專(zhuān)利名稱(chēng)：重組的減毒細(xì)小病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的病毒疫苗、它們的生產(chǎn)和用途的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含減毒細(xì)小病毒的疫苗，所述減毒細(xì)小病毒包括可源自新的細(xì)小病毒分離物的衣殼蛋白及其片段。
背景技術(shù)：
細(xì)小病毒屬于單鏈DNA病毒科。在一些動(dòng)物如貓、狗和豬中，細(xì)小病毒可引起疾病。因?yàn)椴《拘枰钴S分裂的細(xì)胞以便復(fù)制，感染的組織的類(lèi)型隨動(dòng)物的年齡而變化。在任何年齡都可以影響胃腸道和淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉和免疫抑制，但是在子宮內(nèi)或在小于兩周齡時(shí)被感染的貓中僅看到小腦發(fā)育不全，在3周和8周齡之間被感染的小狗中看到心肌疾病。
犬細(xì)小病毒是在年幼小狗中尤其致命的疾病，約80%致死，在非常年幼的小狗中引起胃腸道損傷和脫水以及心臟綜合癥。它是通過(guò)與被感染的狗的糞便接觸而傳播的。癥狀包括嗜睡、嚴(yán)重腹瀉、發(fā)燒、嘔吐、食欲不振和脫水。豬細(xì)小病毒在豬中引起被稱(chēng)為SMEDI的生殖疾病，其代表為死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。貓泛白細(xì)胞減少癥在小貓中常見(jiàn)，并引起發(fā)燒、低白細(xì)胞數(shù)、腹瀉和死亡。小于兩周的貓?zhí)汉托∝埖母腥疽鹦∧X發(fā)育不全。水貂腸炎病毒在對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥的作用中是相似的，除了它不會(huì)引起小腦發(fā)育不全。不同的細(xì)小病毒在水紹和其它Il自科動(dòng)物中引起阿留申病(Aleutian Disease),其特征在于淋巴結(jié)病、脾腫大、腎小球性腎炎、貧血和死亡。細(xì)小病毒的最準(zhǔn)確的診斷方法是通過(guò)ELISA。可以對(duì)貓、狗和豬進(jìn)行針對(duì)細(xì)小病毒的免疫。在DNA水平上，已知犬、貓和豬細(xì)小病毒具有高度同源的基因組。犬細(xì)小病毒(CPV2)是ー種在狗中引起急性、且有時(shí)是致命的腸炎的病毒(Kelly，Aust. Vet. J. 54;593，1978;Appel 等，Vet. Rec. 105 ;156_159，1979)。1977 年左右首先出現(xiàn)的該病毒可能通過(guò)單個(gè)衣殼蛋白中少數(shù)突變而從在貓中非常密切相關(guān)的病毒(即貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(FPLV))產(chǎn)生的；物種跳躍可能涉及在其它食肉動(dòng)物(如水貂或浣熊)的中間傳遞(Truyen 等，Virology 215, 186-189，1996)。早在1979年，出現(xiàn)了 CPV2的第一種變異體，被稱(chēng)為CPV2a，隨后很快在1984年出現(xiàn)了 CPV2b (Parrish 等，Science 230，1046-1048, 1985，和 J. Virol. 65 ;6544_6552，1991)。最初的2型病毒現(xiàn)在已經(jīng)從野外(field)中消失，被2a和2b變異體所替代；盡管這兩種類(lèi)型的相對(duì)比例在國(guó)與國(guó)間有變化(前面的Truyen等；Chinchkar等，Arch.Virol. 151， 1881-1887， 2006 ；Pereira 等，Infect. Genet. Evol. 3， 399-409，2007)。在衣殼蛋白(VP2)中的氨基酸變化，其特征為從2至2a以及至2b的轉(zhuǎn)變，是非常有限的。在 87 (Met 至 Leu)、300 (Gly 至 Ala)、305 (Tyr 至 Asp)和 555 (Val 至 lie)位的替換發(fā)生在2至2a的進(jìn)化中，在426 (Asn至Asp)和555 (lie至Val)的替換發(fā)生在從2a出現(xiàn) 2b 中(前面的 Parrish 等；Truyen 等，J. Virol. 69，4702-4710，1995)。最近，報(bào)道了在 555 位缺乏 Val 至 Ile 替換的 2a 株(Wang 等，VirusGenes 31，171-174，2005 ；Martella等，Virus Genes 33, 11-13，2006)。似乎單一的氨基酸改變可以區(qū)分CPV2a和CPV2b VP2序列。