專利名稱：一種鼻用型胰島素制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非注射型胰島素技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種鼻用型胰島素制劑；并涉及該鼻用型胰島素制劑的制備方法；同時(shí)還涉及該鼻用型胰島素制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰島素的生理和藥理胰島素是一種由胰島P細(xì)胞分泌的含有51個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)激素，分子量為5808道爾頓，參與調(diào)節(jié)糖代謝，控制血糖水平。體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足可導(dǎo)致糖尿病，主要臨床表現(xiàn)為“三多一少”(多飲、多尿、多食和體重下降)以及尿糖、 高血糖和多種并發(fā)癥等。中國(guó)目前約有六千萬糖尿病患者，其中很多人需要終生(如I型糖尿病患者)或長(zhǎng)期頻繁(如部分II型糖尿病患者)利用外源性胰島素來調(diào)控血糖水平， 以防止血糖過高或過低引發(fā)的嚴(yán)重臨床并發(fā)癥。胰島素的使用現(xiàn)狀及問題胰島素療法的最常用給藥方式為皮下注射。患者需要每日2-4次在餐前注射速效胰島素，并輔以睡前注射適量中長(zhǎng)效胰島素。長(zhǎng)期反復(fù)局部注射不但容易形成瘢痕組織和過敏反應(yīng)，影響藥物的吸收，而且會(huì)使患者感到疼痛、產(chǎn)生厭煩情緒，甚至不遵醫(yī)囑而導(dǎo)致并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。長(zhǎng)期以來研究者一直試圖開發(fā)安全、方便、有效的非注射給藥方式的胰島素制劑。非注射型胰島素制劑的種類和不足之處目前提出的替代性給藥方案包括經(jīng)肺、 透皮、口服、經(jīng)腸、舌下和經(jīng)鼻等途徑給予治療性胰島素制劑。肺部吸入法首推美國(guó)輝瑞公司的Exubera肺部干粉吸入劑。但它上市后不久即被撤回，主要是考慮到長(zhǎng)期使用對(duì)肺功能的潛在損傷，且其相對(duì)生物利用率僅為皮下注射的10-20%。雖然患者較易接受口服腸溶制劑，但能夠完全耐受蛋白水解酶的胰島素制劑尚未開發(fā)出來，而且胰島素自身難以透過消化道粘膜上皮。其他一些替代性給藥方案也有各自的缺點(diǎn)。例如直腸給藥不衛(wèi)生不方便、透皮給藥的生物利用率極低、舌下制劑中含有潛在不良的外來化合物等。胰島素經(jīng)鼻給藥的可行性和關(guān)鍵點(diǎn)已知鼻腔粘膜表面積達(dá)150平方厘米，且大量細(xì)微絨毛可增加有效吸收面積。如果藥物能夠滲透鼻腔粘膜上皮細(xì)胞，則可迅速地被鼻腔粘膜層內(nèi)豐富的毛細(xì)血管和淋巴管吸收，比皮下注射方式更快地進(jìn)入全身血液循環(huán)。由于胰島素滲透鼻腔粘膜上皮細(xì)胞的能力有限，故普通胰島素經(jīng)鼻給藥的相對(duì)生物利用率極低(僅為皮下注射的1_2%)。因此，增加鼻腔粘膜上皮細(xì)胞對(duì)胰島素的通透性是研發(fā)胰島素鼻內(nèi)給藥制劑的關(guān)鍵點(diǎn)。各種胰島素經(jīng)鼻給藥制劑的專利檢索經(jīng)“中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利檢索”， 發(fā)現(xiàn)9項(xiàng)與鼻用型胰島素制劑相關(guān)的專利申請(qǐng)。申請(qǐng)人為中國(guó)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 (200510028990. 0 ；200510028991. 5 ；200710173622. 4 ；200810035771. 9)、日本株式會(huì)社 DDS研究所(01801146. 2)和產(chǎn)業(yè)化研究株式會(huì)社(02804546. 7)、以及美國(guó)納斯泰克制藥公司(200680047851. 5)和 CPEX 藥品公司(200780028627. 6 ；200980121227. 9)。他們分別使用多孔球狀碳酸鈣、結(jié)晶纖維素多聚體、油脂、乳化劑、增溶劑、大環(huán)類滲透劑和表面活性劑等化學(xué)制劑來增加胰島素滲透鼻腔粘膜上皮細(xì)胞的能力。由于這些外來化合物及代謝產(chǎn)物
