專利名稱：一種阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物模型構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種阿爾茨海默病動(dòng)物模型的制備方 法，具體涉及一種鋁誘導(dǎo)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著人類壽命的增加，很多國(guó)家已經(jīng)或即將進(jìn)入老齡社會(huì)，老年性疾病已成為社 會(huì)關(guān)注和相關(guān)學(xué)科研究的熱點(diǎn)。老年性癡呆(Alzheimer' s disease, AD)是中樞神經(jīng)系 統(tǒng)的一種慢性、進(jìn)行性變性疾病，在老齡人口中與惡性腫瘤、心腦血管疾病并列為導(dǎo)致老年 人死亡的三大疾病，其發(fā)病率隨著人均壽命的延長(zhǎng)而逐年上升。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)65 歲以上老年人中AD的發(fā)病率高達(dá)3. 5%。自1906年德國(guó)神經(jīng)病理學(xué)家AloisAlzheimer發(fā)現(xiàn)AD以來(lái)，科學(xué)工作者進(jìn)行了近 一個(gè)世紀(jì)的潛心探究，從形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和臨床研究等方面著手，在AD的病理改變、發(fā) 病機(jī)制及治療等方面都做了大量研究工作。目前，關(guān)于AD的病因主要有下述幾種學(xué)說(shuō)1.遺傳學(xué)說(shuō)。AD和遺傳易感性有關(guān)，目前已知4個(gè)與AD相關(guān)的基因是位于21號(hào) 染色體的APP基因、14號(hào)染色體的早老素I(PSl)基因、1號(hào)染色體的早老素2 (PS2)基因和 位于19號(hào)染色體的ApoE ε 4(apolipoprotein E ε 4)等位基因。APP基因、早老素1、早老 素2基因突變被認(rèn)為是早發(fā)型家族性AD的遺傳因子；ApoE ε 4等位基因被認(rèn)為是散發(fā)型AD 的發(fā)病危險(xiǎn)因素。2.鋁中毒學(xué)說(shuō)。大量研究支持鋁是AD的病因，概括為以下五方面1)鋁是人體 的非必需金屬元素，在很低濃度下就可以有神經(jīng)毒性作用，可以引起類似AD的三個(gè)典型病 理改變鋁在腦內(nèi)的蓄積可以誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白沉積，是老年斑(senile plaque, SP)的 組成成分；AD患者腦部存在大量的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neuronfibrillary tangles, NFTs), 動(dòng)物腦室內(nèi)注射鋁也可以引起腦組織廣泛的神經(jīng)纖維細(xì)絲聚集；細(xì)胞凋亡是AD細(xì)胞死亡 的主要形式之一，鋁誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與AD的神經(jīng)細(xì)胞凋亡相似，都是導(dǎo)致抑凋亡基因 bcl-2和促凋亡基因bax比值改變，誘發(fā)凋亡而致細(xì)胞死亡。2)AD患者腦中的鋁含量與鋁 染毒動(dòng)物的腦鋁含量均有升高，并主要發(fā)生在皮質(zhì)和海馬等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的區(qū)域；在正 常人腦組織海馬區(qū)鋁的摩爾百分比是1. 6%，輕度AD患者為8. 1 %，重度AD患者為48. 4%。 人體的腦鋁含量有隨著年齡而增高的趨勢(shì)，并伴有腦鋁清除力的下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，年老 動(dòng)物對(duì)鋁的吸收率較高，對(duì)鋁的神經(jīng)毒性作用也更易感。3)雖然存在多種AD動(dòng)物模型，但 鋁致AD模型較好地模擬了 AD的某些行為和病理特征；無(wú)論經(jīng)何種方式給以鋁化物，均可見 到動(dòng)物認(rèn)知功能損傷，行為學(xué)及病理學(xué)上出現(xiàn)類似于AD的改變。4)在鋁暴露高的地區(qū)，AD 的發(fā)病率也較高。5)氧化損傷是AD發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，鋁在老年動(dòng)物促進(jìn)氧化損傷，體內(nèi)、體 外試驗(yàn)都證實(shí)鋁是氧化應(yīng)激的肯定促發(fā)因素。3.神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說(shuō)。AD患者神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)改變主要在海馬、基底前腦核及大腦新皮 質(zhì)區(qū)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為主要與乙酰膽堿能系統(tǒng)改變有關(guān)，其次為5-羥色氨能系統(tǒng)等。4.免疫反應(yīng)學(xué)說(shuō)?？赡苁仟?dú)立因素，也可能是與感染、遺傳和環(huán)境中毒相關(guān)的繼發(fā)因素，并提出與白細(xì)胞介素-1 (IL-I)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)等有關(guān)。5.慢病毒學(xué)說(shuō)。6.雌激素水平下降。臨床上AD患者主要表現(xiàn)為大腦認(rèn)知功能障礙，如健忘、記憶力和空間辨別能力減 退以及反應(yīng)遲鈍等。