專利名稱：一種高品質(zhì)超低分子量肝素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種制備高品質(zhì)超低分子量肝素的方法。
背景技術(shù)：
肝素(普通肝素即未分級肝素)是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，在體內(nèi)和體外都有抗凝血作用。在臨床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)等。其最大的副作用是引起出血，有時甚至?xí)?dǎo)致出血性死亡，據(jù)統(tǒng)計其出血的發(fā)生率高達35%。盡管如此，它仍是防止血栓形成、肺栓塞、彌漫性血管內(nèi)凝血以及某些血栓栓賽性并發(fā)癥的首選藥物。雖然人們采取各種方法，比如減小劑量、局部用藥等以降低出血危險，但是都無法從根本上解決問題。肝素的抗凝血活性分為抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性兩大類，在抗血栓形成的過程中，抗FXa活性與抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓 作用的衡量標(biāo)準(zhǔn)用抗FXa / FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越強，出血傾向越小。低分子肝素是由未分級肝素經(jīng)化學(xué)降解或酶降解方法制備的鈉鹽或鈣鹽，是普通肝素的一種升級產(chǎn)品，其平均分子量約為5000 Da。當(dāng)皮下注射低分子肝素時，其在體內(nèi)的抗FXa的作用要比普通肝素強得多，而抗FIIa活性較弱，還具有體內(nèi)半衰期延長、生物利用度高等優(yōu)點，是目前主流的抗血栓類的藥物。雖然低分子肝素的抗FIIa活性與未分級肝素相比相對較弱，但是它依然會有一定幾率引起出血以及血小板減少癥。超低分子量肝素是經(jīng)降解而成的肝素寡糖片段，其主要雙糖結(jié)構(gòu)與肝素基本相同，S卩 a-L-IdoA-2-S04-P (I — 4) - a-D-GIrNS03-6_S04，平均分子量約為 2200 Da，而且分子量的分布區(qū)間比低分子肝素更加集中。它與低分子肝素產(chǎn)品相比，有著更好的抗血栓活性，更小的出血危險，以及更低的對血小板的影響。對超低分子肝素的研究與開發(fā)已受到越來越多的關(guān)注，已逐漸成為國內(nèi)外肝素研究的熱點。目前已經(jīng)證實，在多種轉(zhuǎn)移性或局部進展性實體瘤患者中預(yù)防性使用超低分子量肝素后，靜脈血栓栓塞事件的發(fā)生率大幅降低。我國現(xiàn)有公開號為CN101671711A的發(fā)明專利“一種制備超低分子量肝素的方法”和公開號為CN102040671A的發(fā)明專利“一種超低分子量肝素的制備及純化工藝”。其中“一種制備超低分子量肝素的方法”是用麥芽糖結(jié)合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解底物中肝素，得到超低分子量肝素；“一種超低分子量肝素的制備及純化工藝”是以￠-消除降解法為基礎(chǔ)，肝素與有機季銨鹽作用生成的肝素季銨鹽親和取代后生成的肝素芐基酯，堿性條件下降解得到低分子量的肝素片段，通過無機陶瓷超濾與中空纖維超濾結(jié)合的方法進行分離純化，獲得分子量分布范圍在200(T2500D、平均分子量為2200 Da的超低分子量肝素鈉(鈣)。其中，以酶降解從肝素鈉提取超低分子肝素的工藝存在著反應(yīng)條件苛刻、成本過高、雜質(zhì)過多、產(chǎn)品難以純化等缺點。而采用￠-消除降解法制備的超低分子肝素也有著抗FXa因子效價過低、抗FIIa效價過高、會有一定幾率導(dǎo)致出血等問題，主要是由于樣品純度不夠、雜質(zhì)含量過多、小分子肝素聚積等因素導(dǎo)致，這些都是目前的提取工藝所不能解決的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高品質(zhì)超低分子量肝素的低成本制備方法。