專利名稱：一種具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)、藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體來說是一種具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備及在藥物控制釋放和顯像方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，且死亡率居高不下。腫瘤治療有三種主要手段外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)藥物治療(化療)，其中前兩種為局部性治療，當(dāng)腫瘤發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移時(shí)通常采取化療。而臨床上常用的化療藥物多為疏水型藥物，在水中的溶解度非常低，限制了它們的應(yīng)用。臨床使用時(shí)多采用小分子表面活性劑對(duì)疏水型化療藥物乳化增溶，但該劑型血液穩(wěn)定性很差，添加的輔料毒副作用也很大，而且釋放行為不容易控制。聚合物膠束是一種新型的藥物載體，它是由兩親性共聚物在水中自主裝形成的以疏水性段為內(nèi)核親水段為殼的核殼結(jié)構(gòu)，疏水型的藥物負(fù)載到膠束的核中。聚合物膠束能負(fù)載疏水性藥物而顯著增加藥物的溶解度、提高藥物的生物利用度。常規(guī)的膠束載藥體系存在著兩大問題，一是藥物在血液循環(huán)中過早的釋放，二是腫瘤部位藥物聚集和釋放濃度不夠。藥物在血液循環(huán)中過早的釋放使得有效藥量減少，同時(shí)全身毒副作用也會(huì)增加，藥物在腫瘤部位聚集或釋放濃度不夠會(huì)使藥物療效大大降低。 因此減少體內(nèi)循環(huán)時(shí)藥物的釋放，控制載藥體系到達(dá)腫瘤細(xì)胞后再釋放藥物是減小全身毒副作用、提高藥物的治療效果的一種有效方式。避免藥物在血液中的過早釋放，就要改善藥物釋放行為，這方面環(huán)境響應(yīng)型膠束優(yōu)勢(shì)十分明顯。其中酸敏型膠束是十分重要的一種。醫(yī)學(xué)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，血液的生理環(huán)境PH值約為7. 4，而細(xì)胞內(nèi)溶酶體的pH值則為4. 5^5. 0。根據(jù)這兩種狀態(tài)下pH值的不同， 設(shè)計(jì)酸敏型膠束可以做到在血液中膠束穩(wěn)定藥物不釋放，而到達(dá)細(xì)胞溶酶體后，藥物才開始釋放出來發(fā)揮療效。這樣就可以減少藥物在血液中釋放帶來的毒副作用，又避免了藥物在血液循環(huán)中的損失。解決藥物在腫瘤部位的聚集濃度不夠通常采用靶向修飾的藥物傳輸體系。在聚合物膠束表面引入腫瘤細(xì)胞表面或腫瘤組織血管表面過表達(dá)其受體的配體作為靶向分子(如葉酸、多肽或抗體等)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)載藥體系的內(nèi)吞作用，從而提高藥物在腫瘤部位的聚集濃度和釋放量。另外，在腫瘤治療中，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)將會(huì)對(duì)腫瘤的治療有十分重大的意義。在外科治療時(shí)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可以對(duì)精確定位腫瘤位置，使切除更加徹底?；熤腥缒軐?shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)， 則方便對(duì)化療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前臨床中多采用核磁共振顯像或超聲顯像進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。 但核磁共振顯像或超聲顯像只是對(duì)組織進(jìn)行評(píng)價(jià)，熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)使人們可以在細(xì)胞水平上對(duì)腫瘤進(jìn)行研究，方便對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行更加深入的了解。