4大多不存在于正常機(jī)體內(nèi)，它們對(duì)鼻粘膜的潛在刺激性和進(jìn)入體內(nèi)后可能產(chǎn)生的慢性毒性頗值得關(guān)注。此外，這些發(fā)明專利申請(qǐng)說明書要么未公布其胰島素經(jīng)鼻給藥制劑的相對(duì)生物利用率，要么所得到的相對(duì)生物利用率很低，結(jié)果導(dǎo)致有效治療劑量與最低中毒劑量之間的安全范圍很小。例如，多孔球狀碳酸鈣/胰島素制劑的相對(duì)生物利用率僅為5. 69%。 這些發(fā)明尚未能滿足糖尿病臨床治療的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種鼻用型胰島素制劑。該制劑主要由細(xì)胞滲透肽、胰島素和液相載體三種原料組成，為一種以鼻部給藥方式將治療用胰島素輸入患者體內(nèi)的復(fù)合制劑。其優(yōu)點(diǎn)是制劑中的胰島素易于透過鼻腔粘膜屏障，相對(duì)藥物吸收率(血胰島素濃度)約80%，生物利用率(降血糖效應(yīng))達(dá)60%以上，遠(yuǎn)高于目前在研的其它非注射型胰島素制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供一種鼻用型胰島素制劑的制備方法。該制劑的主要制備步驟是將細(xì)胞滲透肽和胰島素以恰當(dāng)濃度溶于液相載體。操作安全簡(jiǎn)便，重復(fù)性非常好，質(zhì)量控制容易。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供一種鼻用型胰島素制劑在調(diào)控血液中葡萄糖水平中的應(yīng)用。可用鼻內(nèi)噴霧給藥器將治療劑量的該制劑施布于患者的鼻腔粘膜表面，使用方便，無疼痛感，對(duì)鼻腔粘膜無刺激，體內(nèi)可快速降解為氨基酸，安全性高。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是許多具有潛在治療作用的生物大分子難以用于臨床，究其原因是細(xì)胞膜對(duì)這些分子的通透性很低。過去10多年來，多種細(xì)胞滲透肽作為一類傳遞系統(tǒng)相繼被開發(fā)出來，它們具有穿過哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的能力，且不受能量和受體的約束，成為促進(jìn)或攜帶多種藥物分子(包括化學(xué)小分子、生物大分子和納米顆粒等受載物)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的新工具。細(xì)胞滲透肽是由幾個(gè)到二十幾個(gè)氨基酸組成的多肽分子，含有數(shù)個(gè)堿性氨基酸和親水(極性)/疏水(非極性)兩性基團(tuán)。它們能以非共價(jià)鍵形式與受載物形成穩(wěn)定的復(fù)合物，幫助后者以高效無害的方式透過組織上皮細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。此外，進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)胞滲透肽很快被蛋白酶降解為普通的氨基酸分子，而不產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物。 細(xì)胞滲透肽的研究進(jìn)展極大地加快了質(zhì)粒DNA、寡核苷酸、SiRNA、肽核酸、肽和蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)體納米顆粒等生物大分子類藥物的開發(fā)和應(yīng)用。申請(qǐng)人將31種細(xì)胞滲透肽及類似物與各種胰島素在不同條件下進(jìn)行反應(yīng)，得到各種各樣的組合物。然后經(jīng)過大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，測(cè)試每一組合物經(jīng)鼻給藥的藥物吸收率和生物利用率，篩選優(yōu)化出一類鼻用型胰島素制劑。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有高生物利用率、無粘膜刺激性和慢性毒性的鼻用型胰島素制劑。一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑，它由下述溶于液相載體中的原料共同組成細(xì)胞滲透肽 0. 02-2納摩爾/微升液相載體；胰島素0. 001-0. 5國(guó)際單位/微升液相載體；該胰島素制劑是一種以鼻部給藥方式將治療用胰島素輸入患者體內(nèi)的復(fù)合制劑， 主要成分為液相載體、胰島素和細(xì)胞滲透肽。具體描述如下
I、所述的制劑中液相載體為(但不限于)醫(yī)用無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液或人工腦脊液，PH值為6. 5-7. 5，其配制方法如下I)生理鹽水取氯化鈉9克，加水至1000毫升。2)磷酸緩沖液將0. 2摩爾/升的磷酸氫二鈉水溶液610毫升與0. 2摩爾/升的磷酸二氫鈉水溶液390毫升混勻，即成0. 2摩爾/升的磷酸緩沖液1000毫升，pH7. O。3)人工腦脊液取氯化鈉6. 279克，氯化鉀0. 216克，氯化鈣0. 353克，氯化鎂 0. 488克，碳酸氫鈉I. 932克，葡萄糖0. 6克，磷酸氫二鈉0. 358克，加水至1000毫升，通入含95%氧與5%二氧化碳混合氣體至飽和，pH7. 3-7. 4。2、所述的制劑中胰島素為具有生物活性(能調(diào)節(jié)血糖水平)的胰島素，例如(但不限于)天然胰島素、人工胰島素、胰島素前體、胰島素類似物或胰島素代謝物。