新近，在意大利出現(xiàn)了病毒株，其中426位的氨基酸(2a中為Asn，2b中為Asp)已經(jīng)變?yōu)楣劝彼?Glu)殘基(Buonavoglia 等，J. Gen. Virol. 82，3021-3025，2001 ；Martella 等，J. Clin. Microbiol. 42，1333-1336，2004)。這些被稱(chēng)為 CPV2c 病毒的Glu 426變異體是在意大利和其他歐洲國(guó)家傳播的(circulating)并與其它CPV類(lèi)型共存(Decaro 等，J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472，2006),并且也已經(jīng)在地理上多樣的國(guó)家如越南和蘇格蘭分離得到(Nakamura等，ArchVirol. 149, 2261-2269，2004，Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)，這些事實(shí)表明它們?cè)谥辽僖欢ū壤墓啡后w中具有優(yōu)勢(shì)。犬細(xì)小病毒的相對(duì)快速進(jìn)化已經(jīng)導(dǎo)致貓宿主范圍的丟失以及然后重新獲得(前面的Truyen等，1996)，這種重新獲得的在貓中復(fù)制的能力可以很好地解釋2a、2b和2c變異體對(duì)最初的2型病毒的替代。在二十世紀(jì)七十年代末期和二十世紀(jì)八十年代早期，由于 刺激交叉保護(hù)的共享抗原，活的和滅活的FPL疫苗用于保護(hù)狗免于CPV疾病，然而它們提供的保護(hù)水平較差，免疫持續(xù)時(shí)間較短。這些疫苗被活的減毒CPV疫苗所替代，其提供了優(yōu)異的保護(hù)和更長(zhǎng)的免疫持續(xù)時(shí)間。目前活的減毒疫苗來(lái)自CPV2b分離物或最初的2型病毒。由于2型病毒已經(jīng)在該野外中被2a、2b以及現(xiàn)在的2c病毒完全替代，已經(jīng)考慮到對(duì)于減毒的 2 型疫苗提供的保護(hù)水平(Pratelli 等，Clin. Diag. Lab. Tmmuno1. 8, 612-615，2001 ；Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50，1999)。然而，基于現(xiàn)有的單克隆抗體的研究，與以前的變異體相比，每種新的抗原變異體已經(jīng)失去至少一個(gè)中和表位(Strassheim等，Virology 198, 175-184，1994 ;前面的Pereira等)。以前已經(jīng)表明，即使用針對(duì)各種抗原類(lèi)型產(chǎn)生的血清在體外進(jìn)行的交叉中和研究的確顯示出顯著差異(前面的Pratelli等)，活的減毒的CPV2疫苗能夠保護(hù)狗免于2a 和 2b 野外攻擊(Greenwood 等，Vet. Record. 136, 63-67，1995)。最近顯示，活的減毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能夠保護(hù)狗免于用最近的CPV 變異體 CPV2c 的攻擊(Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)。盡管如此，在該領(lǐng)域中存在著提高動(dòng)物(尤其是貓、狗和豬)免于新型細(xì)小病毒感染的免疫カ的疫苗的需求。然而，未獲得這種疫苗，尤其是未獲得對(duì)于犬細(xì)小病毒2C型特異性的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了對(duì)上述問(wèn)題的解決方案，其在于提供了ー種包含重組細(xì)小病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗，所述重組細(xì)小病毒包含從減毒的第一細(xì)小病毒可獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細(xì)小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被可源自第二細(xì)小病毒(如犬細(xì)小病毒，更具體是2c型細(xì)小病毒)的衣殼蛋白或其片段所替代。令人驚訝的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種疫苗能夠誘導(dǎo)更高滴度的免于第二犬細(xì)小病毒攻擊的保護(hù)性抗體，同時(shí)保持了針對(duì)2型株的良好的免疫力，而重組的犬細(xì)小病毒仍然是減毒的。
發(fā)明詳述
