專利名稱：含有生物活性蛋白肽或多肽的植入組合物的制作方法
人們需要能在較長時間內均勻地持續(xù)釋出藥用制劑的方法及其所用的組合物，開發(fā)這類方法和組合物時所遇到的困難也是眾所周知的。
本發(fā)明涉及一種可植入的組合物，它可通過腸胃道外給藥后較長的時間內以基本上均勻而持續(xù)的數量施給生物活性蛋白，肽或多肽，它系由壓緊的、有凹痕、并被部分包覆的組合物所構成，組合物包含一至三層，每層按重量計含有約20-80%生物活性的蛋白、肽、或多肽，約10-75%脂肪、蠟、或其混合物，約0-20%緩沖劑、鹽、或其混合物，以及約0-25%糖。
令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，在動物體內植入本發(fā)明的壓緊、有凹痕、并被部分包覆的組合物后，可以在較長時間內提高并保持其血液中生物活性蛋白、肽或多肽的含量。
本發(fā)明的可植入的組合物，較好的是一種壓緊的、有凹痕并被部分包覆的組合物，它包含一至三層，每層按重量計含有約20-80%生物活性蛋白、肽或多肽，約10-75%脂肪、蠟、或其混合物，約1-20%緩沖劑、鹽、或其混合物，以及約1-25%糖。
本發(fā)明的更好的可植入的組合物，是一種壓緊的、有凹痕并被部分包覆的組合物，它包含一至三層，每層按重量計含有約35-70%生物活性的蛋白、肽、或多肽，約15-50%脂肪、蠟、或其混合物，約1-10%緩沖劑、鹽、或其混合物，以及5-15%糖。
適合于用在本發(fā)明的組合物中所施加的生物活性蛋白、肽和多肽，包括生長激素，促生長因子，生長因素，以及它們的其它具有生物活性的碎片和衍生物。較好的蛋白包括豬的、羊的、馬的、牛的、禽類的、與人的生長激素;而且其含意包括天然的、合成的、重組的、或生物合成來源的。更好的蛋白是在α-螺旋3區(qū)(α-helix 3region)或α-螺旋2區(qū)有變異(alteration)的、這二種情況相結合的，以及它們與其它突變體相結合的各種生長激素;而以E34rpST，I122L+E34rpST，和A6TSIIR+E34rpST為最好。
適用于本發(fā)明組合物中的蠟和脂肪一般熔點高于40℃。本發(fā)明中，蠟可定義為一種低熔點的高分子量有機混合物或化合物，在室溫下為固體，并且除了不包含甘油酯以外，其成份一般與脂肪和油相似。其中有一些是烴類;其它的是脂肪酸的酯和醇。這些化合物包括飽和或不飽和的長鏈C10-C24脂肪酸，醇，酯，鹽，醚，或其混合物。它們都歸屬于脂類(lipids)。蠟是熱塑性的，但因為它們不是高聚物，所以認為不屬于塑料一類。共同的性質是有憎水性;光滑的紋理;無毒性;沒有不受歡迎的氣味和顏色。它們是可燃的，并具有良好的介電性質。它們可溶于大部分有機溶劑但不溶于水。
主要的類型為Ⅰ.天然的1.動物(蜂蠟，羊毛脂，紫膠蠟，中國白蠟);
2.植物(巴西蠟棕，小燭樹蠟，楊梅屬植物，甘蔗);
3.礦物(a)化石或地蠟(地蠟，純地蠟，褐煤蠟)，(b)石油蠟(石蠟，微晶疏松石蠟或鱗狀蠟);
Ⅱ.合成的1.烯類聚合物和多元醇醚酯(“聚乙二醇”)(CarboWAX);
2.氯化萘(“鹵蠟”)(HaloWAX);
3.由Fischer-Tropsch合成法制得的烴類。
本發(fā)明中，脂肪可定義為高級脂肪酸(如肉豆寇酸，硬脂酸，棕櫚酸)的甘油酯。這些酯及其混合物在室溫下為固體，并呈現(xiàn)晶體結構。豬脂和牛脂就是例子。脂肪與油之間在化學方面并無差別，唯一的區(qū)別是室溫下脂肪是固體而油是液體?！爸尽蓖ǔ６际蔷唧w指三酸甘油酯，而“脂類”(lipid)則是統(tǒng)稱包括一切脂類。
較佳的脂肪是長鏈C10-C24脂肪酸的一甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。這些一、二、三甘油酯主要是肉豆蔻酸酯，硬脂酸酯，棕櫚酸酯，月桂酸酯，亞油酸酯，亞麻酸酯，油酸酯，及它們的殘基或混合物，最好是熔點高于50℃的。而以三肉豆蔻酸甘油酯為最好。