熒光成像技術(shù)和熒光探針的開發(fā)和研究有兩大困難一是無法有效的克服細(xì)胞在可見光區(qū)的自發(fā)熒光對(duì)標(biāo)記分子所發(fā)信號(hào)的掩蓋；二是熒光有機(jī)染料分子易發(fā)生光漂白， 無法較好的實(shí)現(xiàn)對(duì)研究分子的長(zhǎng)時(shí)間熒光標(biāo)記觀察。量子點(diǎn)作為新型的熒光試劑具有獨(dú)特的光學(xué)性能寬激發(fā)波長(zhǎng)范圍而發(fā)射波長(zhǎng)卻很窄、熒光壽命長(zhǎng)、不容易受其它信號(hào)干擾有抗光漂白作用、發(fā)射波長(zhǎng)可通過控制它的大小和組成來調(diào)整而且其尺寸特點(diǎn)也使得它非常適于在生物熒光成像中做熒光標(biāo)記物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服載藥體系在血液循環(huán)中的過早釋放問題，提供一種具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束是核殼結(jié)構(gòu)，外殼的親水段末梢接有靶向配體分子，內(nèi)核的疏水段負(fù)載疏水性抗癌藥物，內(nèi)核和外殼之間存在著一層可負(fù)載負(fù)電量子點(diǎn)的酸敏響應(yīng)亞表層，在PH 5. 0時(shí)酸敏層親水，在pH 7. 4時(shí)酸敏層疏水。膠束所用的聚合物為葉酸功能化的聚乙二醇親水段、酸敏中間段和疏水段組成的三嵌段共聚物。在PH 5.0時(shí)將疏水型藥物負(fù)載到膠束核中，此時(shí)酸敏段親水，不負(fù)載藥物； 再將PH調(diào)至7. 4時(shí)，酸敏段疏水形成一層保護(hù)層，阻止藥物在pH 7. 4時(shí)釋放，起到防止藥物在血液循環(huán)中過早釋放的問題。當(dāng)載藥體系通過葉酸介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后， 在腫瘤細(xì)胞的溶酶體PH 4. 5^5. 0的酸性環(huán)境下酸敏層親水，藥物開始從膠束核中釋放，發(fā)揮治療作用。所述的酸敏中間段可以是聚氨酰二異丙基乙二胺或聚丙烯酰二異丙基乙二胺，疏水段可以是聚酯或膽酸等疏水型分子。本發(fā)明實(shí)施例中采用葉酸聚乙二醇-聚天冬酰二異丙基乙二胺-膽酸三嵌段共聚物(FA-PEG-P (Asp-dip) -CA)。所述的疏水型藥物可以是紫杉醇(PTX)等疏水型抗腫瘤藥物。本發(fā)明的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束能在化療的同時(shí)提供實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能， 是兼具顯像功能的載藥體系。載藥體系的顯像功能是利用酸敏中間層在PH 5.0時(shí)帶正電這一特征來實(shí)現(xiàn)的。在PH 5.0載藥的同時(shí)，加入帶負(fù)電的量子點(diǎn)，通過靜電作用將量子點(diǎn)負(fù)載到酸敏層，再將PH調(diào)至7. 4，酸敏段疏水在載藥膠束核的外層形成一層保護(hù)層，將負(fù)電量子點(diǎn)包裹在保護(hù)層。酸敏中間層在防過早釋放的同時(shí)負(fù)載負(fù)電量子點(diǎn)起到可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光成像的功能。所述的負(fù)電量子點(diǎn)可以是羧基化的Cdk/ZnS或其它帶負(fù)電的量子點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備方法， 具體步驟如下將10重量份葉酸封端的聚乙二醇-聚天冬酰二異丙基乙二胺-膽酸三嵌段共聚物和1重量份疏水性抗癌藥物溶解在四氫呋喃中，在超聲作用下緩慢加至酸性緩沖液中，將四氫呋喃自然揮發(fā)掉，過濾將疏水性藥物聚集體除掉，用離心超濾管(MWCO=IOO kD) 離心超濾3次，加入負(fù)電量子點(diǎn)CcKe/ZnS (100 yL,8 μ moL/L)，混勻后靜止30分鐘，調(diào)節(jié) PH到7.4,6000 r/min離心除去未負(fù)載的量子點(diǎn)。所得膠束形狀均勻，光散射測(cè)出平均粒徑為53. 4 士 0. 8 nm，透射電鏡測(cè)出粒徑為40 nm左右。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