3、所述的制劑中細(xì)胞滲透肽由CS936X多肽合成儀制備，它是一類含有12_22個(gè)氨基酸的多肽分子，其中精氨酸和賴氨酸是維持細(xì)胞滲透功能的重要成分。該細(xì)胞滲透肽的第一種基本形態(tài)為Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys在不改變精氨酸和賴氨酸位置的情況下，上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽可調(diào)整為第二種基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys以上兩種基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽序列可進(jìn)一步調(diào)整如下(但不限于下例)I)將氨基端前半段與羧基端后半段的位置互換后，上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲肽序列可調(diào)整為He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln ;或Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln2)經(jīng)逆向排序，上述基本形態(tài)的的細(xì)胞滲透肽序列可調(diào)整為L(zhǎng)ys Lys Asn Lys Trp Arg Arg He Gln Met Gln He Lys Phe Trp Arg ;或Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp He Lys He Gln Arg3)將精氨酸與賴氨酸互換，上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽序列可調(diào)整為L(zhǎng)ys Trp Phe Arg He Gln Met Gln He Lys Lys Trp Arg Asn Arg Arg ;或Lys Gln He Arg He Trp Phe Gln Asn Lys Lys Met Arg Trp Arg Arg4)在上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽的羧基端，加上I至6個(gè)甘氨酸或非特定氨基酸， 可形成含有17-22個(gè)氨基酸的細(xì)胞滲透肽Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys加上 1-6 個(gè)Gly或非特定氨基酸；或Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 加上 I 6個(gè)Gly或非特定氨基酸。5)在上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽的羧基端，加上I至6個(gè)精氨酸或非特定氨基酸Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys加上 1-6 個(gè)Arg或非特定氨基酸；或Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys加上 1-6個(gè)Arg或非特定氨基酸。6)在上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽的羧基端，加上I至6個(gè)非特定的氨基酸Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys加上 1-6 個(gè)非特定氨基酸；或Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys加上 1-6
個(gè)非特定氨基酸。7)從上述基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽中，去掉1-4個(gè)氨基酸Arg Trp Phe Lys He Gln Gln Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys ;或Arg Gln He Lys He Trp Gln Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys8)將上述各種細(xì)胞滲透肽中的30%氨基酸進(jìn)行調(diào)整之后，所形成的新的細(xì)胞滲透肽。一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑，它由下述溶于液相載體中的原料共同組成 (較好范圍)細(xì)胞滲透肽 0. 05-1. 0納摩爾/微升液相載體胰島素0. 005-0. 4國(guó)際單位/微升液相載體一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑，它由下述溶于液相載體中的原料共同組成 (優(yōu)選范圍)細(xì)胞滲透肽 0. 