適用于本發(fā)明組合物中的糖類包括單糖、雙糖和三糖，如葡萄糖，甘露糖，山梨糖醇，甘露糖醇，乳糖，蔗糖，麥芽糖，纖維素二糖，蜜三糖。較好的糖類是非還原性的單糖，雙糖和三糖，而以蔗糖，蜜三糖，山梨糖醇和甘露糖醇為最好。
在本發(fā)明的植入組合物中可加入緩沖劑，以將組合物的pH調節(jié)到約6.0-8.5，使得生長激素可溶解并隨后從植入的組合物中釋出。適用于本發(fā)明組合物中的緩沖劑包括鈉和鉀的磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、甘氨酸鹽等或它們的混合物，而以可將組合物的pH調節(jié)到6.5-8.0的磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的混合物為較好。
適用于本發(fā)明組合物中的鹽包括氯化鈉、氯化鉀等。
在本發(fā)明組合物中可加入穩(wěn)定劑、防腐劑、表面活性劑等添加劑或者它們的混合物。較好的穩(wěn)定劑為脫氫乙酸，N-水楊酰苯胺，山梨酸、硼酸，苯甲酸，以及它們的鹽;羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，亞硝酸鈉，和硝酸鈉。在本發(fā)明中添加劑的合適用量為0.1-20%(重量)。
令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)，在動物體內植入本發(fā)明的組合物，可以在較長時間內提高并保持其血液中生長激素的含量水平。一般也可觀察到血液中生物活性蛋白，肽和多肽含量的提高，而且伴隨著有益的和/或治療的效果。這些效果包括在動物體內體重增加，生長率增加，飼料效率提高，體內脂肪減少，瘦肉與脂肪之比增大，肌肉體積的改善，以及授乳動物的產乳量增加。血中含量保持在較高數值，表明活性組份在緩慢釋放。當活性組份在血中的含量保持在提高了的數值時，一般可觀察到生長率增加，飼料效率提高，瘦肉增多，產奶量增加等性質。本發(fā)明包括使用這里所說的組合物來提高生長率，提高飼料效率，增加動物的瘦肉，增加產奶量，以及提高并保持動物血流中生長激素的含量。
本發(fā)明中用來施給生物活性蛋白，肽或多肽的可植入組合物可用以下方法制備將活性組分、緩沖劑或鹽或其混合物、和糖摻入熔融的脂肪、蠟、或其混合物中以得到一種粗粉料。然后在壓制常規(guī)5/32和1/8英寸植入片的壓片機上用專用沖頭制得壓緊并有凹痕的組合物。沖頭在其中心線上有一錐形的突出部分，在壓片時可在組合物上形成一錐形凹痕。然后在沖模內放入一至三層粗粉料，用專用沖頭制得壓緊并有凹痕的組合物。在本發(fā)明的一個較佳實施例中，各層的生物活性蛋白，肽或多肽的數量隨著離開凹痕的距離而增加。然后再用一層或二層半滲透性材料包覆壓緊并有凹痕的組合物，制得本發(fā)明的可植入組合物。凹痕部分基本上未被包覆，并成為活性組分在較長時間內從本發(fā)明組合物中釋出的通道。
適合用來包覆本發(fā)明的壓緊并有凹痕的組合物的半滲透性材料包括異丁烯酸酯共聚物，乙基纖維素聚合物等半滲透性聚合物。在半滲透聚合物中可加入1-20%(重量)的增塑劑和填充劑之類的添加劑，較好的增塑劑和填充劑分別是檸檬酸三乙酯和滑石。包圍壓緊并有凹痕的組合物的包覆層的厚度為約0.5-25密爾。
為了幫助進一步理解本發(fā)明，用下列實施例來更詳細具體地予以說明。但本發(fā)明不應局限于這些實施例，而只由權利要求書所確定。
實施例1
用于非腸胃道給藥以施加生長激素的植入組合物的制備1.用噴霧干燥法制備生長激素，糖，緩沖劑和附加劑，使其粒度適合于摻入脂肪，蠟，或其混合物中。具體做法是將生長激素和糖溶解于水中，然后加入所需的緩沖溶液(例如磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的1∶2混合物)。還可加入羥丙基纖維素等添加劑并讓它溶解。然后把溶液放在Buchi 190型微型噴霧干燥器中進行噴霧干燥。
顆粒狀粉料的制備。將噴霧干燥粉料摻合于熔融脂肪，蠟或其混合物中，制得均勻的混合物，然后讓所得的混合物冷卻而得到一種粉料。將該粉料用裝有5/8英寸沖頭和沖模的Stokes 512型壓片機壓片。然后用輕型桌上錘磨機(Glen Mills Microhammer Mill)錘磨這些壓片，制得一種粗顆粒粉料。
