專利名稱：10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物及其制法與組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為細(xì)胞毒類藥物的一種植物生物堿，尤其是一種喜樹堿類化合物，更具體的說，本發(fā)明涉及10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其制備方法，含有它們的藥物組合物及其作為藥物，特別是作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1966年美國科學(xué)家Wall等首次從中國的喜樹中分離到喜樹堿后，因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著的抗腫瘤活性，引起人們很大的興趣。但喜樹堿由于水溶性差而不能進入臨床研究。在70年代，中國學(xué)者將內(nèi)酯環(huán)用氫氧化鈉打開，制備成水溶性的鈉鹽進行臨床研究，結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重的骨髓抑制，嘔吐，腹瀉和嚴(yán)重的出血性膀胱炎等副作用，而且開環(huán)形式活性大大降低，使臨床研究終止。1985年，JohnHopkins大學(xué)的Hsiang等研究結(jié)果表明，喜樹堿是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的特異性抑制劑，而拓?fù)洚悩?gòu)酶I是細(xì)胞的一種核酶，與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)以及重組有關(guān)，其在細(xì)胞周期的任何階段都有表達，且已知腫瘤細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶I的含量比正常細(xì)胞中的含量高，因而這類抗腫瘤化合物具有一定的選擇性。并且拓?fù)洚悩?gòu)酶I在增殖期細(xì)胞及靜止期細(xì)胞中以相當(dāng)高濃度出現(xiàn)，在緩慢增殖及快速增殖的腫瘤細(xì)胞中水平相似，表明其對快速增殖的腫瘤和緩慢生長的腫瘤均有抗癌活性。這一重大發(fā)現(xiàn)為喜樹堿的重新評價打開大門。藥物學(xué)家以此為靶點，對喜樹堿進行了結(jié)構(gòu)改造，取得了大量的成績。例如10-羥基喜樹堿，從1977年在中國上市以來，被廣泛使用，對原發(fā)性肝癌、胃癌、頭頸部腺源性上皮癌、白血病、直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤均有療效。其結(jié)構(gòu)式如下所示
近年來，研究喜樹堿的文獻報道很多，例如美國專利US5,646,159 US4,604,463；US6,111,107；US6,350,756等。從喜樹堿出發(fā)，應(yīng)用Manich反應(yīng)在9位上引入胺甲基，具有較好的水溶性和抗腫瘤活性，其中10-羥基9-二甲胺基甲基喜樹堿(Topotecan)于1996年上市，用作卵巢癌病人的二線治療藥物，美國FDA又于1999年批準(zhǔn)其作為小細(xì)胞肺癌(SCLC)的二線治療藥物。在10-羥基喜樹堿的7位上引入乙基得到的化合物SN-38，具有良好的抗腫瘤活性，其水溶性前體藥物伊利替康(Irinotecan)于1994年上市，用于結(jié)直腸癌的治療。另外，還有國內(nèi)的喜樹堿類化合物研究報道，例如中國專利200310108532公開的9-烷基10-羥基取代的喜樹堿類衍生物，中國專利200410052756公開的10-烷氧基喜樹堿衍生物等。盡管如此，仍需要發(fā)明療效高，毒性低，水溶性好的喜樹堿類化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通式(I)的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其具有良好的水溶性，較強的腫瘤細(xì)胞毒活性。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通式(I)的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物的制備方法。
本發(fā)明一方面涉及藥物組合物，其包括作為活性成份的通式(I)的化合物及其異構(gòu)體及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明再一方面涉及的是通式(I)化合物或含有它們的藥物組合物的抗腫瘤用途。
按照本發(fā)明，如通式(I)所示的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物
