專利名稱：一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料fret靶向復合探針的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化學及藥物交叉領域，特別是一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針。
背景技術：
癌癥是一類嚴重危害人類健康的重大疾病，在對癌癥患者的治療過程中，化學藥物治療是對癌癥患者手術后徹底殺滅體內癌細胞的有效方法。但抗癌藥在抑制或殺滅腫瘤癌細胞的同時，對機體內的某些正常器官細胞，如骨髓造血細胞、消化道粘膜上皮細胞和生殖細胞等同樣造成嚴重傷害，并且對某些組織器官如肝、腎、心、肺等也造成嚴重損害，影響到癌癥患者的治愈效果和生活質量。同時，傳統(tǒng)的抗癌藥對實體瘤治療療效評價方法一般采用治療前后腫瘤最長徑尺 度變化評價疾病的發(fā)展情況。通過胸部X片(適用于肺部)，計算機斷層掃描(CT )及核磁共振成像(MRI)，超聲波檢查(適用于體表或淺層，不適合腹腔)，內窺鏡及腹腔鏡，腫瘤標記，細胞學及組織學檢查等手段實現(xiàn)。這些方法是腫瘤變化過程中的一種狀態(tài)的靜態(tài)刻畫，難于原位實時評價抗癌藥對患者腫瘤變化情況及抗癌藥與癌病灶作用過程的動力學，對化療藥物與癌病灶的作用程度和藥效評價具有一定的滯后性。向腫瘤癌細胞病灶靶向投遞藥物是有效治療癌癥的有效方法之一，它可克服化學藥物治療所帶來的副作用。這一系統(tǒng)可將藥物最大限度地運送到靶區(qū)，使藥物在靶區(qū)濃集，可超出普通試劑的數(shù)倍乃至數(shù)百倍，直接作用于病變組織、器官和細胞，延長藥物與靶部位的作用時間，治療效果明顯提高；同時可減少藥物用量，降低了藥物在其他部位的濃度，達到高效低毒的治療效果。而在眾多實體瘤治療療效評價方法中，熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測法相比，表現(xiàn)出速度快、重復性好、用量少及無輻射等優(yōu)點，在疾病診斷、抗癌藥分析、抗體免疫分析等方面已經(jīng)得到廣泛應用。與葉酸分子偶聯(lián)的熒光體通過葉酸受體的特異性作用進入腫瘤細胞，使腫瘤組織明顯區(qū)別于臨近正常組織。與放射成像技術相比，熒光成像無創(chuàng)傷，也使人體免受粒子輻射。研究如何將腫瘤癌細胞病灶靶向藥物投遞系統(tǒng)和熒光探針技術有機結合，同時實現(xiàn)抗癌藥對癌病灶的靶向投遞和抗癌藥在機體內的傳輸過程以及與癌細胞作用的原位信息傳感，對實現(xiàn)化療藥與癌細胞作用的電子輸運本質規(guī)律的揭示、藥效評價、提高化療藥療效并減少患者正常組織損傷均具有重要意義。熒光共振能量轉移(FRET)是一種新型熒光研究方法，由于FRET對于距離和熒光基團的空間取向高度靈敏，可以通過FRET效率的測量，觀察生物分子間相互作用的改變情況，反應兩分子團的距離信息。從理論上講，在分子水平上研究任何生物學機制都可以通過FRET技術，關鍵在于找到合適的熒光探針。阿霉素是治療乳腺癌等癌癥的廣譜化療藥，藥物本身具有一定的突光強度，表現(xiàn)出一定的突光表達特性，其激發(fā)波長為490nm,發(fā)射波長為545nm。但是，由于其熒光量子產(chǎn)率低，熒光強度不高，不具有同時實現(xiàn)抗癌藥效和與癌細胞作用的熒光原位表達特性。因而，將適當波長的熒光染料與具有熒光特性的阿霉素耦合在葉酸修飾的載體上，利用抗癌藥與熒光染料之間的FRET特性研究，可實現(xiàn)在阿霉素殺滅癌細胞的同時，實時熒光表達癌細胞作用形態(tài)，實現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細胞作用過程及藥物療效原位影像評價。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的提供殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，該探針將具有一定波長的有機熒光染料與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉移(FRET)特性的復合結構，在紫外光或可見光量激發(fā)下表達FRET特性的復合探針。采用葉酸對該探針進行修飾構建成一種靶向作用于腫瘤癌細胞的阿霉素-有機熒光染料FRET復合探針。