3.制備壓緊而有凹痕的組合物。分層，壓緊而有凹痕的組合物，是用裝有5/32英寸沖模和專用沖頭的Stokes 512型單片壓片機制得的。沖頭在其中心線上有一3mm的錐形突出部分。突出部分的底部尺寸約為1mm。要制取分層，壓緊而有凹痕的組合物，首先將內端的粒狀粉料放入沖模內并輕輕搗實，然后將凹痕端的粒狀粉料放入沖模。壓片機用手工操作，使它每次只壓出一片植入片。為了制得均勻的植入片，使用一個1/8英寸的沖模和專用沖頭。沖頭在其中心線上有一3mm的錐狀突出部分，突出部分的底部尺寸約為1mm。在沖模內放入所需數量的顆粒狀粉料，用手工操作壓片機就可制得均勻，壓緊而有凹痕的組合物。
4.被部分包覆的植入組合物的制備。壓緊并有凹痕的組合物可用一MINI HI-COATERR(Vector Laboratories的注冊商標)包覆一層或二層半滲透性聚合物材料。凹痕內的表面基本上未被包覆，它成為活性組分在較長時間內從本發(fā)明組合物中釋出的通道。
利用上述方法，以下面表Ⅰ所列的材料制得表Ⅱ所列的植入組合物。
表 Ⅰ生長激素a.I122L+E34rpSTb.E34rpSTc.A6TS11R+E34rpSTd.CAM-rpSTe.牛生長激素脂肪或蠟f.三肉豆寇酸甘油酯g.三硬脂酸甘油酯糖h.蔗糖i.乳糖緩沖劑j.磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的1:2混合物,k.磷酸二氫鈉l.硼酸鈉添加劑m.羥丙基纖維素包覆層n.含有8%(重量)滑石的聚(丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸甲酯)(EUDRAGITRNE30D).
o.含有15%(重量)滑石的聚(丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸甲酯)(EUDRAGITRNE30D).
p.含有15%(重量)檸檬酸三乙酯的聚(丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸甲酯)甲基丙烯酸乙酯三甲銨氯化物poly(ethylacrylate,methylmethacrylate)trimethylammonioethylmethacrylate chloride(EUDRAGITRRL30D)q.含有15%(重量)檸檬酸三乙酯的聚(丙烯酸乙酯,甲基丙烯酸甲酯)甲基丙烯酸乙酯三甲銨氯化物(EUDRAGITRRS30D)。
＊EUDRAGITR是Rohm pharma Gm6H的商標。
表 Ⅱ植入組合物
實施例2本發(fā)明的組合物在豬體內的持續(xù)釋出將豬分為每四頭一組。在整個試驗過程中，全部的豬都喂以含20%粗蛋白的食料。頭三天不作處理，每天測得每一組豬血液中豬生長激素的含量。然后在每頭豬的耳部植入兩片表Ⅱ所列的植入片。每天用標準放射免疫分析(RIA)技術測定豬的血液中生長激素的含量。實驗的結果綜合列于下表Ⅲ中，這些結果表明本發(fā)明的組合物能有效地在較長時間內將血液中的生長激素含量提高并保持在較高的水平。
表Ⅲ豬試驗中的平均血漿rpST濃度(ng/mL，根據放射免疫分析測定)時間 組合物編號(參見表Ⅱ)(天) 2 7 10 11 12 13-3 1.9 1.4 1.5 2.1 3.8 2.5-2 0.9 2.2 2.6 4.9 2.4 3.8-1 1.2 2.3 1.7 2.4 3.3 4.21 6.6 5.5 4.9 1.7 3.0 1.4
2 8.2 3.5 35.2 1.5 3.5 1.63 9.8 13.9 97.1 2.6 3.8 3.24 6.3 11.3 60.9 1.9 3.2 2.45 3.4 17.6 56.4 1.5 18.9 8.66 20.1 16.2 474.8 11.2 61.2 17.67 26.4 20.6 242.6 3.3 40.3 22.9