其特征在于其中A1、A2各自獨立地表示含取代的C1-C6直鏈烷基殘基，C3-C20支鏈烷基殘基或H，條件是兩者不能同時為H；A1、A2連接成環(huán)，包括芳香環(huán)、飽和、不飽和雜環(huán)基的殘基；其中B表示和A1、A2連接的含有1到9個有機羧酸或其羧酸鹽的功能基，其羧酸鹽包括鈉、鉀、鈣等堿金屬鹽或堿土金屬鹽；當(dāng)A1表示H時，連接A1的B無意義，A2表示含取代的芳香環(huán)基殘基，含取代的C5-C6環(huán)烷基殘基，含取代的選自N，O或S的單原子4-6元雜環(huán)基殘基，含取代的C3-C20支鏈烷基殘基，A2-B選自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1、2或3。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的是其中A1、A2各自獨立地表示含取代的C1-C4直鏈烷基殘基，含取代的C3-C10支鏈烷基殘基或H，條件是兩者不能同時為H；其中B表示和A1、A2連接的含有1到9個有機羧酸或其羧酸鹽的功能基，其羧酸鹽包括鈉、鉀、鈣等堿金屬鹽或堿土金屬鹽；當(dāng)A1表示H時，連接A1的B無意義，A2表示含取代的苯基或芐基殘基，含取代的C3-C10支鏈烷基殘基，A2-B選自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1，2或3。
本發(fā)明的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物的母體結(jié)構(gòu)可以是10-羥基喜樹堿，也可以是在10-羥基喜樹堿結(jié)構(gòu)式上，應(yīng)用本領(lǐng)域公知的技術(shù)而合成的7，9，11或20位上含有取代基的類似物。
根據(jù)本發(fā)明10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物可以異構(gòu)體的形式存在，而且通常所述的“本發(fā)明的化合物”或“本發(fā)明的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物”包括該化合物的異構(gòu)體。
本發(fā)明的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物可存在雙鍵的順反異構(gòu)體，不對稱中心具有S構(gòu)型或R構(gòu)型，本發(fā)明包括所有可能的立體異構(gòu)體，以及兩種或多種異構(gòu)體的混合物。如果存在順/反異構(gòu)體，本發(fā)明涉及順式形式和反式形式以及這些形式的混合物。如果需要單一異構(gòu)體，可根據(jù)常規(guī)方法分離或通過立體選擇合成制備。
根據(jù)本發(fā)明所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物優(yōu)選自天然的10-羥基喜樹堿化合物，其光學(xué)異構(gòu)體，或它們的羧酸鹽。最優(yōu)選自天然的10-羥基喜樹堿化合物，或它們的羧酸鹽。
本發(fā)明的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物的制備方法包括下列步驟首先制備相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，這些化合物的終端含有仲胺基團或伯胺基團，將該含有胺基的化合物與相應(yīng)的?；噭┓磻?yīng)，在有機堿催化下得到含有胺酰氯或異氰酸功能基的化合物；再用10-羥基喜樹堿或它的類似物和相應(yīng)的胺酰氯或異氰酸類化合物，通過縮合反應(yīng)制備10位取代基上含有機羧酸基團的喜樹堿化合物的羧酸酯；最后是所述的羧酸酯水解成相應(yīng)的羧酸化合物，；該羧酸化合物與堿反應(yīng)制成鹽。其特征在于合成反應(yīng)步驟包括下列試劑，催化劑及反應(yīng)條件首先制備相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，將含有胺基的化合物與相應(yīng)的酰化試劑反應(yīng)，?；噭楣鈿?COCI2)或雙光氣(Cl3COCO2CCl3)，催化劑為有機堿，包括三乙胺(Et3N)或吡啶，溶劑為乙醇或四氫呋喃(THF)；再用10-羥基喜樹堿或它的類似物和相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，通過縮合反應(yīng)制備相應(yīng)的羧酸酯，反應(yīng)溫度為0-60℃，反應(yīng)的溶劑為無水有機溶劑，包括二氯甲烷(CH2Cl2)、氯仿(CHCl3)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或四氫呋喃(THF)，反應(yīng)的催化劑為有機堿，包括三乙胺(Et3N)或吡啶；最后是10位取代基上含有機羧酸基團的喜樹堿化合物的羧酸酯水解成相應(yīng)的羧酸化合物，其取代基終端是叔丁基酯的水解，試劑選用甲酸，如果取代基終端是甲酯或乙酯的羧酸酯水解，采用等當(dāng)量的無機鹼，包括氫氧化鋰、氫氧化鉀或氫氧化鈉，反應(yīng)的溫度為0-60℃，優(yōu)選溫度20-30℃，時間為1-24小時，水解反應(yīng)溶劑是甲醇的鹼水溶液或1，4-二氧六環(huán)的鹼水溶液。