關(guān)于AD的病理特征，目前較為明確的是1)基底前腦核群內(nèi)乙酰膽堿 (Ach)能神經(jīng)元的變性和丟失；2)患者腦內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)；3)新皮質(zhì)和海馬結(jié)構(gòu)內(nèi) 出現(xiàn)大量的淀粉樣沉積，其數(shù)量多寡與AD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。近年已從淀粉樣沉積核心中 分離和鑒別出一種肽類物質(zhì)，稱為淀粉樣肽(β-ΑΡ或β/Α4蛋白)。β-ΑΡ是β-淀 粉樣前體蛋白(β-ΑΡΡ)的病理性裂解產(chǎn)物，正常情況下不表達(dá)，在正常老年人有極少量的 表達(dá)。4)腦內(nèi)形成淀粉樣斑塊。這一病理改變是Trojanowski等人的最新發(fā)現(xiàn)，其與神經(jīng) 原纖維纏結(jié)、淀粉樣沉積一起為AD病人的三大特征性病理改變。由于AD疾病嚴(yán)重危害老年人的健康，同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的財(cái)政負(fù)擔(dān)， 因而關(guān)于AD疾病的研究日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者均在探討制作 能較完全模擬人類AD臨床表現(xiàn)和病理生理特征的動(dòng)物模型，并通過(guò)這些模型研究有效的 干預(yù)方法。目前復(fù)制AD模型有多種方法，但每種建立AD模型的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。1.老年動(dòng)物模型?？沙霈F(xiàn)學(xué)習(xí)記憶減退，腦組織出現(xiàn)淀粉樣斑塊和NFT的病理改 變，這與AD病人是一致的。但存在以下缺點(diǎn)1)老年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病與AD的發(fā)病過(guò) 程和機(jī)制不完全一致，因此神經(jīng)化學(xué)方面的改變也是不同的；幻體質(zhì)差，易死亡，故不宜用 于周期長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)；3)對(duì)藥物的吸收代謝不佳；4)價(jià)格昂貴。2.用物理方法——斷開穹窿海馬傘通路法建立的AD毀損模型?？梢哉T導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物行為及神經(jīng)化學(xué)方面的缺損，造成動(dòng)物空間定向和記憶障礙及膽堿能神經(jīng)元的丟失，而 且制備周期短(約兩周)，但手術(shù)定位難以控制，很難避免手術(shù)區(qū)鄰近組織的受損。3.用神經(jīng)毒氨基酸損毀基底大細(xì)胞核(nucleus basalis magnocellularis,NBM) 法制備乙酰膽堿(Ach)損毀AD模型。可導(dǎo)致NBM的膽堿能神經(jīng)元變性和減少，繼而引進(jìn)相 應(yīng)大腦新皮質(zhì)區(qū)的膽堿能纖維減少，細(xì)胞變性與死亡，膽堿能的標(biāo)志酶ChAT和AChE含量下 降，學(xué)習(xí)記憶行為減退。但有以下幾個(gè)缺陷1)無(wú)神經(jīng)炎斑及神經(jīng)纖維纏結(jié)的組織病理學(xué) 改變；幻神經(jīng)毒氨基酸對(duì)非膽堿能神經(jīng)元也有影響；幻ChAT的活性在海馬末受影響；4)據(jù) 報(bào)道神經(jīng)毒氨基酸對(duì)乙酰膽堿系統(tǒng)的損傷可逆轉(zhuǎn)力)業(yè)已證明AD病的基底核膽堿能神經(jīng) 元的喪失是逆行性引起的，即繼發(fā)于大腦皮層的病理變化。4.用 AF64A (Ethylcholine mustard aziridiniumion)制做的乙酰膽堿損毀 AD模 型。表現(xiàn)為膽堿能系統(tǒng)和記憶功能損害，但不影響非膽堿能神經(jīng)元，這點(diǎn)優(yōu)于興奮性神經(jīng)毒 氨基酸。然而用此方法也不出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的組織病理學(xué)改變。5.用192IgG-Sap0rin行大鼠側(cè)腦室有前腦基底區(qū)注射制備免疫損毀AD模型。可 選擇性損害與基底前腦核有關(guān)的乙酰膽堿系統(tǒng)，如內(nèi)側(cè)隔區(qū)、斜角帶，同時(shí)出現(xiàn)記憶減退的 表現(xiàn)，但仍然不能出現(xiàn)AD所特有的其它組織病理學(xué)改變。6.喹啉酸在海馬CAI區(qū)直接注射制備乙酰膽堿損毀AD模型?？梢鸫笫罂臻g辨 別能力和學(xué)習(xí)記憶障礙。但是它能否導(dǎo)致其它組織病理學(xué)改變未見文獻(xiàn)報(bào)道。7.東莨菪堿注入小鼠、大鼠、猴等哺乳動(dòng)物的側(cè)腦室建立的乙酰膽堿損毀AD模型。主要是出現(xiàn)與AD—致的記憶、認(rèn)知功能障礙，有關(guān)AD特有的組織病理學(xué)改變是否發(fā)生 未見文獻(xiàn)報(bào)道。8.Αβ注射模型。將Αβ不同的片段Αβ 1-42或Αβ 1_40注入腦室或海馬等部位， 大鼠、小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能減退、膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)、SP等病理學(xué)特征。該模型基本模 擬了 AD學(xué)習(xí)記憶能力損害，海馬神經(jīng)元壞死或缺失，凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加。缺點(diǎn)是注射 Αβ本身對(duì)腦組織產(chǎn)生局灶損傷，而且存在Aβ局部聚集的問(wèn)題。