作為白色固體的20g的(S)-3-芐酯基氨基-ε-己內(nèi)酰胺；NMR(d6-DMSO):1.1-2(m,6H),2.9-3.2(m,2H),4.1-4.25(m,1H),5.0(s,2H),7.25-7.4(m,5H),7.75(t,1H)。(ⅱ)在氬氣流下，將氫化鈉(2g)在DMF(100ml)中的混合物冷卻至0℃。在20分鐘內(nèi)分次加入(3S)-3-芐酯基氨基-ε-己內(nèi)酰胺(10g)，其加入速率為使該反應(yīng)溫度保持低于5℃。于0℃繼續(xù)攪拌40分鐘，然后在10分鐘內(nèi)滴加溴乙酸叔丁酯(8.2g)。將該反應(yīng)混合物于0℃攪拌1小時(shí)，于周圍溫度下再攪拌18小時(shí)。將該反應(yīng)混合物倒入水(600ml)中，用乙酸乙酯(6×75ml)萃取。合并的萃取液用水(3×100ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。通過硅膠MPLC，用20％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫，純化該殘余物，產(chǎn)生作為透明油的(3S)-3-芐酯基氨基-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(15g)；NMR(d6-DMSO):1.4(s,9H),1.5-1.9(m,6H),3.5-3.65(m,1H),3.9-4.15(m,2H),4.4(m,1H),5.0(s,2H),7.1(d,1H),7.35(m,5H)；質(zhì)譜，m/e(ES+)377(MH+)。(ⅲ)將(3S)-3-芐酯基氨基-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(15g)溶于乙醇(150ml)中，用氬氣清洗。加入10％鈀碳(1.5g)，排空該燒瓶，由氣囊將其充滿氫氣。該反應(yīng)混合物于周圍溫度下攪拌4小時(shí)。然后用氬氣清洗該反應(yīng)混合物，并通過硅藻土過濾。蒸發(fā)該濾液，產(chǎn)生作為粘性油的(3S)-3-氨基-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(7.7g)；NMR(CDCl3):1.45(s,9H),1.55-2.05(m,6H),3.2-3.3(d,1H),3.55-3.75(兩個(gè)重疊雙峰，2H),3.95-4.25(q,2H)；質(zhì)譜，m/e(ES+)243.2(MH+)。(ⅳ)將含(3S)-3-氨基-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(7g)的THF(50me)加入含碳酸鈉(3g)的水(30ml)溶液中。然后在30分鐘內(nèi)，邊攪拌邊滴加含N-(9-芴基甲酯基氧基)琥珀酰亞胺(9.7g)的THF(100ml)的溶液中。于周圍溫度下將該反應(yīng)混合物再攪拌30分鐘。加入水(200ml)，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取該反應(yīng)混合物。將合并的萃取液用鹽水(100ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。通過硅膠MPLC，最初用二氯甲烷，然后逐漸增至15％乙酸乙酯/二氯甲烷進(jìn)行洗脫，來純化該殘余物，產(chǎn)生作為透明油的(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(10.9g)；NMR(d6-DMSO):1.45(s,9H),1.5-2.15(m,6H),3.1-3.25(m,1H),3.6-3.75(m,1H),4.0-4.5(m,5H),6.25(d,1H),7.25-7.45(m,4H),7.6(d,2H),7.75(d,2H)；質(zhì)譜，m/e(ES+)465.2(MH+)。(ⅴ)將(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸叔丁酯(10.5g)溶于二氯甲烷(30ml)中，加入三氟乙酸(20ml)。將該反應(yīng)混合物于周圍溫度下攪拌18小時(shí)。加入二氯甲烷(100ml)用水(4×100ml)洗滌該反應(yīng)混合物，將其干燥(硫酸鎂)并蒸發(fā)。通過硅膠MPLC，用25％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫，然后用乙酸乙酯洗脫純化殘留物，產(chǎn)生油。用異己烷研磨，產(chǎn)生白色泡沫物，將其過濾并于60℃真空干燥，產(chǎn)生(3S)-3-(9-芴基甲酯基氨基)-2-氧代全氫化吖庚因-1-乙酸(5.5g)；NMR(d6-DMSO):1.4-1.95(m,1H),3.15-3.4(m,1H),3.55-3.7(m,1H),3.9-4.2(m,2H),4,25-4.45(m,2H),7.15(d,1H),7.25-7.45(m,4H),7.75(m,2H),7,85(d,2H)；質(zhì)譜，m/e(ES-)407.1(M-H-)。
化學(xué)式P-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q 1
Ⅱ
Ⅲ
Ⅲa
Ⅳ
Ⅳa
Ⅴ
Ⅴa
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名ZENECA LIMITED(B)街道15 STANHOPE GATE(C)城市倫敦(E)國家英國(F)郵編(ZIP):W1Y 6LN(G)電話0171304 5000(H)傳真0171304 5151(I)電傳0171834 2042(ⅱ)發(fā)明名稱肽衍生物(ⅲ)序列數(shù)8(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朑B 9611881.5(B)提交日期1996年6月7日(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)
(A)申請(qǐng)?zhí)朑B 9622890.3(B)提交日期1996年11月2日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊?；?Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置8(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:
Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊酰基-[N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置8
(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:
Xaa Ala Ala Lys Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊?；?Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”
/注釋=“(N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置6(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙?；鵠-Ala-4-氨苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3:
Xaa Arg Ala Xaa Thr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1
(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“(N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠)-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置8(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“Ala-哌啶-4-甲酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4:
Xaa Ala Ala Xaa Val Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊?；?Arg”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙?；鵠-Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置5(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[N4,N4-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)]-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置6(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”
/注釋=“Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:5:
Xaa Ala Ala Xaa Xaa Xaa1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊?；?Arg”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“(N4,N4-雙[N,N-雙(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基)氨基甲酰基甲基])-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置6(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙?；鵠-Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6:
Xaa Ala Ala Xaa Thr Xaa1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”
/注釋=“5-苯基戊酰基-Ala”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置4(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“(N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠)-Asn”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置8(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“Gly-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7:
Xaa Ala Ala Xaa Thr Pro Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特征(A)長度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置1(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“5-苯基戊酰基-(N4,N4-雙[N,N-雙(2-甲氧基乙基)氨基甲?；谆鵠)-Gln”(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位置6(D)其它信息/產(chǎn)物=“其它”/注釋=“[(S)-2-((R)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基)丙?；鵠-Ala-4-氨基苯基乙酰胺”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8:
Xaa Arg Ala His Val Xaa1 權(quán)利要求
1．式IP-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Q的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中P為疏水殘基；AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1、AA4和AA7的1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)選自式Ⅱ的L-氨基酸殘基，
