專利名稱：再生細(xì)胞用于促進(jìn)傷口愈合的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明整體上涉及多種組織來源的再生細(xì)胞，特別是脂肪來源的再生細(xì)胞(例如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)，使用脂肪來源的再生細(xì)胞的方法，含有脂肪來源的再生細(xì)胞的組合物，用于制造和使用脂肪來源的再生細(xì)胞的系統(tǒng)，其用于促進(jìn)傷口愈合，例如糖尿病， 慢性外周血管疾病和肥胖所引起的傷口。
背景技術(shù)：
大約五百萬美國(guó)人患有慢性瘡口，原因經(jīng)常是由于有限的血流能夠減慢身體的自我愈合過程。通常，對(duì)皮膚的損傷引起一連串連鎖反應(yīng)，其最終導(dǎo)致傷口愈合，即新真皮形成和表皮細(xì)胞再生。這一系列反應(yīng)包括局部、區(qū)域和系統(tǒng)的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、和細(xì)胞參與者(cellular participant)，包括間充質(zhì)干細(xì)胞。但是，不充分和/或不徹底的傷口愈合會(huì)引起嚴(yán)重的個(gè)體病態(tài)，包括生活質(zhì)量的極度下降。瘡口能變得感染，壞疽，有時(shí)需要截肢。 例如，由于不充分的傷口愈合而進(jìn)行的非創(chuàng)傷性截肢的一個(gè)主要原因是糖尿病。在美國(guó)有近1600萬糖尿病人。每年，超過67000的糖尿病人需要外科手術(shù)截肢，不得不進(jìn)行長(zhǎng)期和高價(jià)的復(fù)原。對(duì)于許多人，活動(dòng)和自理受到影響，永久地改變了他們的生活質(zhì)量。更甚者， 不良的傷口愈合可能成為死亡的根源。對(duì)于患有有難以愈合的慢性傷口的病人，基本的藥物和外科手術(shù)護(hù)理是必須的， 但這些是不夠的。目前對(duì)于傷口愈合的治療包括非健康組織的切取，使用生長(zhǎng)因子，高壓 (高壓力)氧治療，高級(jí)傷口敷料，抗生素治療，常規(guī)的傷口敷料，營(yíng)養(yǎng)學(xué)建議，教育/預(yù)防，外科手術(shù)和物理療法。例如，單一或多參與分子聯(lián)合的操作，包括但不限于PDGF-BB和 bFGF，可以用來加強(qiáng)自發(fā)的傷口愈合。另外，還可以使用“工程設(shè)計(jì)的(engineered)”細(xì)胞
產(chǎn)物(Apligraf 和Dermagraft )，作為引起生長(zhǎng)因子表達(dá)的另一種生理模式的途徑。已經(jīng)證明，使用如Regranex，一種血小板來源的刺激愈合的生長(zhǎng)因子的治療，對(duì)于合適病人的傷口護(hù)理是有益的。與上述單一或聯(lián)合的分子治療相比，再生細(xì)胞的方法也享有相對(duì)的成功。在臨床的目標(biāo)方式中，再生藥物控制干細(xì)胞(即，身體非特定性的主要細(xì)胞)的不定性自我更新并發(fā)育成為成熟的特定細(xì)胞的能力。但是，再生細(xì)胞治療的廣泛應(yīng)用受到細(xì)胞保存和與大量體外處理有關(guān)的高費(fèi)用問題的阻礙。然而，雖然已經(jīng)表明干細(xì)胞群存在于一種以上的骨髓，皮膚，肌肉，肝和腦中(Jiang 等人，2002b ；Alison, 1998 ；Crosby 和 Strain，2001)，但是它們?cè)谶@些組織中的分布頻率是很低的。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中的分布頻率估計(jì)在 1/100,000 與有核細(xì)胞的 1/1，000，000 之間(D' Ippolito 等人，1999 ；Banff 等人，2001 ； !^alla等人.1993)。相似地，從皮膚中提取成體干細(xì)胞(ASC)涉及一系列復(fù)雜的要花費(fèi)幾周時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)步驟(Toma等人，2001)，并且骨骼肌肉干細(xì)胞的臨床應(yīng)用需要2到3周的培養(yǎng)階段(Hagege等人，2003)。因此，已知的任何來自這樣的組織的干細(xì)胞的臨床應(yīng)用， 都需要通過細(xì)胞純化和細(xì)胞培養(yǎng)過程來提高細(xì)胞數(shù)量、純度和成熟度。雖然細(xì)胞培養(yǎng)提高了細(xì)胞數(shù)量、純度和成熟度，但也提高了成本。