9.鋁中毒模型。對(duì)大鼠、小鼠用口服、腦室注射、灌胃、腹腔注射等方法均可以建 立鋁中毒AD模型。鋁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒性損害，使神經(jīng)元變性或死亡，產(chǎn)生NFT病理性 改變，繼而表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)萎縮，腦重減輕；出現(xiàn)記憶、認(rèn)知功能障礙。鋁還能促進(jìn)淀粉樣蛋 白的形成和積累，在AD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。用鋁誘導(dǎo)建立的AD模型能較好模擬出 與AD有關(guān)的記憶損害和形態(tài)變化，但缺點(diǎn)是此種AD模型出現(xiàn)的NFT與AD病人略有差異， 再就是用鋁造模周期比較長(zhǎng)(口服約三個(gè)月)。10.轉(zhuǎn)墓因動(dòng)物模型。目前發(fā)現(xiàn)，與AD相關(guān)的基因有4個(gè)，即APP、ApoE ε 4、早老 素I(PSl)和早老素2 (PS2)，它們?cè)贏D的病因病理中起著重要作用。AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型目 前主要有APP轉(zhuǎn)基因模型、PSl轉(zhuǎn)基因模型、ApoE ε 4轉(zhuǎn)基因模型、Tau蛋白轉(zhuǎn)基因模型、雙 重和三重轉(zhuǎn)基因模型等。每種AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型都有自己獨(dú)特的病理特征，同時(shí)通過(guò)對(duì)動(dòng) 物模型的研究也可以給AD發(fā)病機(jī)制及神經(jīng)病理特征及治療的展望提供重要的理論依據(jù)。1)ΑΡΡ轉(zhuǎn)基因模型Dewachterder等PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立以血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF) 為引物，與人類APP小基因片段(含717位上的突變位點(diǎn)纈氨酸-苯丙氨酸)結(jié)合成PDAPP 基因，將此段基因以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生的小鼠攜帶突 變基因，較好地模擬了老年斑的病理學(xué)改變。Αβ沉積部位以海馬和皮層為主，其中以大片 段A β 1 42 (43)為多，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)元增多，突觸缺失，且老 年斑的密度隨鼠齡的增加而增多。Games等用Val 717Phe突變構(gòu)建了一個(gè)包含人類APP基 因全cDNA的雜交轉(zhuǎn)基因，該基因的APP表達(dá)水平比標(biāo)準(zhǔn)cDNA高的多。Deng等以血小板源 性生長(zhǎng)因子為引物，與人類帶有Val 717Phe突變的APP基因片斷結(jié)合成PDAPP基因，以顯 微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵中，移植到假孕雌鼠輸卵管內(nèi)，產(chǎn)生攜帶此突變基因的幼鼠即為 轉(zhuǎn)基因鼠，能夠高水平表達(dá)APP。運(yùn)用彌散張量成像DTT技術(shù)觀測(cè)到PDAPP鼠大腦灰質(zhì)和 白質(zhì)均有損害，且Αβ沉積量隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增多。Moran等報(bào)道，APP 751轉(zhuǎn)基因小鼠 (表達(dá)ΑΡΡ751)尤其在海馬可顯示早期AD樣Αβ沉積和神經(jīng)炎斑，且學(xué)習(xí)記憶能力明顯減 退。Hsiao等構(gòu)建的APP 695sw和APP 670/671轉(zhuǎn)基因小鼠APP表達(dá)水平升高3 5倍，并 表現(xiàn)為與年齡相關(guān)的腦內(nèi)Αβ沉積(主要分布在杏仁核、海馬和皮層)，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶減退。 這些轉(zhuǎn)基因小鼠的培育成功，對(duì)研究調(diào)節(jié)Αβ產(chǎn)生和沉積的因素有非常重要的作用。Jeong 等建APPV717I-CT100轉(zhuǎn)基因鼠模型并給與慢性免疫抑制處理，發(fā)現(xiàn)A β沉積增強(qiáng)，且加速 了學(xué)習(xí)和記憶功能的損傷。APPsw轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立應(yīng)用朊病毒啟動(dòng)子，含有2個(gè)突變基因的人類APP 基因(670位上賴氨酸-天冬氨酸；671位上蛋氨酸-亮氨酸)，將此片段基因以顯微注射 法導(dǎo)入小鼠受精卵中，植入假孕小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生的小鼠即攜帶突變基因，在此種小鼠模型中 A β的生成量提高了 8 10倍，小膠質(zhì)細(xì)胞在A β沉積部位活性明顯增加。Frackowiak等在thy-Ι增強(qiáng)子調(diào)控下，將大量表達(dá)Swedish序列突變的β-APP基因(API^sw)按上述方法 轉(zhuǎn)錄到小鼠體內(nèi)產(chǎn)生Tg 2576小鼠。此種小鼠腦血管平滑肌細(xì)胞所表達(dá)的β-APP大約是 生理水平的4倍，并包含了大量的Aβ 1 40和Αβ 1 42，形成細(xì)胞內(nèi)Aβ免疫反應(yīng)陽(yáng)性 顆粒。