表 Ⅲ(續(xù))時間 組合物編號(參見表Ⅱ)(天) 2 7 10 11 12 138 26.1 20.0 110.6 118.1 35.4 41.39 50.0 19.4 70.7 87.0 19.7 43.010 42.9 25.9 45.4 56.6 30.0 55.011 26.1 35.7 82.4 44.3 15.7 32.512 16.0 34.2 47.1 34.8 22.7 35.313 26.2 29.8 52.1 40.1 6.7 25.014 19.9 31.4 28.8 54.4 8.0 39.815 10.2 25.3 21.3 25.9 4.8 20.016 8.8 20.7 19.7 31.3 4.7 12.517 13.4 10.5 6.8 29.2 4.9 10.218 8.0 15.4 7.8 18.5 4.0 10.019 32.1 34.4 10.0 16.1 3.8 5.320 5.8 9.4 8.2 14.9 2.8 6.821 9.6 13.6 9.9 8.7 2.7 3.122 15.1 11.2 5.7 7.4 35.6 7.123 60.8 7.1 6.0 15.9 12.8 4.324 4.9 7.6 12.6 11.2 4.0 4.425 8.4 7.0 5.4 5.4 2.3 3.426 8.9 6.6 4.0 5.3 2.7 6.827 6.7 7.3 4.8 8.6 5.0 6.5實施例3植入片的體外溶解性評價在放有10mL磷酸鹽緩沖溶液的塑料試管中放入兩片植入片(緩沖溶液pH7.4，100mM NaCl，50mM Na2HPO4/NaH2PO4，0.2%疊氮化鈉)，并將該管放入一水溫保持為39℃的水浴內。管子在水浴內保持兩天，然后將溶液從管中取出，用高效液相色譜法(HPLC)分析相應的生長激素的含量，最后將溶液棄掉。再在管內放入新的磷酸鹽緩沖溶液，管子在水浴內再放三天，然后按上面所說進行分析。這一過程以不同的時間間隔重復若干次，直至試驗結束。表Ⅱ所列的幾種組合物的對應的生長激素釋放率綜合列于表Ⅳ。
表 Ⅳ釋放率(毫克/日)組合物起止日 2 7 100-2 0.6 0.6 1.02-5 3.8 7.6 11.45-9 7.2 7.0 6.99-12 5.3 3.4 4.212-16 2.7 1.7 2.116-19 1.6 1.3 1.819-23 1.3 0.9 1.423-28 0.9 0.6 1.0按照上述方法，但在與上面不同的時間間隔內分析溶液中對應的生長激素的含量，可得到表Ⅴ，表Ⅵ和表Ⅶ所示的釋放率。
表 Ⅴ釋放率(毫克/日)組合物起止日 11 130-1 0.1 0.01-2 2.5 1.42-5 7.0 3.95-9 5.9 6.49-12 3.9 4.312-16 2.5 2.516-19 1.7 1.319-22 1.4 1.122-26 1.0 1.126-28 0.8 0.6
表 Ⅵ釋放率(毫克/日)組合物起止日 120-1 0.51-3 2.03-7 5.17-10 7.110-14 3.914-17 1.917-21 1.321-24 0.924-28 0.7表 Ⅶ釋放率(毫克/日)組合物起止日 15 16 170-1 0.0 0.0 0.01-2 2.2 0.7 0.72-5 1.5 3.0 3.35-9 3.9 4.4 4.59-12 4.6 4.1 2.612-16 2.4 2.3 1.116-20 1.5 1.6 0.720-23 0.9 1.2 0.423-26 0.9 1.1 0.3此外，按照上面的方法，但用三片植入片作試驗，則得到表Ⅷ所示的釋放率。
表 Ⅷ
釋放率(毫克/日)組合物起止日 140-1 0.01-4 1.44-7 3.97-11 4.711-14 3.314-18 1.918-21 1.521-34 0.8
權利要求
1.一種可通過在腸胃道外給藥后在較長時間內以基本上均勻而持續(xù)的數量釋出生物活性蛋白，肽或多肽的可植入的組合物，其特征在于它由壓緊并有凹痕，且被部分包覆的組合物所構成，組合物包含一至三層，每層按重量計含有約20-80%生物活性蛋白，肽或多肽，約10-75%脂肪，或蠟，或其混合物，約0-20%緩沖劑，或鹽，或其混合物，以及約0-25%糖。