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技術(shù)從野外分離的病毒株獲得編碼第二犬細(xì)小病毒的衣殼蛋白的病毒DNA。在實(shí)施例部分，通過(guò)使用2c型分離物說(shuō)明了這一點(diǎn)。來(lái)自減毒的犬細(xì)小病毒的病毒DNA也是本領(lǐng)域可以獲得的，實(shí)施例顯示了從Intervet (Nobivac parvo)獲得的疫苗株中包含的最初的2型病毒的分離。更具體地，病毒DNA從CPV 2c型野外分離物獲得。用不同的限制性酶消化每種DNA制備物從而使從每種制備物產(chǎn)生兩種重疊的片段。純化并分離片段。然后將選擇的片段轉(zhuǎn)染進(jìn)易感細(xì)胞。這如圖I所圖示。兩種片段天然重組后，獲得了在常規(guī)的減毒的2型病毒的背景下包含2c型分離物的衣殼蛋白的雜合病毒。分離并純化這種病毒，并與藥學(xué)上可接受的載體混合并作為疫苗使用。用CPV2c型病毒的野外分離物和用2型疫苗的親本病毒攻擊接受新疫苗的狗。令人驚訝的是，新的疫苗提供了足夠的針對(duì)常規(guī)的2型分離物的抗體滴度，并提供了針對(duì)2c型CPV的改進(jìn)的保護(hù)?？梢杂欣貙⑦@種疫苗用于保護(hù)狗免于犬細(xì)小病毒、尤其是2c型的感染。更通常地，上述發(fā)現(xiàn)顯示，通過(guò)用第二犬細(xì)小病毒的衣殼區(qū)域或其相關(guān)片段替換第一犬細(xì)小病毒的衣殼區(qū)域，減毒的病毒可作為用于免于另一犬細(xì)小病毒感染的重組疫苗的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明涉及重組細(xì)小病毒，其包括從減毒的第一細(xì)小病毒獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細(xì)小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被源自第二細(xì)小病毒的衣殼蛋白或其片段所替代。來(lái)自第一和第二細(xì)小病毒的衣殼蛋白需要至少ー個(gè)氨基酸不同。在這種背景下的術(shù)語(yǔ)“衣殼蛋白或其片段”是指包含第一和第二細(xì)小病毒之間的衣殼蛋白的差異的全長(zhǎng)衣殼蛋白或其這種部分。優(yōu)選地，用第二細(xì)小病毒的全長(zhǎng)衣殼蛋白替代第一細(xì)小病毒的全長(zhǎng)衣殼蛋白。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)”和“基本上全長(zhǎng)”意在表明，蛋白或核酸序列包含行使其功能所必要的所有的元件，優(yōu)選地，該序列應(yīng)當(dāng)包含天然序列的所有元件(氨基酸或核苷酸)。本發(fā)明的重組細(xì)小病毒可以有利地用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的疫苗中。發(fā)現(xiàn)這種疫苗保護(hù)動(dòng)物免于第一以及第二病毒的感染，而重組疫苗保持減毒從而使它不能誘導(dǎo)任何細(xì)小病毒感染的臨床癥狀。本發(fā)明還涉及用于獲得本發(fā)明的重組細(xì)小病毒的方法，其包括以下步驟
a.從減毒的第一細(xì)小病毒株獲得至少ー種第一DNA片段，所述第一 DNA片段不編碼衣殼蛋白，
b.從第二細(xì)小病毒株獲得至少ー種第二DNA片段，所述第二 DNA片段編碼衣殼蛋白，
c.用步驟a和b中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)染對(duì)于細(xì)小病毒容許(permissive)的細(xì)胞，
d.允許DNA片段重組，
e.在第一細(xì)小病毒的基因組的遺傳背景中篩選編碼源自第二細(xì)小病毒的病毒衣殼蛋白的減毒的重組病毒，f.在允許在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)細(xì)小病毒的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，
g.從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得重組細(xì)小病毒。優(yōu)選地，細(xì)小病毒是犬細(xì)小病毒，甚至更優(yōu)選地，第一細(xì)小病毒是2型犬細(xì)小病毒，第二犬細(xì)小病毒是2c型犬細(xì)小病毒；這導(dǎo)致產(chǎn)生保護(hù)狗免于2型以及2c型感染、同時(shí)保持其減毒特性的疫苗。為了明確地顯示減毒位點(diǎn)不在衣殼蛋白中，用化學(xué)合成的版本替代減毒株中的衣殼蛋白基因，所述化學(xué)合成的版本的序列源自強(qiáng)毒的2c野外分離物。這種方法也產(chǎn)生了根據(jù)本發(fā)明的減毒病毒。