我們?cè)O(shè)計(jì)的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束是通過中間段為酸敏段的葉酸功能化的三嵌段共聚物在PH 5. 0的條件下自組裝形成的。利用膠束核負(fù)載疏水性藥物；膠束核與殼之間存在著一段酸敏感的中間層，在PH 5.0的條件下，酸敏段帶正電荷可以通過靜電作用負(fù)載負(fù)電性量子點(diǎn)，在PH 7. 4的環(huán)境下，酸敏段疏水在膠束核的外層形成一層保護(hù)層， 將負(fù)電量子點(diǎn)包裹在保護(hù)層，同時(shí)該層能起到防止藥物在PH 7. 4的條件下釋放的作用。當(dāng)膠束通過葉酸靶向介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在細(xì)胞溶酶體的低PH 5. 0的條件下酸敏段質(zhì)子化變成親水性，此時(shí)藥物可以從膠束核中釋放出來發(fā)揮療效。該體系是集主動(dòng)靶向、顯像和防藥物過早釋放的新型多功能膠束載藥體系。本發(fā)明的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束不僅能解決載藥體系在血液中的過早釋放問題，提高了藥物在腫瘤部位的聚集濃度和釋放速度，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。對(duì)腫瘤治療和藥物新劑型方面有很大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前


圖1是實(shí)施例3中膠束粒徑的動(dòng)態(tài)光散射分布圖。結(jié)果表明PEG- P(Asp-dip) 17-CA 形成的膠束粒徑為53. 4 士 0. 8 nm。圖2是實(shí)施例3中膠束透射電鏡形貌圖。pH 7. 4時(shí)的量子點(diǎn)均勻分布在膠束內(nèi)核的外層，膠束粒徑均勻(40 nm)，說明了結(jié)果表明量子點(diǎn)被成功的負(fù)載到膠束樣品中，同時(shí)也證明了我們?cè)O(shè)計(jì)的膠束的確具有酸敏亞表層。圖3是實(shí)施例4中膠束體外藥物釋放圖，實(shí)施例中所用聚合物的酸敏中間段地重復(fù)單元數(shù)為17，PEG- P (Asp-dip)-CA負(fù)載紫杉醇后樣品在pH 7. 4的緩沖液中釋放量很低，而在PH 5.0的緩沖液中均表現(xiàn)出快速釋放行為。藥物體外釋放結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的膠束體系具有防止藥物在PH 7. 4中過早釋放的功能。圖4是實(shí)施例5中負(fù)載FDA和QD的膠束在pH 5. 0時(shí)的熒光釋放圖。結(jié)果表明在 PH 5. 0時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)DA逐漸釋放，其的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；QD在酸性環(huán)境中逐漸熒光慢慢淬滅，其熒光強(qiáng)度逐漸減弱。圖5是實(shí)施例5中負(fù)載FDA和QD的膠束在pH 7. 4時(shí)的熒光釋放圖。結(jié)果表明在 PH 7. 4時(shí)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)DA和QD穩(wěn)定在膠束核中沒有釋放，F(xiàn)DA和QD的熒光強(qiáng)度基本不變。圖6是實(shí)施例6中不同膠束樣品對(duì)Bel-7402細(xì)胞的毒性測(cè)試圖。樣品分別為 FA-micelles，PTX/micelles，PTX/FA—micelles，PTX/FA—micelles/QD ；其中FA—micelles 為空膠束，后三者樣品中含紫杉醇的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)系列濃度均為(5 ηΜ,ΙΟ ηΜ, 20 ηΜ, 30 ηΜ，40 ηΜ，50 ηΜ，60 ηΜ)，培養(yǎng)時(shí)間為36 h。結(jié)果表明空膠束FA-micelles的細(xì)胞毒性最小，非靶向組PTX/micelles的細(xì)胞毒性次之，靶向組PTX/FA-micelles的細(xì)胞毒性較非靶向組高， 同時(shí)負(fù)載PTX和QD的樣品PTX/FA-mi ce 11 es/QD與靶向組PTX/FA-mi ce 11 es樣品基本相當(dāng)， 說明引入QD后樣品的毒性沒有增加。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明。實(shí)施例1