1-0. 6納摩爾/微升液相載體胰島素0. 015-0. 3國(guó)際單位/微升液相載體一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑，它由下述溶于液相載體中的原料共同組成 (最好范圍)細(xì)胞滲透肽 0. 2-0. 4納摩爾/微升液相載體胰島素0. 03-0. 2國(guó)際單位/微升液相載體一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑，它由下述溶于液相載體中的原料共同組成 (最佳值)細(xì)胞滲透肽 0. 3納摩爾/微升液相載體胰島素0. I國(guó)際單位/微升液相載體一種可供治療用的鼻用型胰島素制劑的制備方法，其步驟是I、在室溫(22±2°C，以下相同)下，準(zhǔn)確稱取200國(guó)際單位的胰島素粉末，置于一支5暈升的小試管內(nèi)；2、將200微升0. I當(dāng)量的鹽酸溶液緩慢地加入上述小試管內(nèi)，輕搖，溶解胰島素粉末；3、然后加入I. 6毫升液相載體進(jìn)行稀釋，輕搖混勻；4、用200微升0. I當(dāng)量的氫氧化鈉將上述含有胰島素的溶液調(diào)至pH6. 8-7. 2 ；5、另外準(zhǔn)確稱取600納摩爾的細(xì)胞滲透肽，置于另一支5毫升的小試管內(nèi)；6、用微量移液器將上述胰島素溶液緩慢地轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞滲透肽的小試管內(nèi)，輕搖混勻30分鐘；7、用不吸附蛋白質(zhì)的0. 45微米孔徑的濾膜過濾上述含有細(xì)胞滲透肽的胰島素溶液；
8、將過濾后的鼻用型胰島素制劑收集到一密封的無菌給藥器內(nèi)；9、置于低溫(4±1°C )保存?zhèn)溆?；或置于冷?_20°C或_80°C )長(zhǎng)期保存?！N可供治療用的鼻用型胰島素制劑的應(yīng)用方法，其步驟是I、將鼻用型胰島素制劑置于鼻內(nèi)噴霧式或滴注式給藥器中；2、將治療劑量的胰島素制劑施布于患者的鼻腔粘膜表面；3、每次施布的制劑體積為100(50-200)微升；4、每次施布的制劑中，胰島素劑量為10(5-20)國(guó)際單位；5、每次施布的制劑中，細(xì)胞滲透肽劑量為30(15-60)納摩爾；6、于施布前后，定時(shí)監(jiān)測(cè)血糖水平。技術(shù)特征本發(fā)明的鼻用型胰島素制劑中含有由特定氨基酸序列組成的細(xì)胞滲透肽，它可高效地幫助胰島素穿透鼻腔粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)入全身血液循環(huán)，調(diào)控血糖水平。作為一種全新的胰島素經(jīng)鼻吸收促進(jìn)劑，本發(fā)明鼻用型胰島素制劑中的細(xì)胞滲透肽與其它細(xì)胞滲透促進(jìn)劑相比，具有完全不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，可使制劑中的胰島素產(chǎn)生高得多的藥物吸收率和生物利用率。該細(xì)胞滲透肽和鼻用型胰島素在透過鼻腔粘膜上皮細(xì)胞時(shí)，以及在進(jìn)入全身血液循環(huán)后，具有如下技術(shù)特征。I、細(xì)胞滲透肽結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)胰島素的能力相關(guān)本發(fā)明所用兩種基本形態(tài)的細(xì)胞滲透肽經(jīng)過適當(dāng)調(diào)整(包括重新排序、加長(zhǎng)或縮短)后，其胰島素制劑的相對(duì)藥物吸收率和相對(duì)生物利用率有一定程度(10-30%)的變化。2、細(xì)胞滲透肽濃度與胰島素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率相關(guān)當(dāng)細(xì)胞滲透肽在鼻用型胰島素制劑中的濃度范圍為0. 02-2納摩爾/微升時(shí)，血中胰島素水平與細(xì)胞滲透肽濃度呈正相關(guān)。 考慮到成本與效益關(guān)系以及制劑中各種成分配比，細(xì)胞滲透肽濃度的最好范圍為0. 2-0. 4 納摩爾/微升。3、細(xì)胞滲透肽可快速轉(zhuǎn)運(yùn)各種胰島素將細(xì)胞滲透肽分別與不同的重組人胰島素、胰島素類似物或天然豬胰島素組合，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明這幾種不同組合物經(jīng)鼻給藥十分鐘后，血中胰島素水平明顯升高，三十分鐘開始產(chǎn)生顯著的降血糖效應(yīng)。4、鼻用型胰島素制劑可產(chǎn)生較高的胰島素相對(duì)藥物吸收率與相同劑量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或腹腔注射相比，細(xì)胞滲透肽濃度為0. 2-0. 4納摩爾/微升的鼻用型胰島素制劑可產(chǎn)生高達(dá)80%的相對(duì)藥物吸收率。