圖I :獲得雜合的2/2c病毒分離物的天然重組(非GM)方法的示意圖。將源自2型疫苗和2c型野外病毒的兩種重疊片段轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，并在同源重組后分離病毒。圖2 :顯示限制性酶位點(diǎn)Pac I和Xmn I的CPV株154att的感染性質(zhì)?？寺〉氖疽鈭D。陰影方框表示末端回文序列。圖3 :顯示選擇用于進(jìn)ー步操作的部分Pac I/Xmn I消化的選擇的產(chǎn)物的示意圖。圖4 :包含其中衣殼基因被強(qiáng)毒的CPV2c衣殼序列替代的154att疫苗病毒DNA的質(zhì)粒。
實(shí)施例實(shí)施例I 重組病毒的產(chǎn)牛
從商售的 Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)獲得 154att株，Jess株是2c型病毒的野外分離物。使用包含5%胎牛血清的M6B8培養(yǎng)基使病毒生長(zhǎng)在貼壁的犬或貓腎細(xì)胞(如A72 & CrFK)上。用標(biāo)準(zhǔn)“Hirt”法的修改方法從被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物制備復(fù)制形式(RF)DNA(McMaster 等 1981)。用限制性酶PstI消化從154 att株制備的RF DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離片段。從凝膠切出3055堿基對(duì)(bp)條帶(對(duì)應(yīng)于CPV的左手末端)并用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化。用限制性酶XmnI消化從CPV Jess感染的細(xì)胞分離的RF DNA。再次通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,隨后用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化約2750 bp條帶(對(duì)應(yīng)于包括衣殼序列的CPV的右手末端)。將來(lái)自154att和Jess的純化的3055 bp和2750bp片段合并并轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)中的A72或CrFK細(xì)胞。根據(jù)廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將約3Mg的姆種片段進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，傳代細(xì)胞并用血凝(HA)分析法監(jiān)測(cè)。在第4代時(shí)用HA檢測(cè)病毒。使用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序方法，用RF DNA或PCR片段模板進(jìn)行雜合病毒的DNA序列測(cè)定。通過(guò)有限稀釋法純化在貼壁的易感犬或貓細(xì)胞上的病毒。實(shí)施例2:從克隆的病毒DNA構(gòu)建的重組病毒
從克隆的片段產(chǎn)生重組病毒。將病毒株154att的基因組克隆進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體pBluescript (Stratagene inc.)。為了保持回文末端序列完整,將質(zhì)粒在許多重組系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌宿主DL795中繁殖。細(xì)小病毒基因組的克隆已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述，所需的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。用限制性酶Pac I消化獲得的154att的克隆(pl54)而不允許消化完整進(jìn)行，即限制性酶消化僅僅是部分的。然后使消化的片段經(jīng)受限制性酶Xmn I的消化。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離消化的DNA片段，從凝膠切出下圖中所示的片段，并用Qiagen Qiaquick凝膠提取柱純化。Xmn I和右手的Pac位點(diǎn)位于細(xì)小病毒基因組中的衣殼區(qū)域的兩側(cè)。如下用CPV的強(qiáng)毒株的衣殼基因替代154 att的衣殼基因。圖2中所示的Xmn I位點(diǎn)和右手的Pac I位于衣殼基因的邊界之外。Pac I位點(diǎn)和衣殼基因的末端之間約IlObp 序列在154att株和強(qiáng)毒的分離物之間差異顯著。在Xmn I位點(diǎn)和衣殼基因的起始處之間的短序列( 55 bp)中還沒(méi)有記錄到序列改變。因此，為了將物質(zhì)的交換僅僅限制在衣殼序列；化學(xué)合成了強(qiáng)毒的CPV衣殼序列，保留了 PacI位點(diǎn)和衣殼終止信號(hào)之間的疫苗特異性序列。下面，顯示了包含CPV衣殼基因的化學(xué)合成的序列。下面所示的序列在本文作為SEQ ID NO 1 提供。