葉酸修飾的具有酸敏中間段的三嵌段共聚物FA-PEG-P (Asp-dip)-CA的合成(1) 一端為烯丙基另一端為羥基的聚乙二醇(Allyl-PEG-OH)的合成將萘基鉀(4 mL)的四氫呋喃溶液與丙烯醇(0. 75 mL)混合均勻后在干燥的反應(yīng)瓶中攪拌15分鐘。然后在氬氣保護(hù)下加入無水四氫呋喃(20 mL)和18-冠醚-6的四氫呋喃溶液 (含1.5 g 18-冠醚-6和5 mL無水四氫呋喃)，攪拌15分鐘后將混合物置于冰鹽浴中冷卻， 并緩慢通入干燥的環(huán)氧乙烷，維持低溫M小時(shí)以使聚合反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，室溫下繼續(xù)反應(yīng)72 小時(shí)。(2) 一端為烯丙基另一端為氨基的聚乙二醇(Allyl-PEG-NH2)的合成
稱取Allyl-PEG-OH (Mn=2000 Da，20g)于干燥的三口瓶中(250 mL)，80°C抽真空干燥 4 h，然后加入無水二氯甲烷(100 mL)、吡啶(50 mL)和對(duì)甲苯磺酰氯(TsCl，5g)，室溫下避光反應(yīng)M h。反應(yīng)液用HCl (3 mol L-1)萃取洗滌，有機(jī)層用NaHC03 (5g)洗滌，將溶液慢慢滴加到大量無水乙醚中，真空干燥得白色粉末PEG2k-0TS。將上述白色粉末(10 g)與濃氨水(500 mL, 25%)置于IOOOmL容器中，室溫下反應(yīng) 5天。用同體積的CH2Cl2萃取后將其與同體積NaOH溶液(1. 0 mol L—1)充分混合攪拌2 h， 將有機(jī)層用水洗至中性，真空干燥得Allyl-PEG2k-NH2。核磁計(jì)算出氨基轉(zhuǎn)換率為80%。(3)芐氧羰基天冬氨酸酸酐(BLA-NCA)的合成
在干燥的三口燒瓶?jī)?nèi)(250 mL)裝入天門冬氨酸芐酯(25 g)，然后加入新蒸的乙酸乙酯 (100 mL)攪拌溶解。另將三聚光氣(13J948 g)用新蒸的乙酸乙酯(40 mL)溶解后轉(zhuǎn)移至干燥的磨口恒壓滴液漏斗中。將天門冬氨酸芐酯的乙酸乙酯溶液溫度升至40°C后，攪拌并緩慢滴加三光氣的乙酸乙酯溶液，待反應(yīng)液轉(zhuǎn)透明后攪拌熟化1小時(shí)，通氬氣鼓泡除去溶液生產(chǎn)的氯化氫。過濾去未反應(yīng)的天門冬氨酸芐酯，在新蒸正己烷中進(jìn)行重沉淀，充分搖振，待有晶體析出時(shí)放入冰箱冷凍至少12小時(shí)。冷凍后快速抽濾，用正己烷洗滌數(shù)次，真空干燥得到 BLA-NCA 晶體。(4)聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物(PEG-PBLA)的合成
將PEG2k-NH2 (1.0 g)加入反應(yīng)瓶(50 mL)中，70°C真空干燥4 h，用DMF (10 mL)溶解， 加入含1.9 g BLA-NCA的DMF (2 mL)溶液?；旌暇鶆蚝笥?5°C下反應(yīng)M h。將溶液沉淀在冷乙醚中，過濾抽干，得PEG2k-PBLA3.5k。(5)聚乙二醇-聚天冬氨酸-膽酸(PEG-PBLA-CA)的合成
稱取膽酸(0.05 g)，EDC (0.03 g)和 NHS (0.02 g)于反應(yīng)瓶(50 mL)中，加 DMF/HCC13 (V =V=I 1,4 mL)溶解后，攪拌 30min，加 PEG2k_PBLA3. 5k (0. 55 g)，室溫反應(yīng) 24h。將溶液沉淀到無水乙醇中，過濾，水洗，真空干燥得到PEG-PBLA-CA。(6)聚乙二醇-聚天冬酰二異丙基乙二胺-膽酸(PEG-P(Asp-dip)-CA)的合成稱取 PEG-PBLA_CA(0. 3 g)加入反應(yīng)瓶(50 mL)中，用 DMF( 1. 0 mL)溶解，加 dip(4 mL),