這些10位取代基上含有機羧酸基團的喜樹堿化合物的多羧酸化合物可以用通用的常規(guī)方法與鹼反應(yīng)制成鹽，優(yōu)選的鹼為氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鈉或碳酸氫鈉等。
制備本發(fā)明化合物的合成反應(yīng)一般是在常溫或室溫(10-30℃)條件下進行。其合成反應(yīng)通式如下(式中Base代表吡啶或三乙胺) 根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的本發(fā)明10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物還包括其藥效學(xué)上可接受的鹽、鹽的水合物、羧酸酯或前體藥物。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成分的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥，包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等，此外，還包括胸腔注射給藥，膀胱、腹腔等的灌注給藥以及經(jīng)動脈對腦、肝、腎、四肢、腸等部位的介入給藥等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型，例如片劑、膠囊劑、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、栓劑或凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑，也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
例如為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇等；粘合劑如淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素、甲基纖維素、紫膠、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、硬脂酸甘油脂、可可脂、氫化植物油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液狀石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊劑，將有效成分的本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠或軟膠囊中。也可將有效成分的本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，也可裝入硬膠囊中，或制成注射劑應(yīng)用。
例如將有效成分的本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液、乳劑、凍干粉針劑等，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、，如稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)等，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。本發(fā)明藥物成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍從0.1-1000mg/m2尤其是1-100mg/m2。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥，這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用化療、放療手段的給藥方案。
從體外抗腫瘤活性篩選來看，本發(fā)明的化合物表現(xiàn)良好的抗腫瘤活性?？勺鳛榭鼓[瘤藥物用于動物，優(yōu)選用于哺乳動物，特別是人。
具體實施例方式
下面的實施例用來進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例110-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸及其二鈉鹽的合成10-(羧酰胺)羥基喜樹堿N-雙醋酸的結(jié)構(gòu)式如下