5、鼻用型胰島素制劑可產(chǎn)生較高的胰島素相對(duì)生物利用率與相同劑量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或腹腔注射相比，細(xì)胞滲透肽濃度為0. 2-0. 4納摩爾/微升的鼻用型胰島素制劑可產(chǎn)生高達(dá)60%的相對(duì)生物利用率。6、細(xì)胞滲透肽可在體內(nèi)迅速被降解而失活經(jīng)靜脈給藥后，同位素標(biāo)記的細(xì)胞滲透肽在血液循環(huán)中的半衰期小于60分鐘，主要經(jīng)肝臟和腎臟降解代謝。7、細(xì)胞滲透肽可溶于多種液相載體在室溫下，細(xì)胞滲透肽可單獨(dú)溶于pH值為中性(6. 5-7. 5)的等滲生理鹽水或磷酸緩沖液；亦可與治療劑量的胰島素混溶于上述液相載體。8、細(xì)胞滲透肽可在低溫下長(zhǎng)期保存細(xì)胞滲透肽與胰島素的混合應(yīng)用液在低溫 (4°C )下存放二個(gè)月，其生物學(xué)活性無明顯改變。
9、鼻用型胰島素制劑未對(duì)鼻腔粘膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生刺激性鼻用型胰島素制劑未影響離體粘膜組織纖毛的完整性和運(yùn)動(dòng)；在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻給藥對(duì)鼻腔粘膜無刺激，未改變鼻腔粘膜上皮細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)。10、細(xì)胞滲透肽未對(duì)體內(nèi)組織器官產(chǎn)生急性和慢性損傷細(xì)胞滲透肽未對(duì)心、肝、 脾、肺、腎、腦、胃、腸、肌肉和生殖等主要臟器結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生明縣的急慢性損傷。11、鼻用型胰島素制劑反復(fù)多次使用后的生物效應(yīng)穩(wěn)定且有規(guī)律對(duì)同一受試動(dòng)物每日一次、連續(xù)一周使用鼻用型胰島素，降血糖的效果穩(wěn)定，而且重復(fù)性好。12、細(xì)胞滲透肽和鼻用型胰島素的上述特征被至少兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所證實(shí)組織細(xì)胞的離體實(shí)驗(yàn)，以及小鼠和大鼠在體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了細(xì)胞滲透肽和鼻用型胰島素制劑的上述特征。13、人體的初步試驗(yàn)結(jié)果顯示空腹時(shí)給予健康志愿者5國(guó)際單位的鼻用型胰島素制劑，可使血糖水平降低約20%。進(jìn)餐前給予健康志愿者5國(guó)際單位的鼻用型胰島素制劑，可使餐后血糖水平升高值減少約70%。根據(jù)上述技術(shù)特征和以下具體實(shí)施結(jié)果，可知本發(fā)明的創(chuàng)造性在于I、首次將合適結(jié)構(gòu)的細(xì)胞滲透肽用于制備非注射型胰島素制劑；2、確定了細(xì)胞滲透肽濃度、胰島素用量和生物效應(yīng)之間的關(guān)系；3、建立了鼻用型胰島素制劑的制備方法；4、探討了制劑中胰島素的相對(duì)藥物吸收率和相對(duì)生物利用率；5、檢測(cè)了制劑中細(xì)胞滲透肽的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，以及對(duì)局部和全身的急慢性毒作用；6、最終獲得了具有臨床應(yīng)用潛力的鼻用型胰島素制劑。本發(fā)明的鼻用型胰島素制劑可替代皮下注射方式，經(jīng)鼻內(nèi)噴霧式或滴注式給藥， 用于治療糖尿病患者。每次使用量為100微升(50至200微升)，內(nèi)含胰島素10(5-20)國(guó)際單位。具體使用由醫(yī)師根據(jù)患者病情等因素來決定。


圖I為一種含有16個(gè)氨基酸的細(xì)胞滲透肽的色譜分析圖像，反映了產(chǎn)物的純度。圖2為一種含有16個(gè)氨基酸的細(xì)胞滲透肽的質(zhì)譜分析圖像，反映了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。圖3為一種細(xì)胞滲透肽促進(jìn)胰島素經(jīng)鼻吸收的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了細(xì)胞滲透肽含量在一定范圍內(nèi)可促進(jìn)胰島素經(jīng)實(shí)驗(yàn)大鼠鼻腔粘膜吸收，迅速增加血中胰島素濃度。圖4為一種細(xì)胞滲透肽幫助胰島素降低血糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了細(xì)胞滲透肽可促進(jìn)不同的胰島素(如人胰島素和豬胰島素)經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠鼻腔粘膜吸收，降低血中葡萄糖水平。