2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于其中的生物活性蛋白，肽或多肽是選自生長激素，促生長因子，與生長因素，包括豬的、羊的、馬的、牛的、禽類的、和人的生長激素;而脂肪是選自三肉豆蔻酸甘油酸，三棕櫚酸甘油酯，與三硬脂酸甘油酯;緩沖劑是選自硼酸鈉，碳酸鈉，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，與它們的混合物;糖是選自葡萄糖，甘露糖，蔗糖，蜜三糖，山梨糖醇，甘露糖醇，和乳糖;包覆物由一至二層半滲透性材料構成;而且所說的組合物也可含有穩(wěn)定劑，表面活性劑，或其混合物。
3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于其中的豬生長激素是選自E34rpST，I122L+E34rpST，和A6TSIIR+E34rpST。
4.如權利要求2所述的組合物，其特征在于其中的緩沖劑是一種磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉的混合物。
5.如權利要求2所述的組合物，其特征在于其中的半滲透性材料是一種含有約1-20%(重量)檸檬酸乙酯或滑石的甲基丙烯酸酯共聚物，而包覆層的厚度為約0.5-25密爾。
6.如權利要求1所述的組合物，其特征在于各層的生物活性蛋白、肽或多肽的含量隨著離開凹痕的距離而增加。
7.一種提高并能保持動物血液中生物活性蛋白、肽或多肽含量，提高生長率，提高飼料效率，改善瘦肉與脂肪之比，和提高授孔動物產乳量的方法，其特征在于通過腸胃道外給藥以施加權利要求1所述的可植入組合物。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所施加的是權利要求2所述的可植入組合物。
9.一種制備可植入組合物的方法，該組合物可在較長時間內以基本上均勻而持續(xù)的數量在腸胃道外給藥以施加生物活性蛋白、肽或多肽，所述方法的特征為(a)將生物活性蛋白、肽或多肽與熔融的脂肪、蠟、或其混合物混合在一起(其中也可混有緩沖劑、鹽、或糖)，以制得一種粗粉料;(b)將一至三層上述粗粉料壓緊，以制得壓緊的物體;(c)用錐形突出部分的沖頭沖壓上述壓緊的物體，以在該壓緊的物體上形成一錐形凹痕;(d)用半滲透性材料包覆上述壓緊并有凹痕的物體，使所述凹痕成為由該壓緊物體穿過包覆層的通道。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于步驟(b)和步驟(c)是同時進行的。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于其中壓緊的物體是權利要求1所述的組合物。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于其中步驟(a)還包括以下特征(a)將生物活性蛋白、肽或多肽與緩沖劑、鹽、或其混合物溶解于水制成溶液;(b)將上述溶液進行噴霧干燥，以制得噴霧干燥的粉料;(c)將上述噴霧干燥的粉料溶解于熔融的脂肪、蠟、或其混合物中，制得均勻的混合物;(d)將上述均勻的混合物冷卻以制成粉料;(e)將上述粉料壓緊，制得壓緊的物體;(f)碾磨上述壓緊物體，以制得粗顆粒粉料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植入組合物，它可在較長時間內以基本上均勻而持續(xù)的數量通過腸胃道外給藥施加生物活性蛋白、肽或多肽。本發(fā)明還涉及一種提高并保持動物血液中生物活性蛋白、肽和多肽含量的方法。
文檔編號A61K9/20GK1068965SQ9210506
公開日1993年2月17日 申請日期1992年6月23日 優(yōu)先權日1991年6月24日
發(fā)明者W·D·斯蒂伯, S·M·卡迪, D·F·約翰遜, T·賴斯 申請人:美國氰胺公司