這種大量表達(dá)APP基因的轉(zhuǎn)基因鼠模型(PDAPP鼠)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞外硫黃素S陽(yáng) 性的A β沉積，突觸減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，膽堿能神經(jīng)末梢變異和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元退行性改 變。2) PS轉(zhuǎn)基因模型Masliah等將PDGF和人類PSl突變基因采用上述方法導(dǎo)入小鼠受精卵中，在新生 小鼠體內(nèi)可見Αβ生成增多(主要是Αβ 42)，但并無(wú)Αβ沉積。此種模型僅適用于抑 制Αβ產(chǎn)生方面的研究。Cataldo等利用血小板源性生長(zhǎng)因子β 2啟動(dòng)子促進(jìn)神經(jīng)元的表 達(dá)，構(gòu)建了幾種過(guò)度表達(dá)PSl的轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)現(xiàn)表達(dá)突變型PSl可選擇性地增加A β 42。制 作出伴有M146L或M146V的PSl基因突變轉(zhuǎn)基因模型(制作方法同前)。這種模型通過(guò)選 擇性增加Αβ 42/43的神經(jīng)毒性和破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定性，促進(jìn)神經(jīng)元變性，從而導(dǎo)致AD發(fā) 病。并發(fā)現(xiàn)PS1、PS2復(fù)合突變基因模型較其他轉(zhuǎn)基因模型加速了神經(jīng)元溶酶體系統(tǒng)的病 變。Flood等將人類PSl突變基因?qū)胄∈笫芫阎?，制作?FAD(familial early-onset AD)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)表達(dá)突變型PSl可選擇性地增加A β 42表達(dá)和A β沉積，不伴有 APP增加。3) ApoE ε 4轉(zhuǎn)基因模型已知ApoE ε 4能夠與神經(jīng)細(xì)胞外可溶性A β高親和力結(jié)合，促進(jìn)淀粉樣斑塊形成， 調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞骨架瓦解和NFT形成。一些研究者采用人類基因組 ApoE ε 4的不同等位基因，通過(guò)動(dòng)物自身啟動(dòng)子和3'增強(qiáng)子，將突變的ApoE ε 4基因通過(guò) 上述方法轉(zhuǎn)錄到小鼠體內(nèi)構(gòu)建完成ApoE ε 4轉(zhuǎn)基因鼠模型。子代小鼠中存在大量老年斑， 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性明顯降低。4)Tau蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型用人類Thy-I作為啟動(dòng)子，將帶有表達(dá)人類Tau蛋白的基因注射到受精卵中，植入 假孕的母鼠體內(nèi)，生產(chǎn)的小鼠帶有此基因段。轉(zhuǎn)基因小鼠Tau蛋白mRNA表達(dá)水平是內(nèi)源性 的5倍，且發(fā)現(xiàn)與AD相似部位存在有過(guò)度磷酸化Tau蛋白。盡管未發(fā)現(xiàn)NFT，但此種模型 仍適合AD治療藥物的篩選，并為有NFT形成的轉(zhuǎn)基因模型奠定基礎(chǔ)。Schindowski等用人 類Thy-L 2作為啟動(dòng)子，在其G272V、P301S兩個(gè)位置制成Tau蛋白突變基因，制成了新的 THY-Tau22轉(zhuǎn)基因小鼠。THY_Tau22轉(zhuǎn)基因小鼠不僅顯示了 AD相關(guān)Tau蛋白抗原決定族 (AT8、AT100、AT180、AT270、12E8、tau_pSer396、AP422)的 Tau 蛋白過(guò)度磷酸化、神經(jīng)纖維 纏結(jié)，還伴有明顯星形膠質(zhì)細(xì)胞的增多。THY-Tau22轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)海馬區(qū)的突觸轉(zhuǎn)運(yùn)功 能的缺失和行為、記憶的改變。該模型成功的展示了 Tau蛋白引起的病理特征和神經(jīng)纖維 纏結(jié)變性過(guò)程中的病理生理紊亂。5)雙重、多重轉(zhuǎn)基因模型與前述轉(zhuǎn)基因模型相比，雙重、多重轉(zhuǎn)基因鼠能更全面的表達(dá)出AD的病理特征和 臨床特征。為了探討APP與PS間的相互作用，Samura等用APP和PSl兩種突變基因制作 淀粉樣蛋白沉積的轉(zhuǎn)基因模型，發(fā)現(xiàn)突變型PSl對(duì)突變型APP轉(zhuǎn)基因鼠的淀粉樣蛋白β斑 塊引起的和Tau蛋白的聚集形成有增強(qiáng)作用，并且加速了 Tau蛋白引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)。Gordon等構(gòu)建了攜帶突變型APP、PSl轉(zhuǎn)基因的雙重轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)現(xiàn)突變型PSl對(duì)突變型 APP轉(zhuǎn)基因鼠的淀粉樣蛋白β斑塊形成有增強(qiáng)作用。Sadowski等也構(gòu)建了攜帶突變型ΑΡΡ、 PSl轉(zhuǎn)基因的雙重轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)現(xiàn)該模型能夠很好的模擬AD的早期記憶功能損傷臨床特征 和海馬糖代謝的減低、神經(jīng)元數(shù)目的減少病理生理機(jī)制的一致性。