10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸的合成路線如下 芐胺雙乙酸叔丁酯BnN(CH2CO2-tBu)2的合成將芐胺(8.4ml，0.077mol)和碳酸鉀(21.5g，0.156mol)溶解在120ml乙醇中，室溫下將溴代乙酸叔丁酯(30.0g，0.158mol)滴加入芐胺溶液中。將反應(yīng)液在室溫下攪拌，用硅膠薄層(TLC)層析觀察，直到反應(yīng)物芐胺消失為止。真空下除去乙醇，將油狀物用水和乙酸乙酯(EtOAc)萃取。酯層用水和飽和鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥。真空下除去EtOAc溶劑，其殘留物用硅膠柱層析純化得到BnN(CH2CO2-tBu)2(17.9g)，為無色油狀物，收率為69.2％，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝336.4。
胺基雙乙酸叔丁酯HN(CH2CO2-tBu)2的合成將BnN(CH2CO2-tBu)2(28.0g，83.5mmol)溶解在200ml甲醇中，在N2保護下加入鈀碳(Pd/C)(8.74g)和甲酸銨(26.5g，420mmol)。將該混合液體加熱回流12小時，過濾除去Pd/C，再將濾液的甲醇溶劑除去，其殘留固體用硅膠柱層析純化(石油謎Pet/EtOAc 2∶1)得到固體NH(CH2CO2-tBu)2(15.45g，75.1％)，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝246.4。
胺酰氯雙乙酸叔丁酯ClCON(CH2CO2-tBu)2的合成將以上中間體NH(CH2CO2-tBu)2(12.87g，52.46mmol)，Et3N(10.42mL)溶解在50mL THF中。冰水浴下，將其加入溶有Cl3COCO2CCl3(5.70g，19.24mmol)的THF(250mL)中。將該混合液在室溫下攪拌3h。真空下除去THF溶劑，得到粗品。將該粗品懸浮在EtOAc中，過濾除去固體，再將濾液的EtOAc溶劑除去，其殘留固體用硅膠柱層析純化(Pet/EtOAc 10∶1)得到無色固體ClCON(CH2CO2-tBu)2(11g，68.1％).RF0.31over 101Pet/EtOAc，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝330.3。
10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜樹堿的合成將10-羥基喜樹堿(0.311g，0.856mmol)和ClCON(CH2CO2-tBu)2(1.712mmol)溶解在21mL吡啶中，室溫下攪拌12小時。真空下除去吡啶溶劑。用CHCl3(100mL)萃取，用7％的NaHCO3溶液100ml和飽和鹽水洗滌CHCl3層，用無水硫酸鈉干燥。用硅膠柱層析純化(CHCl3/EtOAc1∶1)得到黃色固體10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜樹堿0.51g，收率93.8％。RF0.49(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1).低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝636.7。
10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸的合成將10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜樹堿(0.44g，0.6922mmol)溶解在8.0mL甲酸中，室溫下攪拌12小時。真空下除去甲酸溶劑，得到黃色固體。用EtOAc和CHCl3洗滌得到黃色固體10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸0.31g，收率85.6％。核磁共振氫譜1HNMR(DMSO-d6)δ0.89(3H，t，J＝7.2Hz)，1.87(2H，m)，4.12(2H，s)，4.28(2H，s)，5.30(2H，s)，5.43(2H，s)，6.54(1H，s)，7.34(1H，s)，7.58(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝2.8Hz)，7.88(1H，d，J＝2.8Hz)，8.20(1H，d，J＝9.2Hz)，8.70(1H，s)，12.99(2H，s)，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝524.3。