利用葉酸-受體的介導作用實現(xiàn)該探針對腫瘤癌細胞靶向投遞作用，利用探針的FRET特性，通過對探針與癌病灶相互作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結構變化信息的監(jiān)控，實現(xiàn)探針與腫瘤癌細胞的相互作用過程的原位影像評價特性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是提供一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，其中該復合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機熒光染料和抗癌藥阿霉素；所述有機熒光染料為具有一定波長，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒·光共振能量轉移(FRET)特性的復合探針結構，在紫外光或可見光激發(fā)下，能有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，并與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將能量非放射性地轉移到阿霉素上而表達FRET特性的一類有機熒光染料。本發(fā)明的效果為I.本發(fā)明一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，構建了阿霉素-有機熒光染料FRET復合探針結構，有機熒光染料的能量轉移到阿霉素上，阿霉素的熒光強度增強，使其具有與癌細胞作用的熒光原位表達特性。2.本發(fā)明一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，通過葉酸-受體介導作用靶向投遞至腫瘤癌細胞并對其進行染色，根據(jù)熒光行為觀察復合探針在腫瘤癌細胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在阿霉素釋放并與腫瘤癌細胞作用過程中，復合探針的FRET復合結構發(fā)生變化，通過復合探針熒光強度變化大小和熒光強度變化速率等信息的實時監(jiān)控，可實現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細胞作用過程的原位影像評價。


圖I為本發(fā)明的復合探針的組成結構及作用示意圖。圖中I、殼聚糖 2、有機熒光染料 3、葉酸 4、阿霉素5、腫瘤癌細胞6、藥物釋放過程
具體實施例方式結合附圖對本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針結構及作用過程加以說明。本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，該復合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機熒光染料和抗癌藥阿霉素；所述有機熒光染料為具有一定波長，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉移(FRET)特性的復合探針結構，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達FRET特性的一類有機熒光染料。所述復合探針結構在紫外光或可見光激發(fā)下，有機熒光染料會有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將有機熒光染料的能量非放射性地轉移到阿霉素上，表達FRET特性，增強阿霉素熒光強度。所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量為200(T4000。所述FRET復合結構中，有機熒光染料為能量供體，阿霉素為能量受體。有機熒光染料的發(fā)射波長為48(T500nm。如圖I所示，本發(fā)明所涉及的一種殼 聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針功能是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，該探針由抗癌藥阿霉素4、有機熒光染料2和葉酸3修飾的殼聚糖I構成。所選抗癌藥阿霉素4是一種廣譜化療藥，其激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為545nm ;所選有機熒光染料2為具有一定波長，能與阿霉素4形成具有熒光共振能量轉移FRET復合結構，并在紫外光或可見光激發(fā)下能表達FRET特性；所選葉酸3修飾的殼聚糖I為兩親性殼聚糖，其分子量大小為200(T4000 ;有機熒光染料2通過鍵合的方式接于殼聚糖I表面，阿霉素4通過包裹方式組裝在殼聚糖I內部。將具有一定波長的有機熒光染料2與抗癌藥阿霉素4耦合，使有機熒光染料2的發(fā)射波長與阿霉素的激發(fā)波長相匹配，形成具有熒光共振能量轉移FRET復合結構。在紫外光或可見光激發(fā)下，有機熒光染料會有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將有機熒光染料的能量非放射性地轉移到阿霉素上，表達FRET特性，增強阿霉素熒光強度。