于35°C攪拌下反應(yīng)48h。將溶液沉淀到無水乙醚中，過濾，真空干燥得PEG-P (Asp-dip) -CA0(7)葉酸功能化的聚乙二醇-聚天冬酰二異丙基乙二胺-膽酸 (FA-PEG-P (Asp-dip) -CA)的合成
稱取PEG-P (Asp-dip)-CA (0. 3 g，leq)置于兩口燒瓶中，70°C真空干燥1 h，加入DMF (5 mL)溶解，然后加入巰基乙胺鹽酸鹽(80 mg, 15eq.)與偶氮二異丁腈(6 mg，0.8eq)，在 70°C反應(yīng)M h，沉淀在冷無水乙醚中，得NH2-PEG-P(Asp-dip)-CA。
葉酸(0.044 g)加入兩口瓶(50 mL)中，真空干燥4 h后，加入干燥的DMSO (15 mL)，然后依次加入N-羥基琥珀酰亞胺0.023g Qeq)，N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺0.041g Oeq)，避光反應(yīng)12 h，離心去掉生成的DOT，然后活化的葉酸加入到溶有 NH2-PEG-P(Asp-dip)-CA (0.3 g)的5 ml DMF溶液中，然后用三乙胺把反應(yīng)體系pH值調(diào)到 8，避光反應(yīng)Mh，用MWCO=Ik Da的透析袋在蒸餾水中透析48h，冷凍干燥得黃色粉末狀產(chǎn)物 FA-PEG-P(Asp-dip)-CA。實(shí)施例2
具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備
(1)負(fù)載 QD 膠束樣品制備將 FA-PEG-P (Asp-dip)-CA(2. 0 mg)和 PEG-P (Asp-dip)-CA (8.0 mg)的混合物溶于四氫呋喃(THF，1.0 mL)中，超聲情況下滴加到PBS (10 mL，pH=5. 0) 中，攪拌過夜，將THF自然揮發(fā)掉，用孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾后加入負(fù)電量子點(diǎn)CdSe/ ZnS (100 μ L,8 μ moL/L)，混勻后靜止30分鐘，調(diào)節(jié)pH到7. 4，6000r/min離心除去未負(fù)
載的量子點(diǎn)。(2)負(fù)載QD和紫杉醇膠束樣品制備將FA-PEG-P (Asp-dip) -CA (2.0 mg)和 PEG-P (Asp-dip) -CA (8.0 mg)的混合物與 PTX (1.0 mg)溶于四氫呋喃(THF，1. 0 mL)中， 超聲情況下滴加到PBS (10 mL, pH=5. 0)中，攪拌過夜，將THF自然揮發(fā)掉，用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過濾將PTX聚集體除掉，用離心超濾管(MWCO=IOO kD)離心超濾3次，加入負(fù)電量子點(diǎn) CdSe/ZnS (100 μ L，8 μ moL/L)，混勻后靜止 30 分鐘，調(diào)節(jié) pH 到 7. 4。6000r/min 離心除去未負(fù)載的量子點(diǎn)。(3)負(fù)載QD和熒光素二乙酸酯(FDA)膠束樣品制備將FA_PEG_P (Asp-dip)-CA (2.0 mg)和 PEG-P (Asp-dip)-CA (8.0 mg)的混合物與 FDA (1.0 mg)溶于四氫呋喃(THF， 1.0 mL)中，超聲情況下滴加到PBS (10 mL, pH=5. 0)中，攪拌過夜，將THF自然揮發(fā)掉，用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過濾將FDA聚集體除掉，用離心超濾管(MWCO=IOO kD)離心超濾3 次，加入負(fù)電量子點(diǎn)CcKe/ZnS (100 yL,8 μ moL/L)，混勻后靜止30分鐘，調(diào)節(jié)pH到7. 4。 6000r/min離心除去未負(fù)載的量子點(diǎn)。實(shí)施例3具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的粒徑和形貌測(cè)試試驗(yàn)
負(fù)載QD膠束的粒徑大小采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)試結(jié)果見圖1 ；其形態(tài)則通過透射電子顯微鏡來觀察確定，測(cè)試結(jié)果見圖2。實(shí)施例4