10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸二鈉的合成將10-(t-BuO2CCH2)2NCO2-喜樹堿(0.340g，0.6499mmol)溶解在1.0mLDMF中，然后定量加入52.0mg氫氧化鈉水溶液，冷凍真空干燥下除去DMF溶劑，得到淡黃色固體，用EtOAc洗滌得到水溶性固體10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙醋酸二鈉鹽0.340g，收率92.3％，LRMSM-2Na+1＝524.3。
實施例210-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙丙酸及其二鈉鹽的合成10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙丙酸結(jié)構(gòu)式如下
合成路線參見實施例1，合成方法相似。
芐胺雙丙酸叔丁酯BnN(CH2CH2CO2-tBu)2的合成將芐胺(5.46mL，0.05mol)和碳酸鉀(21.5g，0.156mol)溶解在100ml乙醇中，室溫下將溴代丙酸叔丁酯(15.38mL，0.105mol)滴加入芐胺溶液中。將反應(yīng)液加熱回流48小時，用TLC層析觀察，直到反應(yīng)物芐胺消失為止。真空下除去乙醇溶劑，將油狀物用水和乙酸乙酯萃取。酯層用水和飽和鹽水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥。真空下除去EtOAc溶劑，其殘留物用硅膠柱層析純化得到BnN(CH2CH2CO2-tBu)2(14g)，為無色油狀物，RF0.74(Pet/AcOEt5∶1)，收率為77％，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝364.1。
胺基雙丙酸叔丁酯NH(CH2CH2CO2-tBu)2的合成在N2下，將BnN(CH2CH2CO2-tBu)2(1.09g，3.0mmol)溶解在20ml甲醇中，在N2保護下加入Pd/C(0.32g)和甲酸銨(0.946g，15mmol)。將該混合液體加熱回流12小時，過濾除去固體Pd/C，再將濾液的甲醇溶劑除去，其殘留固體用硅膠柱層析純化(Pet/EtOAc 2∶1)得到固體HN(CH2CH2CO2-tBu)2(0.61g，74.4％)，RF0.29(Pet/EtOAc 1∶1)，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝274.0胺酰氯雙丙酸叔丁酯ClCON(CH2CH2CO2-tBu)2的合成冰水浴下，將NH(CH2CH2CO2-tBu)20.16g，0.5395mmol)，Et3N(0.29mL，2.10mmol)溶解在10mLTHF中。將其加入溶有Cl3COCO2CCl3(0.16g，0.5395mmol)的THF(10ml)中。將該混合液在室溫下攪拌3小時。真空下除去THF溶劑，得到ClCON(CH2CH2CO2-tBu)2粗品。直接進行下一步反應(yīng)。
10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜樹堿的合成將10-羥基喜樹堿(0.311g，0.856mmol)和ClCON(CH2CH2CO2Bu-t)2(1.712mmol)溶解在20mL吡啶中，室溫下攪拌12小時。真空下除去吡啶溶劑。用CHCl3(100mLX2)萃取，用7％的NaHCO3溶液和飽和鹽水洗滌CHCl3層，用無水硫酸鈉干燥。真空下除去CHCl3溶劑后得固體粗品，用硅膠柱層析純化(CHCl3/EtOAc1∶1)得到黃色固體10-(t-BuO2CCH2CH2)2NCO2-喜樹堿0.51g，收率93.8％。RF0.49(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1)，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝662.7。
10-(羧酰胺)羥基喜樹堿N-雙丙酸的合成將10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜樹堿(0.4g，0.60mmol)溶解在8.0mL甲酸中，室溫下攪拌12小時。真空下除去甲酸溶劑，得到黃色固體。用EtOAc和乙醚洗滌得黃色固體10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙丙酸0.216g，收率65.0％。低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝552.3.核磁共振氫譜1HNMR(DMSO-d6)δ0.89(3H，t，J＝7.2Hz)，1.87(2H，m)，4.12(2H，s)，2.57(2H，t，J＝6.8 Hz)，2.67(2H，t，J＝6.8Hz)，3.55(2H，t，J＝6.8Hz)，3.71(2H，t，J＝6.8Hz)，5.30(2H，s)，5.43(2H，s)，6.53(1H，s)，7.68(1H，dd，J1＝9.2Hz，J2＝2.8Hz)，7.91(1H，d，J＝2.8Hz)，8.18(1H，d，J＝9.6Hz)，8.32(1H，s)，8.65(1H，s)。