該成本可能包括一種以上以下的技術(shù)困難由于細(xì)胞老化引起的細(xì)胞功能喪失，潛在有益的非干細(xì)胞群的丟失，細(xì)胞對(duì)病人的潛在應(yīng)用的延遲，增加了資金成本，增加了細(xì)胞被環(huán)境微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。近來調(diào)查骨髓ASC治療效果的研究在本質(zhì)上使用全骨髓來避開與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的問題 (Horwitz 等人，2001 ；Orlic 等人，2001 ；Stamm 等人，2003 ；Strauer 等人，2002)。但是，臨床療效并不理想，結(jié)果很可能與骨髓中有限的ASC劑量和可利用的固有純度有關(guān)。最近已經(jīng)表明，脂肪組織是干細(xì)胞的一個(gè)來源(Zuk等人，2001 ；Zuk等人，2002)。 脂肪組織(不同于骨髓，皮膚，肌肉，肝和腦)相對(duì)容易以較大數(shù)量較低發(fā)病率獲得 (Commons等人，2001 ；Katz等人，2001b)。但是技術(shù)上缺少獲得脂肪來源的干細(xì)胞的適宜方法?，F(xiàn)存的方法存在很多缺點(diǎn)。例如，現(xiàn)存方法沒有部分或全部的自動(dòng)控制，部分或全部密閉的系統(tǒng)，組件的一次性等。考慮到脂肪來源的干細(xì)胞對(duì)傷口愈合的治療潛力，則在技術(shù)上需要從脂肪組織中獲得細(xì)胞的方法，其需要快速可靠地以更高的產(chǎn)率、濃度和/或純度產(chǎn)生成體干細(xì)胞群，并且減少或不存在對(duì)過去的提取處理的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及再生細(xì)胞，例如成體干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其能夠用于促進(jìn)傷口愈合。本發(fā)明還涉及從組織，例如脂肪組織中分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于傷口愈合的再生細(xì)胞的組合物。所以，在一般的實(shí)施方式中，本發(fā)明主要涉及使用來自組織的再生細(xì)胞的組合物，方法和系統(tǒng)，這些再生細(xì)胞與必要的添加劑一同被直接放入接受者體內(nèi)，來促進(jìn)、引起或維持傷口愈合的治療效果。在特定的實(shí)施方式中，本發(fā)明主要涉及，通過施加一定濃度的再生細(xì)胞來促進(jìn)傷口愈合的方法。該再生細(xì)胞可以包括例如干細(xì)胞、祖細(xì)胞或其聯(lián)合體。在一些實(shí)施方式中， 需要再生細(xì)胞的多劑量給藥，以產(chǎn)生治療效果。另外，可以與該再生細(xì)胞一同施加添加劑， 例如一種以上的生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該再生細(xì)胞單獨(dú)或與其他添加劑一起，與血管生長(zhǎng)因子一同給藥。該再生細(xì)胞也可以與一種以上的免疫抑制藥一同給藥。再生細(xì)胞的給藥途徑為技術(shù)上已知的，并包括距離損傷部位較遠(yuǎn)處的皮下、真皮或肌肉注射，或使用基于導(dǎo)管的機(jī)制進(jìn)行的局部血管導(dǎo)入。例如該細(xì)胞可以對(duì)于病人的脈管系統(tǒng)給藥。該細(xì)胞也可以經(jīng)由技術(shù)上已知的可以被再吸收的支架(sacaffold)或繃帶給藥。在對(duì)病人給藥之前，再生細(xì)胞可以被培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中，以便例如促進(jìn)向表皮和/或內(nèi)皮表現(xiàn)型的分化。細(xì)胞培養(yǎng)可以是在支架材料，例如可以被再吸收的支架上進(jìn)行的，以形成能夠被放置在病人身體上或身體內(nèi)的二維或三維空間結(jié)構(gòu)。在對(duì)病人給藥之前， 也可以通過轉(zhuǎn)基因來修飾該細(xì)胞，以改變被修飾的再生細(xì)胞中的一種以上基因，例如血管生長(zhǎng)基因的表達(dá)。本發(fā)明還涉及能夠從所給的組織分離和濃縮再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞的通用性高的系統(tǒng)和方法，其適于再灌注入受試者。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該系統(tǒng)是自動(dòng)控制的。 