其中n為1、2、3或4的整數(shù)；X為-NH-CO-、-CO-或-O.CO-；R1和R2選自(A)、(B)和(C)，其中(A)為式-(CH2)a-CO-N(R3)(R4)的基團(tuán)，其中a為1或2的整數(shù)，R3和R4獨(dú)立地選自-[(CH2)bO]m-Ra的基團(tuán)，其中Ra為甲基或乙基，而m為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)m為1時(shí)，b為2或3，而當(dāng)m為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)bO-單位的b值獨(dú)立地選自2和3；(B)為式-(CH2)c-O(CH2)d-CO-N(R5)(R6)的基團(tuán)，其中c為2或3的整數(shù)，d為1、2或3的整數(shù)，而R5和R6獨(dú)立地選自基團(tuán)-[(CH2)eO]p-Rb，其中Rb為甲基或乙基，p為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)p為1時(shí)，e為2或3，而當(dāng)p為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)eO-單位中的e值獨(dú)立地選自2和3；以及(C)為式-[(CH2)f-O]g-R7的基團(tuán)，其中R7為甲基或乙基，而g為1、2、3、4或5的整數(shù)；當(dāng)g為1時(shí)，f為2或3，而當(dāng)g為2、3、4或5時(shí)，每個(gè)-(CH2)fO-單位中的f值獨(dú)立地選自2和3；或AA1、AA2、AA3、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA7的一個(gè)或兩個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，并且AA4和AA5一起形成式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基團(tuán)，
Ⅲ
Ⅲa
Ⅳ
Ⅳa
Ⅴ
Ⅴa其中Ra、Rb和Rz獨(dú)立地選自氫和(1-4C)烷基，而A為氧或亞甲基；或AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，其中AA1和AA4的一個(gè)或兩個(gè)選自以上定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，而AA6和AA7一起形成以上定義的式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa的基團(tuán)；而Q為OH、NH2、NRcRd，其中Rc選自(1-4C)烷基、2-氨甲?；h(huán)戊基、2-吡啶基甲基、4-氨甲?；h(huán)己基、4-氨甲?；h(huán)己基甲基、3-氨甲?；交?、4-氨甲?；交?-(氨甲?；谆?苯基、4-(羧甲基)苯基、2-嗎啉代乙基和式-A1-G1的基團(tuán)，其中A1為(3-7C)亞烷基或A1選自(1)式-A2-B2-的基團(tuán)，其中A2為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基，而B2為(1-4C)亞烷基，或A2為亞甲基，而B2為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基；以及(2)式-A3-B3-C3的基團(tuán)，其中A3為亞甲基，B3為對(duì)亞苯基或1,4-亞環(huán)己基，而C3為(1-3C)亞烷基；以及G1為式-N=C[N(Rp)2]2的基團(tuán)，其中每個(gè)Rp獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基和丙基；而Rd為氫或(1-4C)烷基；或Q為1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-1-哌嗪基、4-脒基-1-哌嗪基、1-哌啶基或4-取代的-1-哌啶基，其中4-取代基選自羧基、氨甲?；?、N-(2-氨基乙基)氨甲?；蚇-(4-氨基丁基)氨甲?；换騋為1-6個(gè)氨基酸殘基或其酰胺的序列。
2．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為式P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-AA6-AA7-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5、AA6、AA7和AA8為L-氨基酸殘基，P和Q具有權(quán)利要求1中定義的任一含義，Ⅱ?yàn)闄?quán)利要求1中定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基。
3．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為式P-AA1-AA2-AA3-Ⅲa-AA5-Ⅱ-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，P和Q具有權(quán)利要求1中定義的任一含義，而Ⅱ?yàn)闄?quán)利要求1中定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，Ⅲa為權(quán)利要求1中定義的式Ⅲa的基團(tuán)。
4．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為式P-AA1-AA2-AA3-Ⅱ-AA5-Ⅲa-AA8-Q的肽衍生物，其中AA1、AA2、AA3、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，P和Q具有權(quán)利要求1中定義的任一含義，Ⅱ?yàn)闄?quán)利要求1中定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，Ⅲa為權(quán)利要求1中定義的式Ⅲa的基團(tuán)。