Dickey等用APP和PSl 兩種突變基因制作淀粉樣蛋白沉積的轉(zhuǎn)基因模型，可模擬AD早期記憶功能障礙，且在A β 沉積區(qū)記憶形成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)減少，但缺乏NFT的形成。Wirths等用APP和PSl兩 種突變基因轉(zhuǎn)基因鼠模型發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)不斷升高的Αβ可以觸發(fā)軸突病理改變——軸突腫脹和 髓鞘球樣變結(jié)構(gòu)形成，這種病理改變可以與Tau蛋白引起的病理改變無(wú)相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn) 也對(duì)典型的AD病理學(xué)，A β作為AD的首發(fā)觸發(fā)劑，提出了質(zhì)疑。Costa等通過(guò)使用APP和 PSl兩種突變基因轉(zhuǎn)基因鼠模型發(fā)現(xiàn)ApoE ε 4促進(jìn)淀粉樣蛋白β沉積的作用是促使了細(xì)絲 折疊樣Αβ的形成，不是無(wú)形的Αβ形成，所以阻止ApoE ε 4對(duì)Αβ沉積作用也可能是對(duì)AD 的一項(xiàng)有效的治療手段。Ribe等通過(guò)構(gòu)建了攜帶突變型APP/Tau轉(zhuǎn)基因的雙重轉(zhuǎn)基因鼠， 該模型發(fā)現(xiàn)邊緣區(qū)有選擇性的A β蛋白沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元的丟失。Lewis等 通過(guò)構(gòu)建了攜帶突變型APP/Tau轉(zhuǎn)基因的雙重轉(zhuǎn)基因鼠，該模型發(fā)現(xiàn)邊緣系統(tǒng)和嗅皮質(zhì)區(qū) 明顯出現(xiàn)NFT的病理改變。推測(cè)Αβ蛋白和Tau蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠病理過(guò)程中具有相互促進(jìn) 的作用?？傊?，轉(zhuǎn)基因AD鼠的腦病理變化與人類相似，可模擬AD的年齡依賴性老年斑的 形成、膠質(zhì)細(xì)胞增生和突觸減少等部分神經(jīng)病理特征，并表現(xiàn)出與AD臨床相似的行為學(xué)障 礙。轉(zhuǎn)基因模型可以為淀粉樣蛋白變性疾病和認(rèn)知功能障礙的AD病提供動(dòng)物模型，用于研 究AD的病因病理及抗AD藥篩選有不可替代的作用。攜帶h-APP基因不同片段的轉(zhuǎn)基因鼠 病變表現(xiàn)有很大差異，通過(guò)對(duì)比分析可闡明h-APP基因不同片段的生物學(xué)效應(yīng)和h-APP過(guò) 度表達(dá)與β /Α4沉積的關(guān)系，為AD的早期預(yù)防尋找有效途徑。培育轉(zhuǎn)基因鼠是一項(xiàng)艱苦而細(xì)致的工程，對(duì)資金、實(shí)驗(yàn)室條件、研究者理論水平、 實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)有較高的要求，實(shí)驗(yàn)前慎重考慮，周密設(shè)計(jì)，而且制作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室 不具備制作該模型的條件。AD是一種多基因疾病，盡管轉(zhuǎn)基因模型是AD動(dòng)物模型中的較理 想者，但轉(zhuǎn)基因模型大部分只模擬了 AD的某一方面病理特征，而不能全面模擬AD發(fā)病。因 此，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型尚有待進(jìn)一步全面深入研究和發(fā)展。11.復(fù)合式動(dòng)物模型。AD模型雖多，但只是模擬了該病的某些方面和特征。每種 建立AD模型的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，迄今為止，尚無(wú)一客觀、準(zhǔn)確全面地再現(xiàn)、模擬、復(fù)制出AD 主要病理、生化及行為等方面全部特征的理想AD模型。制約了治療AD的有效藥物的開發(fā) 和應(yīng)用，也影響了 AD基礎(chǔ)研究的深化，這種矛盾已顯得十分尖銳，現(xiàn)今已成為AD進(jìn)一步研 究的障礙。因此，有必要開展多學(xué)科、多層次綜合研究，繼續(xù)深入探索，尋找一種公認(rèn)的合理 的AD綜合復(fù)制模型或AD全面復(fù)制模型，復(fù)合式動(dòng)物模型較單一式動(dòng)物模型更能反映AD的 特征，有利于促進(jìn)AD病因?qū)W、病理學(xué)和治療學(xué)研究的快速發(fā)展。腹腔注射D-半乳糖是我國(guó)學(xué)者最先報(bào)道的，用D-半乳糖120mg/kg和亞硝酸鈉 90mg/kg腹腔聯(lián)合注射，1次/d，連續(xù)60d，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯增加，出現(xiàn)觸須脫 落及大腦皮層Αβ病理改變。有學(xué)者依據(jù)正交試驗(yàn)原理、聯(lián)用ΙΒΑ、Αβ及D-半乳糖，發(fā) 現(xiàn)其可致大鼠記憶障礙，海馬皮層錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Alzheimer細(xì)胞增多及出現(xiàn)衛(wèi) 星現(xiàn)象。有報(bào)道給鼠長(zhǎng)期高膽固醇飲食，其大腦皮層Αβ注射點(diǎn)膽堿能纖維比對(duì)照組減少49.62%。但最新報(bào)道表明，血漿膽固醇水平與表達(dá)APP/PS1基因的小鼠Αβ 42水平并不成 正相關(guān)。在其他動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上再予膽固醇飲食，也有可能成為一種比較理想的動(dòng)物模 型。采用腦立體定位注射技術(shù)向海馬注射緩激肽(BK)，海馬區(qū)特定位點(diǎn)磷酸化的Tau蛋白 顯色增強(qiáng)。