專利名稱：一種生物堿及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物堿及制備和應用，具體涉及一種從藥用植物黃花蒿(Artemisia annuaLinn.)莖部提取的內(nèi)生真菌煙曲霉 SPS-02 (Aspergillus fumigatus)液體發(fā)酵物中分離的一種新生物堿及其制備方法與逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的應用，該化合物可以與抗腫瘤藥物作用提高逆轉效果，從而為臨床上治療多藥耐藥性腫瘤提供新的方法和手段。背景技術：
微生物與人類息息相關，其活性次生代謝產(chǎn)物如抗生素已被廣泛研究和應用。植物內(nèi)生菌是一種分布廣、種類多、具有重要生理和生態(tài)作用的特境微生物，其活性次生代謝產(chǎn)物已成為天然產(chǎn)物化學領域和應用微生物領域的研究熱點。惡性腫瘤是威脅人類健康、導致死亡的重要原因之一，化學治療是其治療的主要手段，然而腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)是影響化療效果的重要原因之一。MDR是指腫瘤細胞接觸一種抗腫瘤藥物后產(chǎn)生耐藥性，同時對結構和作用機理不同的多種抗腫瘤藥物表現(xiàn)出交叉抵抗現(xiàn)象。MDR是腫瘤細胞耐藥的常見方式，也是腫瘤難治療、易復發(fā)的主要原因。理想的MDR逆轉劑應具有一定的抗腫瘤活性，且對正常組織細胞毒性小，在體內(nèi)及腫瘤細胞內(nèi)能達到有效濃度。然而，一些經(jīng)典的MDR逆轉劑具有嚴重的毒副作用，如維拉帕米產(chǎn)生心血管疾病、valsodar與細胞色素P45tl同工酶3A4產(chǎn)生競爭性抑制等，所以這些藥物無法應用于臨床。因此，尋找安全、高效、低毒的腫瘤細胞MDR逆轉劑成為當今藥物研發(fā)的熱點之一。植物內(nèi)生菌具有豐富的生物多樣性和化學多樣性，能夠產(chǎn)生化學結構獨特、活性顯著的物質(zhì)。到目前為止，尚未見從黃花蒿內(nèi)生菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)分離到新逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性生物堿的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的新生物堿，以及該生物堿的提取分離方法，在制備腫瘤細胞多藥耐藥性逆轉劑中的應用。本發(fā)明采用的技術方案是:本發(fā)明涉及一種式(I )所示生物堿，命名為16-β-hydroxy-5-N-acetylardeemin(16- β -羥基-5-Ν-乙?；?阿迪米):
權利要求
1.一種式(I)所示生物堿，
2.一種用于權利要求1所述生物堿提取的煙曲霉SPS-02，其特征在于所述煙曲霉(Aspergillusfumigatus)SPS-02保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏日期為2013年I月13日，保藏編號為CCTCCN0:M2013014。
3.—種如權利要求1所述生物堿的制備方法，其特征在于所述方法為:將保藏編號為CCTCC N0:M2013014即煙曲霉SPS-02發(fā)酵培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液過濾或離心，取濾液或上清液用乙酸乙酯在室溫下進行萃取，取有機層低溫真空濃縮，獲得浸膏F，將浸膏F進行分離純化，獲得所述生物堿；所述浸膏F分離純化方法為:(I)將浸膏F進行硅膠柱層析，用1(Γ15倍柱體積的氯仿進行洗脫，收集洗脫液，低溫真空濃縮，獲得浸膏Fl ;(2)將浸膏Fl進行硅膠柱層析，用3飛倍柱體積的氯仿進行洗脫，合并所有洗脫液，低溫真空濃縮，獲得浸膏F2 ；(3)利用葡聚糖凝膠S印hadex LH-20對浸膏F2進行柱層析，洗脫劑為體積比1:1的氯仿和甲醇混合液，TLC跟蹤檢測含有藍色熒光點的部分，收集該部分洗脫液，合并洗脫液后低溫真空除去洗脫劑，得到浸膏F3 ； (4)浸膏F3采用反相高效液相色譜分離，流動相為體積比1:1.5的雙蒸水和甲醇混合液，收集保留時間Ilmin時的洗脫液，低溫真空除去流動相得到式(I)所示的生物堿。
4.如權利要求3所述生物堿的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)液的制備方法為:(I)斜面培養(yǎng):將煙曲霉SPS-02接種至斜面培養(yǎng)基，28 30°C培養(yǎng)7 10天，獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:馬鈴薯20g/L、瓊脂20g/L，溶劑為水，自然pH值；(2)種子培養(yǎng):從菌體斜面挑取一接種環(huán)菌體接種至H)培養(yǎng)基，在10(Tl50rpm、28 30°C條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，獲得種子液；所述H)培養(yǎng)基終濃度組成為:土豆200g/L、葡萄糖20g/L，溶劑為水，自然PH值；(3)發(fā)酵培養(yǎng) :將步驟(2)獲得的種子液以體積比1:10的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在140rpm、28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)15天，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:蔗糖 30g/L, NaN033g/L，K2HP04lg/L，酵母膏 lg/L，KC10.5g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，F(xiàn)eSO4.7Η200.01g/L，溶劑為水，自然 pH 值。
5.一種權利要求1所述生物堿在制備腫瘤細胞多藥耐藥性逆轉劑中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的應用為:所述生物堿在制備白血病阿霉素耐藥細胞、人肺腺癌順鉬耐藥細胞或人卵巢癌順鉬耐藥細胞耐藥性逆轉劑中的應用。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述生物堿在腫瘤細胞多藥耐藥性逆轉劑中的濃度為5 10 μ Mo
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述生物堿在腫瘤細胞多藥耐藥性逆轉劑中的濃度為5 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種式(Ⅰ)所示生物堿及制備方法和在制備腫瘤細胞多藥耐藥性逆轉劑中的應用，本發(fā)明提供一種生物堿，可作為具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的新藥物或先導化合物，對白血病阿霉素耐藥細胞(K562/ADR)、人肺腺癌/順鉑耐藥細胞(A549/DDP)和人卵巢癌/順鉑耐藥細胞(SK-OV-S/DDP)有很強的逆轉作用；本發(fā)明的生物堿可以利用微生物進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，操作工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證；本發(fā)明利用生物法合成，對環(huán)境無污染；
文檔編號A61P35/00GK103113376SQ20131004453
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權日2013年2月4日
發(fā)明者章華偉, 應晨, 湯逸飛 申請人:浙江工業(yè)大學