本發(fā)明應(yīng)用類似于化學(xué)合成肝素五糖的作用原理，針對豬腸黏膜來源的肝素，以改良的P -消除降解法為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性地采用重鹽化、磷腈堿解聚、皂化等方法解決了料液中的大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵問題，從而制備得到超小分子片段。通過此種方法制備得到的超低分子肝素鈉平均分子量為2000 3000，分子量分布 < 1600的比例(40. 0% ；> 4500 的比例彡 11. 0%> 30，抗FXa 效價:145-180 IU/mg，抗FIIa效價<5.0 IU/mg。與低分子肝素鈉和超低分子肝素鈉相比，本發(fā)明制備的高品質(zhì)超低分子量肝素鈉有著非常好的的抗血栓活性，更小的出血危險，以及更低的對血小板的影響，有望成為新生代的肝素類抗血栓藥物。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的超低分子量肝素制備方法包括以下步驟
1、肝素-苯索氯銨鹽的合成按I:2 3的重量比稱取肝素鈉和苯索氯銨鹽，分別溶于蒸餾水中，將在肝素鈉溶液緩慢加入到苯索氯銨鹽溶液中，攪拌2小時以上，靜置分層，去上清，并將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素-苯索氯銨鹽，然后洗滌并干燥；
2、肝素芐基酯的合成將(I)所得肝素-苯索氯銨鹽溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化芐，于55飛(TC下進行酯化反應(yīng)25 30小時；
3、芐基肝素鈉鹽的合成配制飽和的醋酸鈉乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并攪拌，控制料液溫度15°C以下，靜置6小時以上；吸去上清液，將下層懸濁液離心，收集沉淀物芐基肝素鈉鹽，然后洗滌；
4、重鹽化稱取芐基肝素鈉2.5倍重量的苯索氯銨鹽和芐基肝素鈉，在水溶液中攪拌反應(yīng)2小時以上，而后再靜置分層，去上清，將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素芐基酯苯索氯銨鹽，并用蒸餾水洗滌；
5、解聚反應(yīng)將芐基肝素芐索銨鹽溶于二氯甲烷中，并加入磷腈堿作為催化劑，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時以上；然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至飽和的醋酸鈉甲醇溶液中，出現(xiàn)沉淀后，離心分離，所得為解聚合的芐基肝素鈉鹽，甲醇洗滌并干燥；
6、皂化將解聚的芐基肝素鈉鹽溶于蒸餾水中，于10°C以下，加入氫氧化鈉反應(yīng)2小時以上，再加入氯化鈉并用稀鹽酸調(diào)整pH為6. 5^7. 5，然后向反應(yīng)液中加入2 3倍的甲醇沉淀，將沉淀洗滌并干燥；
7、堿氧純化將(6)中所得沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)整pH值到9.0 11. 0，加入過氧化氫在室溫攪拌反應(yīng)6 8小時；
8、物理純化將料液轉(zhuǎn)移至納濾循環(huán)罐進行納濾；測定截留液相對平均分子量和分子量分布，若相對分子量和分子量分布不符合要求，則用1000 Da超濾膜進行超濾操作；再調(diào)節(jié)濾液PH值到6. 5^7. 4之間，經(jīng)0. 22 微孔濾器過濾；
9、凍干濾液放入凍干機中干燥。按上述方法，肝素芐基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯銨鹽加入的氯化芐的體積為1L。按上述方法,解聚反應(yīng)中,磷腈堿加入量為節(jié)基肝素節(jié)索銨鹽質(zhì)量的1%。本發(fā)明是根據(jù)類似化學(xué)合成肝素五糖作用原理，以改良的￠-消除法為基礎(chǔ)，通 過創(chuàng)新性地采用重鹽化、磷腈堿催化解聚、皂化等步驟，解決了超低分子量肝素制備的傳統(tǒng)工藝中大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵性問題。本發(fā)明與其他產(chǎn)品的比較如下