還有學(xué)者以一種衰老模型為背景，添加各種干擾因素建立復(fù)合式動(dòng)物模型。另 外，用高齡大鼠加左側(cè)側(cè)腦室一次性注射聚集態(tài)的A β 25-35建立AD大鼠模型，通過(guò)行為學(xué) 試驗(yàn)和腦組織病理檢查等方法來(lái)研究這種復(fù)合式AD動(dòng)物模型與人類AD也有一定的相似 度。綜上所述，盡管目前已建立的AD動(dòng)物模型多種多樣，但均不能全面準(zhǔn)確地反映AD 的特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中還沒有最適宜的具有AD行為學(xué)和典型病理 學(xué)全部特征的AD動(dòng)物模型的問(wèn)題，提供一種AD復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法AD是一種多因素?fù)p傷引起的疾病，其致病因素?zé)o外乎遺傳因素和環(huán)境因素兩大 類。APP基因、早老素I(PSl)、早老素2 (PS2)是占AD 85%家族性癡呆的易感基因；鋁是AD 病最重要的環(huán)境因素?；诖?，本發(fā)明在仔細(xì)分析經(jīng)典的單因素鋁中毒模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 模型的基礎(chǔ)上，綜合兩種模型的優(yōu)點(diǎn)，并加以改進(jìn)，將AD發(fā)病相關(guān)的已知環(huán)境因素鋁與遺 傳因素APP/PS1基因的作用相結(jié)合，期望制作出一種更貼近人類AD復(fù)雜病因，同時(shí)具有人 類AD特征的新的、理想的多因素AD動(dòng)物模型。基于上述構(gòu)思，本發(fā)明的AD復(fù)合動(dòng)物模型制備方法是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的取健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，新鮮配制lmol/L AlCl3 ·6Η20溶液，高壓滅菌 后通過(guò)腹腔注射染毒，染毒30次，每次0. 05mL。進(jìn)一步地，本發(fā)明對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的染毒期為60天，隔天注射 AlCl3 · 6H20溶液，并在間歇天肌內(nèi)注射青鏈霉素以抗感染。優(yōu)選地，本發(fā)明選用四月齡健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明采用鋁中毒方法，對(duì)轉(zhuǎn)入了 AD致病基因APP和PSl的小鼠腹腔注射 AlCl3 · 6H20，經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)及形態(tài)學(xué)檢測(cè)，可以較好地模擬AD的神經(jīng)行為表現(xiàn)和具備 AD的全部典型形態(tài)學(xué)改變。復(fù)合模型動(dòng)物較對(duì)照組動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，具備老年 斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、淀粉樣蛋白沉積和顆粒空泡變性等典型的形態(tài)學(xué)特征，從而在神經(jīng)行 為學(xué)和病理組織學(xué)上較好地模擬了 AD的特征性改變。本發(fā)明所提供的AD復(fù)合模型動(dòng)物不但可以用于藥物篩選，也可以用于機(jī)制研究。


圖1為C57BL/6J野生小鼠對(duì)照組HE染色(X 400)的光鏡照片；圖2為C57BL/6J野生小鼠染鋁組HE染色(X 400)的光鏡照片；圖3為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組HE染色(X 400)的光鏡照片；圖4為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組HE染色(X 400)的光鏡照片；
圖5為C57BL/6J野生小鼠對(duì)照組NFT染色(X 400)的光鏡照片； 圖6為C57BL/6J野生小鼠染鋁組NFT染色(X 400)的光鏡照片；
圖7為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組NFT染色(X 400)的光鏡照片；圖8為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組NFT染色(X 400)的光鏡照片；圖9為C57BL/6J野生小鼠對(duì)照組β -APP蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡照 片；圖10為C57BL/6J野生小鼠染鋁組β -APP蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡照 片；圖11為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組β _ΑΡΡ蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡 照片；圖12為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組β -APP蛋白免疫組化染色(Χ400) 的光鏡照片；圖13為C57BL/6J野生小鼠對(duì)照組A β蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡照片；圖14為C57BL/6J野生小鼠染鋁組A β蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡照片；圖15為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組A β蛋白免疫組化染色(Χ400)的光鏡照 片；圖16為4 / 51雙轉(zhuǎn)基因小鼠40復(fù)合模型組4 0蛋白免疫組化染色(Χ400)的 光鏡照片；圖17為C57BL/6J野生小鼠對(duì)照組剛果紅染色(X 400)的光鏡照片；圖18為C57BL/6J野生小鼠染鋁組剛果紅染色(X 400)的光鏡照片；圖19為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組剛果紅染色(Χ400)的光鏡照片；圖20為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組剛果紅染色(Χ400)的光鏡照片；圖21為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組DAPI染色(Χ400)的熒光照片；圖22為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠染鋁組TUNEL染色(Χ400)的熒光照片；圖23為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組兩種染色Merge (X 400)的熒光照片；圖M為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組DAPI染色(X400)的熒光照片；圖25為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組TUNEL染色(X400)的熒光照片；圖沈?yàn)锳PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組兩種染色Merge (X 400)的熒光照 片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鋁中毒APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物復(fù)合模型的建立取健康雄性C57BL/6J小鼠和健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(中科院動(dòng)物所) 各16只，體重20 22g，活動(dòng)能力相近。隨機(jī)分為4組野生小鼠對(duì)照組、野生小鼠染鋁組、 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組，每組8只。新鮮配制lmol/L AlCl3 ·6Η20溶液，高壓滅菌后通過(guò)腹腔注射染毒，染毒期60天， 0.05mL/d，隔天注射，60天內(nèi)共計(jì)注射30次。在間歇天肌內(nèi)注射青鏈霉素以抗感染。對(duì)照 組腹腔注射同等體積滅菌后的生理鹽水，注射時(shí)間、次數(shù)及抗感染處理相同。整個(gè)染毒期間，動(dòng)物室以自然節(jié)律采光，溫度18 23 °C，濕度40 60 %，清潔、安 靜。所有動(dòng)物飼以普通飼料，自由飲水和進(jìn)食?；\具、飲水瓶等所有用具均不使用含鋁制品。實(shí)驗(yàn)操作在每天上午8 30 11 00完成。實(shí)施例2Morris水迷宮試驗(yàn)染毒結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze, MWM)。Morris水迷宮 由一白色圓柱形水池和一可移動(dòng)位置和調(diào)節(jié)高度的透明有機(jī)玻璃站臺(tái)組成。圓形水池直徑 100cm,高75cm，平臺(tái)高度50cm，直徑10cm，池壁由白色金屬板組成。池內(nèi)水深30cm，平臺(tái)低 于水面1cm，水溫22士2°C。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并 記錄游泳軌跡。實(shí)驗(yàn)期間迷宮外參照物保持不變。定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)小鼠連續(xù)接受4天訓(xùn)練，每天4次，每次間隔 20min，記錄小鼠分別從四個(gè)不同象限入水點(diǎn)入水找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避到平臺(tái)上的 潛伏期(escaping latency)。4次潛伏期成績(jī)的平均值作為當(dāng)日最終成績(jī)進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì)。 如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，其潛伏期按60s計(jì)算?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)實(shí)驗(yàn)第5天撤除平臺(tái)，從任一入水點(diǎn)將小 鼠面向池壁放入水中，記錄60s內(nèi)小鼠的游泳軌跡，觀察分析小鼠停留目標(biāo)象限的時(shí)間。結(jié)果表明，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組找到平臺(tái)的潛伏期較對(duì)照組顯著 增加(P < 0.01)，見表1。表1鋁染毒APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果(〒士^ )