5．權(quán)利要求中1要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為式P-Ⅱ-AA2-AA3-AA4-AA5-Ⅲa-AA8-Q的肽衍生物，其中AA2、AA3、AA4、AA5和AA8為L-氨基酸殘基，P和Q具有權(quán)利要求1中定義的任一含義，Ⅱ?yàn)闄?quán)利要求1中定義的式Ⅱ的L-氨基酸殘基，Ⅲa為權(quán)利要求1中定義的式Ⅲa的基團(tuán)。
6．權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中P為5-20個(gè)碳原子的脂族、芳族或混合脂族/芳族有機(jī)基團(tuán)，或?yàn)?-20個(gè)碳原子和選自氧、硫和氮的1、2或3個(gè)雜原子的雜芳族或混合脂族/雜芳族有機(jī)基團(tuán)。
7．權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，在式Ⅱ的L-氨基酸殘基中，n=1或2,X=羰基，以及R1和R2都為權(quán)利要求1中定義的式(A)的相同基團(tuán)或都為權(quán)利要求1中定義的式(C)的相同基團(tuán)。
8．權(quán)利要求7中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1和R2都為-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或都為-CH2CON(CH2CH2OCH3)2或都為-CH2CON[(CH2CH2O)3CH3]2。
9．任一先前權(quán)利要求中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中AA1-AA8當(dāng)存在時(shí)選自以下氨基酸殘基AA1選自Ala、Ile、Tyr、Val、Glu、Lys、Arg、Gly、Gap、GapMe4和3,3,3-三氟丙氨酸；AA2選自Ala、Lys、Glu、Sar、Val、Arg、Gly、Pro、Ile、Tic、3,3,3-三氟丙氨酸和N6-二乙基Lys；AA3選自Ala、His、Gln、Val、Thr、Glu、Gly、Asp、Asn和N3-二乙基Dap；AA4選自Ala、Lys、Asn、Arg、Thr、Glu、Sar、Gly、Pro、His和N6-二乙基Lys；AA5選自Thr、Val、Ala、Gly、Dap、Dab、Pro、Hyp、Asn、Ser和N3-二乙基Dap；AA6選自Gly、Leu、Lys、Ala、Pro、Glu、Sar、His和Dap；AA7選自Pro、Ala、Lys、Arg、Glu、Sar、Gly、Oic和Dic；和AA8選自Ala、Gly、Dap、氮雜丙氨酸和氮雜甘氨酸。
10．任一先前權(quán)利要求中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Q選自4-氨基甲酰基-1-哌啶基和4-(氨基甲?；谆?苯胺基。
11．任一先前權(quán)利要求中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中疏水基團(tuán)P為5-苯基戊?；?br> 12．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為下式化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中Phv代表5-苯基戊?；?。
13．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，它為下式化合物合或其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中Phv代表5-苯基戊酰基。
14．藥用組合物，它包含權(quán)利要求1-13的任一項(xiàng)中要求保護(hù)的式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
15．制備權(quán)利要求1中要求保護(hù)的肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽的方法，包括以適當(dāng)?shù)捻樞蜻B續(xù)偶聯(lián)適當(dāng)保護(hù)的氨基酸或者兩個(gè)或多個(gè)適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的序列、適當(dāng)保護(hù)的式H-Ⅱ-OH、H-Ⅲ-OH、H-Ⅲa-OH、H-Ⅳ-OH、H-Ⅳa-OH、H-Ⅴ-OH或H-Ⅴa-OH的基團(tuán)以及任選的適當(dāng)保護(hù)的式H-Q基團(tuán)，然后可任選地進(jìn)行N末端氨基的官能團(tuán)修飾，以引入疏水基團(tuán)P，并除去任何殘留的保護(hù)基團(tuán)和任何固相載體。
16．治療MHCⅡ類依賴性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病或炎癥性疾病的方法，它包括給與需要這種治療的溫血?jiǎng)游镉行Я康臋?quán)利要求1中要求保護(hù)的式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
17．權(quán)利要求16中要求保護(hù)的方法，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或膽囊性纖維變性。
18．權(quán)利要求1中要求保護(hù)的式Ⅰ肽衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療MHCⅡ類依賴性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病或炎癥性疾病的新的藥物中的用途。
19．保護(hù)的或未保護(hù)的式Ⅱ氨基酸或其鹽，其中n、X、R1和R2具有權(quán)利要求1中定義的任何含義。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥學(xué)上有用的式(Ⅰ)P－AA
文檔編號(hào)A61K31/00GK1221424SQ9719521
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者R·科頓, P·N·愛德華茲, R·W·A·魯克, K·奧爾德哈姆 申請(qǐng)人:曾尼卡有限公司