本發(fā)明的系統(tǒng)一般包括一個(gè)以上的收集室，一個(gè)處理室，一個(gè)廢物室，一個(gè)導(dǎo)出室和一個(gè)樣品室。多個(gè)室由一根以上的導(dǎo)管相連，以便包括生物材料的流體可以在密閉、無菌的流體/ 組織路徑中從一個(gè)室流到另一個(gè)室。在一些實(shí)施方式中，廢物室，導(dǎo)出室和樣品室是可選的。在一個(gè)實(shí)施方式中，從組織提取，到處理，和將該發(fā)明物放入接受者的整個(gè)程序都是在相同設(shè)備中進(jìn)行的，甚至是在接受該程序的病人的相同場(chǎng)所進(jìn)行的。所以，在一個(gè)實(shí)施方式中，促進(jìn)病人傷口愈合的方法包括步驟a)提供一個(gè)組織切取系統(tǒng)；b)使用該組織切取系統(tǒng)從病人切取脂肪組織，該脂肪組織具有一個(gè)干細(xì)胞濃度；c)對(duì)該脂肪組織的至少一部分進(jìn)行處理以得到一個(gè)再生細(xì)胞濃度，其不同于處理前該脂肪組織的再生細(xì)胞的濃度；以及d)將該再生細(xì)胞施加給病人，并且在被施加給病人前不從該組織切取系統(tǒng)中除去該再生細(xì)胞。這里描述的任何特征或特征的結(jié)合都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這樣的結(jié)合中所包括的特征如上下文，本說明書和本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)那樣，不相互矛盾即可。本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和內(nèi)容如下所述。


圖1是一個(gè)用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的圖，該系統(tǒng)包括一個(gè)過濾裝置。圖2是與圖1相似的系統(tǒng)的圖，該系統(tǒng)具有連續(xù)配置的多個(gè)過濾裝置。圖3是與圖1相似的系統(tǒng)的圖，該系統(tǒng)具有平行配置的多個(gè)過濾裝置。圖4是一個(gè)用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的圖，該系統(tǒng)包括一個(gè)離心分離室。圖5是一個(gè)收集室的剖視圖，該收集室包括預(yù)先固定了一個(gè)用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)中利用的過濾器。圖6是一個(gè)用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理室的剖視圖，其利用了滲濾的過濾器系統(tǒng)。圖7是一個(gè)用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理室的剖視圖，其利用了一個(gè)離心分離設(shè)備用來濃縮該再生細(xì)胞。圖8是圖7的處理室的另一個(gè)剖視圖。圖9A，B，C是表示使用本發(fā)明的系統(tǒng)淘析組分的圖。圖10是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的圖，其利用真空壓力使流體穿過該系統(tǒng)移動(dòng)。真空系統(tǒng)可以是通過在系統(tǒng)出口使用真空泵或真空源而構(gòu)成的，其控制在預(yù)先確定的速度下來拖動(dòng)組織和流體通過，并使用一個(gè)活塞、排放口和夾子的系統(tǒng)來控制流動(dòng)方向和流動(dòng)時(shí)間。圖11是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的圖，其利用正壓力使流體穿過該系統(tǒng)移動(dòng)。正壓力系統(tǒng)使用機(jī)械方式例如蠕動(dòng)泵來推動(dòng)或推進(jìn)流體和組織以確定的速度穿過該系統(tǒng)，使用閥門、活塞、排放口和夾子來控制流動(dòng)方向和流動(dòng)時(shí)間。圖12A是表示過濾過程的圖，其中流體的物料流的流動(dòng)與過濾器孔相切。12B表示過濾過程的圖，其中流體的物料流的流動(dòng)與過濾器孔垂直。圖13是示范性的用于本發(fā)明系統(tǒng)的一次性裝置的圖。圖14是示范性的用于本發(fā)明系統(tǒng)的可再利用的零件的圖。圖15A是示范性的本發(fā)明的設(shè)備的圖，其為使用圖13的一次性裝置和圖14的可再利用的零件裝配的。圖15B是示范性的預(yù)排程序的步驟流程圖，是通過軟件程序?qū)崿F(xiàn)的，其控制本發(fā)明的一個(gè)系統(tǒng)的自動(dòng)化實(shí)施方式。