具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束(以負(fù)載紫杉醇的膠束為例)的體外釋藥試驗(yàn)用透析的方法來做紫杉醇的體外釋放實(shí)驗(yàn)。將新做的負(fù)載紫杉醇的 PEG-P (Asp-dip) -CA膠束分成兩份，一份維持其pH值為5. 0，將另一份調(diào)至7. 4。再將每個(gè) PH值的樣品分成三份(平行實(shí)驗(yàn))裝到截留分子量為14000 Da的透析袋中，將透析袋放入 100 mL的相同PH值的PBS緩沖液中。置于37°C的搖床中，75 r/min的轉(zhuǎn)速下，設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣，之后補(bǔ)加相同體積的新鮮緩沖液。用HPLC檢測(cè)樣品的濃度，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放量。其中HPLC所用的色譜柱型號(hào)為welch materials公司的Ultimate AQ-C18， 5 μπι，4. 6X250mm，流動(dòng)相為乙腈和水(V:V=50:50)，流速為1.0 mL mirT1，柱溫為40°C，注射樣品量為20 UL0以時(shí)間-累積釋放量做圖，得到體外PTX從膠束釋放的曲線，測(cè)試結(jié)果如圖3。
實(shí)施例5
具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束(以負(fù)載FDA和QD的膠束為例)的體外熒光釋放試
驗(yàn)
取PH為7. 4的負(fù)載FDA和QD的1. 0 mg mL—1膠束溶液1 mL，調(diào)節(jié)pH為5. 0，定容至2 mL。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖，熒光掃描的激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm，激發(fā)狹縫設(shè)置為10.0 nm，發(fā)射狹縫設(shè)置為10.0 nm，掃描速度為500 nm mirT1。測(cè)試結(jié)果如圖4。用同樣的參數(shù)檢測(cè)pH為7. 4的負(fù)載FDA和QD的0. 5 mg mL—1膠束溶液的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖，測(cè)試結(jié)果如圖5。實(shí)施例6具有酸敏亞表層的聚合物膠束的體外毒性試驗(yàn)
用四唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)膠束樣品對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖能力的影響。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次。將Bel-7402細(xì)胞以1 X IO3細(xì)胞每孔接種于96孔板，然后將Bel-7402細(xì)胞在100 μ L RPMI 1640 (含10%FBS)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h，接著換成不含F(xiàn)A以及血清的培養(yǎng)基， 并加入不同的樣品體系再培養(yǎng)36 h，其中樣品組有1)空膠束(FA-PEG-P(Asp-dip)-CA) FA-micelIes，2) PEG-P (Asp-dip) -CA 膠束負(fù)載紫杉醇(PTX-micel 1 es)，3)葉酸靶向的膠束負(fù)載紫杉醇(PTX/FA-miCelles)，4)葉酸靶向的膠束同時(shí)負(fù)載紫杉醇和量子點(diǎn)(PTX/ FA-micelles/QD)。最后，將培養(yǎng)基換成 150 μ L RPMI 1640 并加入 5 mg mL-1 MTT 溶液 50 μ L，37°C繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)，將孔內(nèi)培養(yǎng)上清液吸取棄掉，在每孔內(nèi)加入150 μ L DMS0，震蕩5 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)各孔在0D570 nm的吸光度值。以空白對(duì)照組為基準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。測(cè)試結(jié)果如圖6。