10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-雙丙酸二鈉鹽的合成將10-(t-BuO2C CH2CH2)2NCO2-喜樹堿(0.212g，0.3844mmol)溶解在1.0mL DMF中，然后定量加入30mg氫氧化鈉水溶液。冷凍真空干燥下除去DMF溶劑，得到淡黃色固體，用EtOAc洗滌得到水溶性固體10-(羧酰胺)羥基喜樹堿N-雙丙酸二鈉鹽0.21g，收率92％，低分辨質(zhì)譜LRMSM+1＝596.5。
實施例310-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]羥基喜樹堿的合成10-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]-羥基喜樹堿結(jié)構(gòu)式如下
下例反應(yīng)式的三羧酸叔丁酯衍生物中間體通過以下方法獲得。用硝基甲烷和叔丁基丙烯酸酯，通過MICHEAL加成得到硝基三羧酸叔丁酯衍生物。將該化合物50g(0.11mol)置于1000ml的圓底燒瓶中，加入400ml無水乙醇使其溶解，然后加入由30g鎳鋁合金制備得到的Raney Ni(0.26mol)。常溫常壓氫反應(yīng)。反應(yīng)物反應(yīng)完全后過濾除去Raney Ni，旋轉(zhuǎn)減壓蒸去乙醇溶劑，得到46.6g白色固體，胺基三羧酸叔丁酯衍生物化合物[1，5-雙叔丁氧基?；?3-[(2-叔丁氧基?；?乙基]3-氨基戊烷]。產(chǎn)率100％。Rf＝0.806(乙酸乙酯)；Mp60～62℃。LRMSM+1＝416.1；M+鈉＝438.3。
用實施例1描述的胺酰氯制備法得到以下異氰酸三羧酸叔丁酯衍生物(MW＝441)，沒有純化的粗品用于下一步和10-羥基喜樹堿的偶合反應(yīng)(反應(yīng)式中Phosgen為光氣)。
將以上異氰酸三羧酸叔丁酯衍生物(1.5g，3.2mmol)和10-羥基喜樹堿(0.364g，1.0mmol)，置于吡啶(81mL)中。室溫攪拌24小時。減壓下除去吡啶溶劑。濃縮物用CH2Cl2(200mL)和水萃取，再用NaHCO3(7％，100mL)和飽合鹽水洗有機相，用無水Na2SO4干燥有機層。旋轉(zhuǎn)減壓蒸去CH2Cl2溶劑得到粗品。硅膠柱層析(CHCl3/EtOAc1∶1)后得到淺黃色固體10-羥基喜樹堿三羧酸叔丁酯衍生物(0.51g，60％)RF0.3(CHCl3∶EA∶EtOH 1∶1∶0.1)。
將以上的10-羥基喜樹堿三羧酸叔丁酯衍生物(0.51g)溶解在甲酸(10mL)中，室溫攪拌12小時，旋轉(zhuǎn)減壓除去甲酸溶劑，得到黃色固體。將該固體在乙腈中重結(jié)晶得10-[N-(4，4’-二丙酸)丁酸)羧酰胺]-羥基喜樹堿(0.3g)，低分辨質(zhì)譜(LRMS)M-1＝636。
實施例410-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-九羧酸的合成10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-九羧酸結(jié)構(gòu)式如下 取代基部分的制備
將實施例3中[1，5-雙叔丁氧基?；?3-[(2-叔丁氧基?；?乙基]3-氨基戊烷]50g(0.12mol)與化合物三取代丙酸硝基甲烷10g(0.036mol)(見上圖)，置于一個1000ml的圓底燒瓶中，加入350mLDMF，待化合物溶解后，再加入1-羥基苯并三唑(HOBt)17.9g(0.13mol)。然后取1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)27.3g(0.13mol)置于一個100ml的燒杯中，加入50mLDMF使其溶解，將其滴加入反應(yīng)瓶中，室溫攪拌反應(yīng)48h，過濾除去固體，向反應(yīng)液中加入400mL EtOAc，用水(100×4mL)洗，無水硫酸鈉干燥有機層。減壓旋轉(zhuǎn)蒸去DMF和EtOAc等溶劑，將所得殘留物用柱層析分離得到反應(yīng)式(上圖)的硝基化合物(II)白色固體36g，產(chǎn)率為67.5％。Rf＝0.375(EtOAc∶己烷＝1∶2)；Mp 151～153℃；低分辨質(zhì)譜LRMSM+1 1470.4M+水＝1487.4。