該探針載體選擇為殼聚糖1，殼聚糖為兩親性并用葉酸3進行了修飾。利用葉酸-受體的介導作用實現(xiàn)該探針對腫瘤癌細胞5靶向投遞作用；利用該復合探針的FRET特性，通過對探針與癌病灶相互作用過程中，F(xiàn)RET現(xiàn)象結構變化信息的監(jiān)控，實現(xiàn)復合探針與腫瘤癌細胞5的相互作用過程的原位影像評價特性。構建的殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針進入活體組織后，通過葉酸-受體的介導作用運輸至腫瘤癌細胞5的細胞膜上，殼聚糖I本身所帶的正電荷與腫瘤癌細胞5的細胞膜上負電荷結合，形成內涵體，通過細胞的內吞作用進入腫瘤癌細胞5細胞漿中，ATP酶驅動的質子泵將質子轉運進入內涵體，使內涵體表面呈酸性，pH值約為5，殼聚糖I構型發(fā)生變化，抗癌藥阿霉素4得到釋放，并作用于細胞核而發(fā)揮藥效。在這一過程中，復合探針的FRET熒光特性表達可對腫瘤癌細胞5進行染色，通過熒光行為變化可觀察復合探針在腫瘤癌細胞5的細胞膜、細胞漿、細胞核中作用過程及分布規(guī)律。在藥物釋放過程6中，由于FRET靶向復合探針對于距離和熒光基團的空間取向具有高度敏感性，阿霉素4與有機熒光染料2之間的距離變大(>10nm)，復合探針的FRET體系發(fā)生變化，其表達的熒光強度發(fā)生變化，通過熒光強度變化速率和熒光強度變化大小的實時監(jiān)控，實現(xiàn)腫瘤癌細胞5的變化情況、阿霉素4與腫瘤癌細胞5作用過程和阿霉素4治療療效的原位影像評價。所述腫瘤癌細胞5為細胞膜上能表面高度表達葉酸受體的腫瘤癌細胞，如卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、鼻咽癌細胞。實施例I)用PEG和長鏈酸酐對殼聚糖進行改性，使其具有雙親性。用葉酸3對其進行修飾，并在其表面通過鍵合的方式接上發(fā)射波長在48(T500nm之間的吲哚咔唑類染料，最后包裹抗癌藥阿霉素，組成阿霉素-吲哚咔唑類染料FRET靶向復合探針，其中阿霉素為能量供體，吲哚咔唑類染料為能量受體。用其治療老鼠體內的腫瘤細胞發(fā)現(xiàn)，探針能夠選擇性地標記進入腫瘤細胞，其熒光圖像清晰，隨著阿霉素藥效在腫瘤癌細胞內的發(fā)揮，復合探針的熒光強度逐漸下降。當阿霉素全部釋放并發(fā)揮藥效后，熒光強度下降309^50%，變化明顯。 根據(jù)復合熒光強度的變化情況，很好地跟蹤了阿霉素與腫瘤細胞的作用過程，實現(xiàn)了原位影像評價功能。
權利要求
1.一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，其特征是該復合探針包括有葉酸修飾殼聚糖、有機熒光染料和抗癌藥阿霉素； 所述有機熒光染料為具有一定波長，并能與抗癌藥阿霉素相耦合，形成具有熒光共振能量轉移(FRET)特性的復合探針結構，在紫外光或可見光激發(fā)下，能有效地產(chǎn)生振蕩偶極子，并與阿霉素的偶極子產(chǎn)生共振，通過偶極子與偶極子之間的相互作用將能量非放射性地轉移到阿霉素上而表達FRET特性的一類有機熒光染料。
2.根據(jù)權利要求I所述一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，其特征是所述殼聚糖為兩親性殼聚糖，其分子量為200(T4000。
3.根據(jù)權利要求I所述一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，其特征是所述有機熒光染料的發(fā)射波長為48(T500nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種殼聚糖支載阿霉素-有機熒光染料FRET靶向復合探針，該探針將具有一定波長的有機熒光染料與抗癌藥阿霉素相耦合殼聚糖上，形成具有熒光共振能量轉移特性的復合結構，并在紫外光或可見光激發(fā)下表達FRET特性的熒光探針。有益效果是通過該復合探針結構的構建，將有機熒光染料的能量轉移到阿霉素上，增強阿霉素的熒光強度，使其具有與癌細胞作用的熒光原位表達特性。通過復合探針靶向投遞過程中熒光行為觀察復合探針在腫瘤癌細胞各區(qū)域的作用過程及分布規(guī)律；在阿霉素釋放并與腫瘤癌細胞作用過程中，通過復合探針熒光強度變化大小和熒光強度變化速率等信息的實時監(jiān)控，可實現(xiàn)阿霉素與腫瘤癌細胞作用過程和藥物療效的原位影像評價。
文檔編號A61K49/00GK102716502SQ20121021680
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權日2012年6月28日
發(fā)明者張寶蓮, 曹凌云, 谷迎春, 費學寧 申請人:天津城市建設學院