權(quán)利要求
1.一種高品質(zhì)超低分子量肝素鈉的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)肝素-苯索氯銨鹽的合成按I:2 3的重量比稱取肝素鈉和苯索氯銨鹽，分別溶于蒸餾水中，將在肝素鈉溶液緩慢加入到苯索氯銨鹽溶液中，攪拌2小時以上，靜置分層，去上清，并將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素-苯索氯銨鹽，然后洗滌并干燥； 2)肝素芐基酯的合成將(I)所得肝素-苯索氯銨鹽溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化芐，于55飛(TC下進行酯化反應(yīng)25 30小時； 3)芐基肝素鈉鹽的合成配制飽和的醋酸鈉乙醇溶液，加入到(2)所得的料液中并攪拌，控制料液溫度15°C以下，靜置6小時以上，吸去上清液，將下層懸濁液離心，收集沉淀物芐基肝素鈉鹽，然后洗滌； 4)重鹽化稱取芐基肝素鈉2.5倍重量的苯索氯銨鹽，和芐基肝素鈉在水溶液中攪拌反應(yīng)2小時以上，而后再靜置分層，去上清，將剩余懸浮物離心，收集沉淀物肝素芐基酯苯索氯銨鹽，并用蒸餾水洗滌； 5 )解聚反應(yīng)將芐基肝素芐索銨鹽溶于二氯甲烷中，并加入磷腈堿作為催化劑，在室溫下攪拌反應(yīng)24小時以上，然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至飽和的醋酸鈉甲醇溶液中，出現(xiàn)沉淀后，離心分離，所得為解聚合的芐基肝素鈉鹽，甲醇洗滌并干燥； 6)皂化將解聚的芐基肝素鈉鹽溶于蒸餾水中，于10°C以下，加入氫氧化鈉反應(yīng)2小時以上，再加入氯化鈉并用稀鹽酸調(diào)整pH為6. 5^7. 5，然后向反應(yīng)液中加入2 3倍的甲醇沉淀，將沉淀洗滌并干燥； 7)堿氧純化將(6)中所得沉淀溶于蒸餾水中，調(diào)整pH值到9.O 11. 0，加入過氧化氫在室溫攪拌反應(yīng)6 8小時； 8)物理純化將料液轉(zhuǎn)移至納濾循環(huán)罐進行納濾；測定截留液相對平均分子量和分子量分布，若相對分子量和分子量分布不符合要求，則用1000 Da超濾膜進行超濾操作；再調(diào)節(jié)濾液PH值到6. 5^7. 4之間，經(jīng)O. 22 微孔濾器過濾； 9)凍干濾液放入凍干機中干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，肝素芐基酯的合成中，每公斤肝素-苯索氯銨鹽加入的氯化芐的體積為1L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，解聚反應(yīng)中，磷腈堿加入量為芐基肝素芐索銨鹽質(zhì)量的1%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高品質(zhì)超低分子量肝素的制備方法。以改良的β-消除降解法為基礎(chǔ)，創(chuàng)新性地加入了重鹽化、磷腈堿解聚、皂化等方法解決了料液中的大分子肝素過多、小分子肝素聚積等關(guān)鍵問題，從而制備得到超小分子片段。通過此種方法制備得到的超低分子肝素鈉平均分子量為2000～3000，其分子量分布為＜1600的比例≤40.0%；＞4500的比例≤11.0%；抗FXa/FIIa＞30，其中抗FXa效價145-180IU/mg，抗FIIa效價＜5.0IU/mg。與低分子肝素鈉和超低分子肝素鈉相比，這種高品質(zhì)超低分子量肝素鈉有著非常好的抗血栓活性，更小的出血危險，以及更低的對血小板的影響，有望成為新生代的肝素類抗血栓藥物。
文檔編號A61P7/02GK102633908SQ201210131730
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者周霞, 郭維, 雷曉剛 申請人:雷曉剛