以上化合物(II)28g(0.019mol)，置于一個1000ml的圓底燒瓶中，加入400mL無水乙醇，再加入由30g鎳鋁合金制備得到的RaneyNi(0.26mol)。常溫常壓下氫化反應(yīng)。反應(yīng)完全后過濾除去Raney Ni，旋轉(zhuǎn)減壓除去乙醇溶劑，得到白色固體化合物(III)27g。產(chǎn)率100％。Rf＝0.51(D∶M＝10∶1)；Mp＝180～181℃；LRMSM+1 1440.3。用實施例1描述的胺酰氯制備法得到異氰酸九羧酸叔丁酯衍生物(IV)，得到的沒有進一步純化的粗品(IV)低分辨質(zhì)譜LRMSM+1-1726直接用于下一步和10-羥基喜樹堿的偶合反應(yīng)。
將以上異氰酸九羧酸叔丁酯衍生物(IV)(15g)和10-羥基喜樹堿(0.364g，1.0mmol)，置于吡啶(150mL)中。室溫攪拌74小時。減壓下除去吡啶溶劑。濃縮物用CH2Cl2(500mL)和水萃取，再用NaHCO37％，100mL)和飽和鹽水洗有機相，用無水硫酸鈉干燥有機層。旋轉(zhuǎn)減壓除去CH2Cl2溶劑，得到粗品，將該粗品經(jīng)硅膠柱層析(CHCl3/EtOAc1∶1)后得到白色固體10-羥基喜樹堿九羧酸叔丁酯衍生物(0.7g)。
將以上的10-羥基喜樹堿九羧酸叔丁酯衍生物(0.7g)溶解在甲酸(10mL)，室溫攪拌74小時，旋轉(zhuǎn)減壓除去甲酸溶劑，得到10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-九羧酸產(chǎn)品(0.1g)，低分辨質(zhì)譜(LRMS)M-1＝1324。
實施例510-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸的合成10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸結(jié)構(gòu)式如下 合成方法在冰浴條件下，將Cl3COCO2CCl3(0.15g，0.5mmol)和三乙胺(0.3mL)置于含10mL THF的圓底燒瓶中，緩慢加入1，3-(5-胺基)苯二甲酸(0.135g，1.5mmol)。反應(yīng)液體在攪拌下經(jīng)過2小時升到室溫。旋轉(zhuǎn)減壓除去THF溶劑，得到的粗品異氰酸化合物(0.2g)直接用于下一步和10-羥基喜樹堿的反應(yīng)。
將以上的異氰酸(0.2g)溶解于DMF(5mL)再將10-羥基喜樹堿(0.15g)溶解于DMF(10mL)中。在0℃下將前者加入后者之中，室溫攪拌74小時.減壓下除去DMF溶劑.濃縮物用CH2Cl2(50mL)和水萃取，再用水和飽和鹽水洗有機相，用無水硫酸鈉干燥有機層。旋轉(zhuǎn)減壓除去CH2Cl2溶劑，得到粗品10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸叔丁酯衍生物。將該粗品經(jīng)硅膠柱層析(CHCl3/EtOAc 1∶1)純化后得到白色固體10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸叔丁酯(0.07g)，低分辨質(zhì)譜(LRMS)M+1＝684。
將以上10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸叔丁酯(0.07g)溶解在甲酸(10mL)中，室溫攪拌24小時，旋轉(zhuǎn)減壓除去甲酸溶劑，將固體在乙醚中進行重結(jié)晶得到10-(羧酰胺)羥基喜樹堿-N-5-苯間二甲酸(0.02g)，低分辨質(zhì)譜(LRMS)M-1＝570。
藥理實驗樣品制備10-羥基喜樹堿(HCPT)加幾滴二甲基亞砜(DMSO)然后用蒸餾水溶解得供試樣品，其他樣品用蒸餾水溶解供實驗用。
實驗方法六種人體腫瘤細(xì)胞(SGC-7901，BEL-7404，BEL-7402，Bcap-37，HL-60和K562)，一種老鼠腫瘤細(xì)胞P388，分別懸浮于RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中，提供以10％牛血清，在溫度37℃，含5％CO2空氣環(huán)境下培養(yǎng)。每種腫瘤細(xì)胞濃度為(1-5)×108/L，不同濃度的10-羥基喜樹堿和供試的實施例化合物與腫瘤細(xì)胞作用3-5d；HL-60作用12h；P388作用48h。采用MTT和臺盼藍(lán)排染法測定。體外細(xì)胞毒性實驗測定結(jié)果見表1表1。10-羥基喜樹堿及實施例化合物對不同腫瘤細(xì)胞作用比較

BEL-7402和BEL-7404人惡性肝腫瘤細(xì)胞株；SGC-7901人胃癌細(xì)胞株；Bcap-37人乳腺癌細(xì)胞株；HL-60和K562人白血病癌細(xì)胞株；P338鼠白血病癌細(xì)胞株。
實驗結(jié)果表明實施例1，2，5三個化合物都呈現(xiàn)出類似于10-羥基喜樹堿的腫瘤細(xì)胞毒性。實施例1化合物的抑制腫瘤細(xì)胞的效果最好，也好于10-羥基喜樹堿。
權(quán)利要求