所顯示的兩個(gè)可選的處理參數(shù)指示了該系統(tǒng)的多功能性。圖16A和16B通過培養(yǎng)的脂肪來源的干細(xì)胞描述了 VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白的表達(dá)。圖17表示的是，脂肪來源的干細(xì)胞群中內(nèi)皮祖細(xì)胞的檢測(cè)。圖18A和18B表示的是，在正常小鼠和經(jīng)鏈脲霉素處理的小鼠中血管結(jié)構(gòu)的體內(nèi)發(fā)育。圖19表示的是，與陰性對(duì)照相比，用脂肪來源的干細(xì)胞處理的下肢缺血小鼠中血流的平均恢復(fù)增加。圖20A和20B表示脂肪來源的干細(xì)胞增加改善移植的存活率和血管生成(20A)，并描繪了組織樣品中脂肪組織結(jié)構(gòu)的保持(20B)。圖21表示不同培養(yǎng)基中小鼠成纖維細(xì)胞和ADC的膠原蛋白分泌。圖22表示經(jīng)STZ處理的糖尿病小鼠的傷口愈合進(jìn)程。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了使用脂肪再生細(xì)胞(“ADC”)促進(jìn)傷口愈合的方法。本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的再生細(xì)胞⑴表達(dá)包括PIGF、VEGF, bFGF、IGF-II、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(eotaxin)、G-CSF, GM-CSF, IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、IL-6、 IL-9、瘦素(L印tin)、MCP-U M-CSF, MIG、PF-4、TIMP-U TIMP-2、TNF-α 和血小板生成素 (Thrombopoetin)的血管生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，(2)分泌與傷口愈合有關(guān)的細(xì)胞因子包括 MIP-I α、RANTES、MCP-I、MIG、TARC、MIP-I、KC 和 TIMP，(3)體內(nèi)分泌膠原蛋白，并且(4)促進(jìn)體外傷口愈合。所以，來源于脂肪組織的再生細(xì)胞，例如具有通常認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞特征，即表達(dá)細(xì)胞表面分子的干細(xì)胞，具有促進(jìn)新血管形成和傷口愈合的功能。本發(fā)明還涉及用于從多種組織中分離和濃縮再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的快速可靠的系統(tǒng)和方法，分離再生細(xì)胞的組織包括但不限于脂肪，骨髓，血液，皮膚，肌肉，肝，結(jié)締組織，筋膜，腦和其他神經(jīng)系統(tǒng)組織，血管和其他軟組織或液體組織，或者組織成分或組織混合物(例如包括皮，血管，脂肪和結(jié)締組織的組織混合物)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該系統(tǒng)從脂肪組織中分離并濃縮再生細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)是自動(dòng)控制的，以便整個(gè)方法可以以最少的使用者干涉或?qū)ｉT知識(shí)來進(jìn)行。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法得到的再生細(xì)胞適于直接放置于患病的接受者體內(nèi)。優(yōu)選，從組織提取，到分離，濃縮，和將再生細(xì)胞放入接受者體內(nèi)的整個(gè)程序是在相同設(shè)備中進(jìn)行的，甚至是在經(jīng)歷該程序的病人的相同場(chǎng)所進(jìn)行的。該再生細(xì)胞在提取和濃縮后較短的時(shí)間內(nèi)就可以被使用。例如，該再生細(xì)胞在從病人獲取組織約1小時(shí)后就可以使用，在一些情況下，獲取組織約10到40分鐘后就可以使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中， 該再生細(xì)胞在獲取組織約20分鐘后即可使用。從提取，到分離和濃縮的程序的整個(gè)長(zhǎng)度可以依賴多種因素而有所變化，這些因素包括病人狀況，被獲取的組織類型和特定治療應(yīng)用所需要的再生細(xì)胞數(shù)量。就以產(chǎn)生對(duì)接受者的治療，構(gòu)成或修飾效果為目的的單個(gè)實(shí)施的程序而言，該細(xì)胞也可以與其他細(xì)胞、組織、組織片段、支架或其他細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞分化的刺激物一同放入接受者體內(nèi)?？梢岳斫獾氖?，在該系統(tǒng)的分離和濃縮階段之上的任何再生細(xì)胞的進(jìn)一步處理都將需要與處理方式相應(yīng)的時(shí)間。為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義一些術(shù)語。更多的定義在具體說明的過程中