權(quán)利要求
1.一種減毒的重組細(xì)小病毒，其包含從減毒的第一細(xì)小病毒可獲得的DNA序列，其中編碼所述第一細(xì)小病毒的衣殼蛋白或其片段的DNA被可源自第二細(xì)小病毒的衣殼蛋白或其片段所替代。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組細(xì)小病毒，其中所述從減毒的第一細(xì)小病毒可獲得的DNA序列基本上是全長(zhǎng)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組細(xì)小病毒，其中源自所述第二細(xì)小病毒的所述衣殼蛋白基本上是全長(zhǎng)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的重組細(xì)小病毒，其中所述細(xì)小病毒選自犬細(xì)小病毒、貓細(xì)小病毒和豬細(xì)小病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的重組細(xì)小病毒，其中所述第一細(xì)小病毒是2型犬細(xì)小病毒和/或其中所述第二細(xì)小病毒是2c型犬細(xì)小病毒。
6.用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的疫苗，所述疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的重組細(xì)小病毒和藥學(xué)上可接受的載體。
7.用于獲得根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的重組細(xì)小病毒的方法，其包括以下步驟 a.從不編碼衣殼蛋白的減毒的第一細(xì)小病毒株獲得至少ー種DNA片段， b.從編碼衣殼蛋白的第二細(xì)小病毒株獲得至少ー種DNA片段， c.用步驟a和b中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)染對(duì)于細(xì)小病毒容許的細(xì)胞， d.允許DNA片段重組， e.在第一細(xì)小病毒的基因組的遺傳背景中篩選編碼源自第二細(xì)小病毒的病毒衣殼蛋白的減毒的重組病毒， f.在允許在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)細(xì)小病毒的條件下培養(yǎng)細(xì)胞， g.從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得重組細(xì)小病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)小病毒選自犬細(xì)小病毒、貓細(xì)小病毒和豬細(xì)小病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一細(xì)小病毒是2型犬細(xì)小病毒株以及所述第二細(xì)小病毒是2c型犬細(xì)小病毒株。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述細(xì)小病毒是犬細(xì)小病毒株，尤其是2c型犬細(xì)小病毒。
全文摘要
本發(fā)明屬于用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的病毒疫苗、它們的生產(chǎn)和用途的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及包含減毒細(xì)小病毒的疫苗，所述減毒細(xì)小病毒包括可源自另一種細(xì)小病毒的衣殼蛋白及其片段。令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)這種疫苗能夠誘導(dǎo)更高滴度的免于第二種類(lèi)型的細(xì)小病毒株攻擊的保護(hù)性抗體，同時(shí)保持針對(duì)第一種類(lèi)型的細(xì)小病毒的良好的免疫力。重組病毒株也仍然是減毒的。
文檔編號(hào)A61K39/23GK102791288SQ201180012606
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月5日
發(fā)明者N.斯皮貝 申請(qǐng)人:英特維特國(guó)際股份有限公司