1.一種如通式(I)所示的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物 其特征在于其中A1、A2各自獨立地表示含取代的C1-C6直鏈烷基殘基，C3-C20支鏈烷基殘基或H，條件是兩者不能同時為H，A1、A2連接成環(huán)，包括芳香環(huán)、飽和、不飽和雜環(huán)基的殘基，其中B表示和A1、A2連接的含有1到9個有機羧酸或其羧酸鹽的功能基，當(dāng)A1表示H時，連接A1的B無意義，A2表示含取代的芳香環(huán)基的殘基，含取代的C5-C6環(huán)烷基殘基，含取代的選自N，O或S的單原子4-6元雜環(huán)基殘基，含取代的C3-C20支鏈烷基殘基，A2-B選自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1、2或3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其特征在于其中A1、A2各自獨立地表示含取代的C1-C4直鏈烷基殘基，含取代的C3-C10支鏈烷基殘基或H，條件是兩者不能同時為H，其中B表示和A1、A2連接的含有1到9個有機羧酸或其羧酸鹽的功能基，當(dāng)A1表示H時，連接A1的B無意義，A2表示含取代的苯基或芐基殘基，含取代的C3-C10支鏈烷基殘基，A2-B選自-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COOH]a}a，-C{(CH2)a-CONH-C[(CH2)a-COO-]a}a，其中a＝1，2或3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其特征在于所述化合物選自天然的10-羥基喜樹堿化合物，其光學(xué)異構(gòu)體，或它們的羧酸鹽。
4.制備如權(quán)利要求1或2所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物的方法，首先制備相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，這些化合物的終端含有仲胺基團或伯胺基團，將該含有胺基的化合物與相應(yīng)的?；噭┓磻?yīng)，在有機堿催化下得到含有胺酰氯或異氰酸功能基的化合物，再用10-羥基喜樹堿或它的類似物和相應(yīng)的胺酰氯或異氰酸類化合物，通過縮合反應(yīng)而制備10位取代基上含有機羧酸基團的喜樹堿化合物的羧酸酯，最后是所述的羧酸酯水解成相應(yīng)的羧酸化合物，該羧酸化合物與堿反應(yīng)制成鹽，其特征在于合成反應(yīng)步驟中包括下列試劑，催化劑及反應(yīng)條件首先制備相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，將含有胺基的化合物與相應(yīng)的酰化試劑反應(yīng)，酰化試劑為光氣或雙光氣，催化劑為有機堿，包括三乙胺或吡啶，溶劑為四氫呋喃或乙醇，再用10-羥基喜樹堿或它的類似物和相應(yīng)的含兩個或兩個以上有機羧酸基團的胺酰氯或異氰酸類化合物，通過縮合反應(yīng)制備相應(yīng)的羧酸酯，縮合反應(yīng)溫度為0-60℃，反應(yīng)的溶劑為無水有機溶劑，包括二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺或四氫呋喃，反應(yīng)的催化劑為有機堿，包括三乙胺或吡啶，最后是10位取代基上含有機羧酸基團的喜樹堿化合物的羧酸酯水解成相應(yīng)的羧酸化合物，其取代基終端是叔丁基酯的水解，試劑選用甲酸，如果取代基終端是甲酯或乙酯的羧酸酯水解，采用等當(dāng)量的無機鹼，包括氫氧化鋰、氫氧化鉀或氫氧化鈉，反應(yīng)溫度為0-60℃，時間為1-24小時，水解反應(yīng)溶劑是甲醇的鹼水溶液或1，4-二氧六環(huán)的鹼水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其特征在于所述化合物包括其藥效學(xué)上可接受的鹽、鹽的水合物、羧酸酯或前體藥物。
6.一種藥物組合物，其特征在于含有有效量的權(quán)利要求1或2所述的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于所述的組合物可以是片劑、膠囊、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及如通式(I)所示的10位取代基上含多個有機羧酸基團的喜樹堿化合物，其特征在于A
文檔編號A61K9/00GK1982313SQ20051004797
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者李嘉和, 王穎實, 鄧小斌 申請人:深圳市天和醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司