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口 QQ ο“再生細(xì)胞”是指，使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法得到的任何異源或同源細(xì)胞，其引起或有助于完全或部分地再生、恢復(fù)或替代器官、組織或生理單元或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能，從而提供治療，構(gòu)成或修飾效果。再生細(xì)胞的例子包括ASC，內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，周細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞，分化或去分化的脂肪細(xì)胞，角化細(xì)胞，單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和它們的后代)，和淋巴細(xì)胞。再生細(xì)胞可以提供治療，構(gòu)成或修飾效果的一個(gè)機(jī)制是，將其自身或其后代合并成為新生的，現(xiàn)存的或經(jīng)修復(fù)的組織或組織成分。例如，ASC和/或它們的后代可以合并成為新生的骨骼，肌肉或其他結(jié)構(gòu)性或功能性組織，并從而引起或有助于治療，構(gòu)成或修飾的促進(jìn)。類似地，內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮前體細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞和它們的后代可以合并成為現(xiàn)存的， 新產(chǎn)生的，經(jīng)修復(fù)的或延伸的血管，從而引起或有助于治療，構(gòu)成或修飾效果。再生細(xì)胞可以提供治療，構(gòu)成或修飾效果的另一個(gè)機(jī)制是，表達(dá)和/或分泌促進(jìn)特定組織或組織成分的結(jié)構(gòu)或功能的產(chǎn)生、保持、恢復(fù)和/或再生的分子，例如生長(zhǎng)因子。例如，再生細(xì)胞可以表達(dá)和/或分泌導(dǎo)致組織或細(xì)胞生長(zhǎng)增強(qiáng)的分子，然后這些組織或細(xì)胞直接或間接參與改善結(jié)構(gòu)或功能。再生細(xì)胞可以表達(dá)和/或分泌生長(zhǎng)因子，包括例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、bFGF、IGF-II、嗜酸粒細(xì)胞趨化因子 (eotaxin)、G-CSF, GM-CSF, IL-12 p40/p70、IL-12 p70、IL13、IL-6、IL-9、瘦素(I^ptin)、 MCP-I、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-I、TIMP-2、TNF- α、血小板生成素和它們的異構(gòu)體，它們可以完成一種以上的以下功能刺激新血管的發(fā)育，即促進(jìn)血管生成；通過擴(kuò)大它們的血液運(yùn)輸能力來改善已有小血管的供氧(間接)；誘導(dǎo)再生細(xì)胞從距離損傷遠(yuǎn)的部位向外運(yùn)動(dòng)，從而加強(qiáng)這些細(xì)胞向損傷部位的導(dǎo)引和遷移；刺激損傷部位細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或強(qiáng)化其生存， 從而促進(jìn)功能或結(jié)構(gòu)的保持；釋放具有抗凋亡能力的分子，從而減少細(xì)胞死亡和永久喪失功能的幾率或可能性；與內(nèi)源性再生細(xì)胞和/或其他生理機(jī)制相互作用。