組別逃避潛伏期(S)原平臺(tái)象限停留時(shí)間(S)野生小鼠對(duì)照組27.408 ± 6.09718.874 ± 1.895野生小鼠染鋁組38.721 ± 5.408*9.613 + 2.011*雙轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組34.651 ±7.124*10.915 ± 1.474*雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD復(fù)合模型組49.212 + 4.957*6.192 + 1.715** 與對(duì)照組相比，P < 0. Ol0實(shí)施例3組織切片的制備和常規(guī)HE染色染鋁期結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，灌注固定，斷頭取腦，迅速將取出 的大腦皮質(zhì)及海馬組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石 蠟包埋，RM-2245型石蠟切片機(jī)切片，厚度5ym，60°C烤片12h后取片，常溫保存，以進(jìn)行常 規(guī)、特殊組織學(xué)染色備用。1)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟2X IOmin ；2)無(wú)水乙醇去二甲苯2X 1 ^iiin ；3)95%, 80%、70%乙醇各&^11，自來(lái)水洗Imin ；4)蘇木素染色:3min，自來(lái)水洗Imin ；5)1%鹽酸酒 精分化20s，自來(lái)水洗Imin ；6) 1 %氨水返藍(lán)30s，自來(lái)水洗Imin ；7)伊紅染色15min，自來(lái)水 洗 Imin ；8)70%、80% 乙醇各 20s ；9) 95% 乙醇 2 X Imin ； 10)無(wú)水乙醇 2X2min ；11)中性樹 膠封片；12)AX70 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察、攝片。病理切片HEOfematoxylin-Eosin，蘇木精-伊紅)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察C57BL/6J野生小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)元體積較大；核圓，核仁明顯，細(xì)胞輪廓清晰(圖1) ；C57BL/6J野生小鼠染鋁、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元 體積變小，出現(xiàn)零散的嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核呈固縮狀，核周及胞漿空泡變性細(xì) 胞結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞輪廓模糊(圖2、圖3)；染鋁的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破 壞以及細(xì)胞輪廓模糊等病理改變更加明顯(圖4)。皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞顆?？张輼幼冇?jì)數(shù)結(jié)果 顯示兩種模型內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)(見表2) ,C57BL/6J野 生小鼠與APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)(見表3)。表2腦組織皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞顆?？张輼幼冇?jì)數(shù)(J 士 S，η = 8)
權(quán)利要求
1.一種阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法，其特征是取健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基 因小鼠，新鮮配制lmol/L AlCl3 · 6H20溶液，高壓滅菌后通過(guò)腹腔注射染毒，染毒30次，每 次 0. 05mLo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法，其特征是對(duì)APP/ PSl雙轉(zhuǎn)基因小鼠的染毒期為60天，隔天注射AlCl3 · 6H20溶液，并在間歇天肌內(nèi)注射青鏈 霉素以抗感染。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法，其特征是選用 四月齡健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型的制備方法，是取健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，將1mol/LAlCl3·6H2O溶液腹腔注射染毒，染毒30次，每次0.05mL。采用本發(fā)明方法得到的阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)及形態(tài)學(xué)檢測(cè)，較對(duì)照組動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，具備老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、淀粉樣蛋白沉積和顆?？张葑冃缘鹊湫偷男螒B(tài)學(xué)特征，可以較好地模擬阿爾茨海默病的神經(jīng)行為表現(xiàn)和具備阿爾茨海默病的全部典型形態(tài)學(xué)改變。本發(fā)明所提供的阿爾茨海默病復(fù)合動(dòng)物模型可以用于藥物篩選和阿爾茨海默病的機(jī)制研究。
文檔編號(hào)A61K33/06GK102058619SQ20101058389
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者張勤麗, 教霞, 牛僑, 賈麗, 郭衛(wèi)力 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)