圖5為一種鼻用型胰島素制劑吸收效率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了鼻用型胰島素比皮下注射胰島素的藥物吸收速度稍快(給藥后20分鐘之內(nèi))，相對(duì)藥物吸收率為80%。圖6為一種鼻用型胰島素制劑降糖效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了鼻用型胰島素可產(chǎn)生與皮下注射胰島素相似的降血糖效果和持續(xù)時(shí)間，相對(duì)生物利用率為60-70%。圖7為一種細(xì)胞滲透肽在體內(nèi)代謝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果上圖顯示了血中細(xì)胞滲透肽的半衰期很短，腦中細(xì)胞滲透肽的含量極低；下圖顯示了進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)胞滲透肽主要在肝、腎中蓄積和降解。圖8為兩種細(xì)胞滲透肽幫助胰島素降低血糖的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了第一種基本型態(tài)的細(xì)胞滲透肽(16個(gè)氨基酸)比另一種調(diào)整后的細(xì)胞滲透肽(18個(gè)氨基酸)更能促進(jìn)胰島素經(jīng)鼻吸收、降低血糖水平，兩者的差異約為20%。圖9為一種鼻用型胰島素制劑存放條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了鼻用型胰島素制劑在低溫(4°C)下存放1-60天后仍維持原有的降血糖能力(血中葡萄糖水平)和時(shí)間效應(yīng)(給藥后30-120分鐘)。圖10為一種受試動(dòng)物對(duì)多次給藥的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示了實(shí)驗(yàn)小鼠每日一次， 連續(xù)五天接受鼻用型胰島素制劑，始終保持對(duì)胰島素降糖效應(yīng)的敏感性。每日的分圖(從第一日到第五日)顯示相似的降血糖能力(血中葡萄糖水平)和時(shí)間效應(yīng)(給藥后30-240 分鐘)。
具體實(shí)施例方式以下用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受此限制。實(shí)施例I :用人胰島素制備實(shí)驗(yàn)用的鼻用型胰島素制劑。表一、一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用的鼻用型胰島素制劑，它由溶于磷酸緩沖液的下列成分和濃度組成。
權(quán)利要求
1.一種胰島素制劑，它由以下溶解于液相載體中的原料共同組成細(xì)胞滲透肽 O. 02-2納摩爾/微升液相載體；胰島素O. 001-0. 5國(guó)際單位/微升液相載體；1)所述的制劑中液相載體為醫(yī)用無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液或人工腦脊液，PH值為6. 5-7. 5，其配制方法如下a)生理鹽水取氯化鈉9克，加水至1000毫升；b)磷酸緩沖液將O.2摩爾/升的磷酸氫二鈉水溶液610毫升與O. 2摩爾/升的磷酸二氫鈉水溶液390毫升混勻，即成O. 2摩爾/升的磷酸緩沖液1000毫升，pH7. O ；c)人工腦脊液取氯化鈉6.279克，氯化鉀O. 216克，氯化鈣O. 353克，氯化鎂O. 488 克，碳酸氫鈉I. 932克，葡萄糖O. 6克，磷酸氫二鈉O. 358克，加水至1000毫升，通入含95% 氧與5%二氧化碳混合氣體至飽和，pH7. 3-7. 4 ；2)所述的胰島素為具有生物活性的胰島素，為天然胰島素、人工胰島素、胰島素前體、 胰島素類似物或胰島素代謝物；3)所述的細(xì)胞滲透肽是含有12-22個(gè)氨基酸的多肽分子，其中精氨酸和賴氨酸是維持細(xì)胞滲透功能的重要成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑，其特征在于細(xì)胞滲透肽 O. 05-1. O納摩爾/微升液相載體；胰島素O. 005-0. 4國(guó)際單位/微升液相載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑，其特征在于細(xì)胞滲透肽 O. 1-0. 6納摩爾/微升液相載體；胰島素O. 015-0. 3國(guó)際單位/微升液相載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑，其特征在于細(xì)胞滲透肽 O. 2-0. 4納摩爾/微升液相載體；胰島素O. 03-0. 2國(guó)際單位/微升液相載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑，其特征在于細(xì)胞滲透肽O. 3納摩爾/微升液相載體；胰島素 O. I國(guó)際單位/微升液相載體。