權(quán)利要求
1.一種具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束，所述的納米膠束結(jié)構(gòu)是核殼結(jié)構(gòu)，其特征在于外殼的親水段末梢接有靶向配體分子，內(nèi)核的疏水段負(fù)載疏水性抗癌藥物，內(nèi)核和外殼之間存在著一層可負(fù)載負(fù)電量子點(diǎn)的酸敏響應(yīng)亞表層，在PH 5. 0時(shí)酸敏層親水，在pH 7. 4時(shí)酸敏層疏水。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向聚合物膠束，其特征在于所述膠束由靶向分子功能化的聚乙二醇-酸敏段-疏水段三嵌段共聚物構(gòu)成，酸敏段為聚氨酰二異丙基乙二胺或聚丙烯酰二異丙基乙二胺，疏水段為聚酯或膽酸。
3.如權(quán)利要求1所述的靶向聚合物膠束，其特征在于所述靶向配體分子為葉酸。
4.如權(quán)利要求1所述的靶向聚合物膠束，其特征在于所述的酸敏段為二異丙基乙二胺功能化的聚合物，在PH 5. 0時(shí)酸敏段親水，在pH 7. 4時(shí)酸敏段疏水。
5.如權(quán)利要求1所述的靶向聚合物膠束，其特征在于所述納米膠束為球形，直徑大小為 50 nm0
6.如權(quán)利要求1所述的靶向聚合物膠束，其特征在于所述疏水性抗癌藥物是紫杉醇。
7.—種權(quán)利要求1所述的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備方法，其特征在于包括如下步驟將10重量份葉酸封端的聚乙二醇-聚天冬酰二異丙基乙二胺-膽酸三嵌段共聚物和1重量份疏水性抗癌藥物溶解在四氫呋喃中，在超聲作用下緩慢加至酸性緩沖液中，將四氫呋喃自然揮發(fā)掉，過濾將疏水性藥物聚集體除掉，用離心超濾管(MWCO=IOO kD) 離心超濾3次，加入負(fù)電量子點(diǎn)CcKe/ZnS (100 yL,8 μ moL/L)，混勻后靜止30分鐘，調(diào)節(jié) PH到7. 4，6000 r/min離心除去未負(fù)載的量子點(diǎn)。
8.如權(quán)利要求7所述的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備方法，其特征在于， 所述膠束要在酸性條件下負(fù)載藥物，所述的酸性緩沖液為PBS CpH 5.0)。
9.如權(quán)利要求7所述的具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束的制備方法，其特征在于， 所述過濾采用孔徑為0.45 μ m的濾膜進(jìn)行過濾。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有酸敏亞表層的靶向聚合物膠束及其制備方法，所述的聚合物膠束是核殼結(jié)構(gòu)，外殼的親水段末梢接有靶向配體分子，內(nèi)核的疏水段負(fù)載疏水性抗癌藥物，內(nèi)核和外殼之間存在著一層可負(fù)載負(fù)電量子點(diǎn)的酸敏響應(yīng)亞表層，在pH5.0時(shí)酸敏層親水，在pH7.4時(shí)酸敏層疏水。本發(fā)明通過靶向分子實(shí)現(xiàn)膠束的腫瘤靶向功能，通過酸敏亞表層負(fù)載的量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)顯像功能，通過酸敏亞表層的低pH值響應(yīng)性現(xiàn)實(shí)藥物控制釋放功能。本發(fā)明的膠束體系改善藥物了釋放行為，以期解決膠束體系在血液循環(huán)中過早釋放的問題，通過靶向分子介導(dǎo)的內(nèi)吞行為增強(qiáng)了藥物的治療效果，通過負(fù)載的量子點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)治療過程中的監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)A61K9/14GK102440961SQ201110405688
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者鞏發(fā)明, 帥心濤, 王偉偉, 程度 申請(qǐng)人:中山大學(xué)