6.權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑，其特征在于所述的胰島素制劑中細(xì)胞滲透肽的氨基酸序列為Arg Trp Phe Lys He Gln Met Gln He Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys ;或 Arg Gln He Lys He Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys0
7.權(quán)利要求6所述的一種胰島素制劑，其特征在于所述的胰島素制劑中細(xì)胞滲透肽的氨基酸序列調(diào)整為IleArgArgTrpLysAsnLysLysArgTrpPheLysIleGlnMetGln或AsnArgArgMetLysTrpLysLysArgGlnIleLysIleTrpPheGln或LysLysAsnLysTrpArgArgIleGlnMetGlnIleLysPheTrpArg或LysLysTrpLysMetArgArgAsnGlnPheTrpIleLysIleGlnArg或LysTrpPheArgIleGlnMetGlnIleLysLysTrpArgAsnArgArg或LysGlnIleArgIleTrpPheGlnAsn 2LysLysMetArgTrpArgArg0
8.權(quán)利要求7所述的一種胰島素制劑，其特征在于所述的胰島素制劑中細(xì)胞滲透肽的氨基酸序列延長(zhǎng)為Arg Trp Phe Lys Ile Gly或非特定氨基酸；或GlnMetGlnIleArgArgTrpLysAsnLysLys加上1-6個(gè)Arg Gln He Lys Ile Gly或非特定氨基酸；或TrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys加上1-6個(gè)Arg Trp Phe Lys Ile 個(gè)Arg或非特定氨基酸；或GlnMetGlnIleArgArgTrpLysAsnLysLys加上I 6Arg Gln He Lys Ile 個(gè)Arg或非特定氨基酸；或TrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys加上I 6Arg Trp Phe Lys Ile 非特定氨基酸；或GlnMetGlnIleArgArgTrpLysAsnLysLys加上1-6個(gè)Arg Gln He Lys IleTrpPheGlnAsnArgArgMetLysTrpLysLys加上1-6個(gè)非特定氨基酸。
9.權(quán)利要求7所述的一種胰島素制劑，其特征在于所述的胰島素制劑中細(xì)胞滲透肽的氨基酸序列縮短1-4個(gè)氨基酸Arg Trp Phe Lys He Gln Gln Arg Arg Trp Lys Asn Lys Lys ;或 Arg Gln He Lys He Trp Gln Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys0
10.權(quán)利要求I所述的一種胰島素制劑的制備方法，其步驟是1)稱取治療劑量的胰島素粉末，置于一小試管內(nèi)；2)將O.I當(dāng)量的鹽酸溶液緩慢地加入小試管中，輕搖，溶解胰島素粉末；3)加入液相載體稀釋至所需濃度，輕搖混勻；4)用O.I當(dāng)量的氫氧化鈉將含有胰島素的溶液調(diào)至pH6. 5-7. 5 ；5)準(zhǔn)確稱取特定劑量的細(xì)胞滲透肽，置于另一小試管內(nèi)；6)用微量移液器將胰島素溶液緩慢地轉(zhuǎn)移至含有細(xì)胞滲透肽的小試管中，輕搖混勻 30分鐘；7)用不吸附蛋白質(zhì)的O.45微米孔徑濾膜過濾上述含有細(xì)胞滲透肽的胰島素溶液；8)將過濾后的胰島素制劑收集到無菌給藥器內(nèi)；9)直接用于調(diào)控血液中葡萄糖水平，或置于低溫保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公布了一種鼻用型胰島素制劑及制備方法，它由溶解于液相載體中的細(xì)胞滲透肽和胰島素共同組成。其中的細(xì)胞滲透肽是含有特定氨基酸序列的多肽分子，能促進(jìn)胰島素經(jīng)鼻腔粘膜進(jìn)入體內(nèi)，調(diào)節(jié)血糖水平。該制劑的主要制備步驟為用鹽酸溶解治療劑量的胰島素；用液相載體稀釋至所需濃度；用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性；與特定量的細(xì)胞滲透肽混溶；過濾除菌后置低溫保存?？捎帽莾?nèi)給藥器將本制劑施布于人或動(dòng)物鼻腔粘膜表面。與相同劑量的皮下注射胰島素制劑相比，本鼻用型胰島素制劑的相對(duì)藥物吸收率約80%，生物利用率達(dá)60%以上。細(xì)胞滲透肽和胰島素對(duì)鼻腔粘膜無刺激，體內(nèi)可降解為氨基酸，半衰期短，安全性高。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102580061SQ20111039309
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月1日
發(fā)明者余麗莉, 李健學(xué), 李志剛 申請(qǐng)人:武漢健宇生物醫(yī)藥科技有限公司