正如進(jìn)一步的描述，再生細(xì)胞可以以它們存在或利用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法從組織中分離和濃縮的本來形式被使用，或者它們可以通過以下方式被修飾，即通過刺激或注入生長(zhǎng)因子或其他生物反應(yīng)修飾劑，通過基因轉(zhuǎn)移(短暫的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移)，通過根據(jù)主要成分或物理性質(zhì)(例如樣品大小或密度)、對(duì)固相物質(zhì)的不同黏附、細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)或其他體外或體內(nèi)處理、修飾或分餾而對(duì)得到的種群的進(jìn)一步細(xì)分餾。如進(jìn)一步的描述，再生細(xì)胞也可以與其他細(xì)胞或裝置如人造或生物的支架，釋放修飾或加強(qiáng)相應(yīng)的細(xì)胞特性的因子、藥物、化學(xué)物質(zhì)和其他制劑的材料或裝置聯(lián)合使用。這里所使用的術(shù)語“再生細(xì)胞組合物”是指，一種組織例如脂肪組織被清洗或至少部分地分解后，具有代表性地存在于一定體積液體中的細(xì)胞的組合物。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物含有多種不同類型的再生細(xì)胞，包ASC，內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞， 巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，周細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞，分化或去分化的脂肪細(xì)胞，角化細(xì)胞，單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和它們的后代)，和淋巴細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物還可能包括一種以上污染物，例如膠原蛋白，其可能存在于組織片段、或殘留的膠原蛋白酶或其他的酶或使用的媒介中，或者來自這里所述的組織分解過程。這里所使用的術(shù)語“傷口愈合”包括皮膚的所有病癥，其特征為，皮膚和/或其下的結(jié)締組織的任何疾病、紊亂、綜合征、不正常、病理或異常狀態(tài)，例如手術(shù)后的皮膚傷口， 機(jī)械性外傷引起的皮膚磨損，腐蝕或灼燒，白內(nèi)障手術(shù)或角膜移植后的角膜，感染或藥物治療后的黏膜上皮的傷口(例如呼吸道，胃腸道，泌尿生殖系統(tǒng)，乳腺，口腔，眼組織，肝和腎)，糖尿病傷口，移植后的皮膚傷口，血管修復(fù)術(shù)后的血管的再生長(zhǎng)。傷口、疾病或紊亂的治療是再生治療的開始。這里所使用的術(shù)語“缺血”是指，由于血液流入或流出的減少而導(dǎo)致的任何局部組織缺血?！叭毖詡凇笔侵?，由于氧不足而導(dǎo)致傷口不能收緊和表皮不能再生。傷口愈合還包括非愈合傷口。一些內(nèi)科和外科的情況形成非愈合傷口的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，例如糖尿病(I和 II型)，慢性外周血管疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，充血性心力衰竭，動(dòng)脈或靜脈潰瘍，淋巴水腫， 肥胖，使用外因性類固醇，脈管疾病傷口，手術(shù)傷口惡化，化學(xué)創(chuàng)傷，和化學(xué)治療或其他免疫抑制療法導(dǎo)致的傷口。這里所使用的術(shù)語“血管生成”是指，從現(xiàn)存的血管和組織中產(chǎn)生新的血管的過程 (Folkman，19%)?！靶迯?fù)或重塑”是指，現(xiàn)存血管的改造。組織缺血的緩和極度依賴血管生成。新血管的自發(fā)生長(zhǎng)在缺血區(qū)域提供間接的循環(huán)，改善血流，并減輕缺血引起的癥狀。血管生成解決了一些疾病和紊亂，包括急性心肌梗塞，缺血性心肌病，外周血管疾病，缺血性休克，急性腎小管壞死，包括AFT的缺血性傷口，膿血癥，慢性腸道疾病，糖尿病視網(wǎng)膜病， 神經(jīng)病和腎病，脈管炎(vasculitidies)，缺血性腦病，生理性勃起功能障礙，缺血性或創(chuàng)傷性脊髓外傷，多器官功能衰竭，缺血性牙齦疾病，和與移植有關(guān)的缺血。這里所使用的術(shù)語“干細(xì)胞”是指，具有分化成多種其他細(xì)胞類型潛能的多能再生細(xì)胞，其完成一種以上的特定功能并具有自我更新的能力。在此公開的一些干細(xì)胞可以是多功能的。這里所使用的術(shù)語“祖細(xì)胞”是指，具有分化成多于一種細(xì)胞類型的多能再生細(xì)胞，并具有有限的活沒有自我更新的能力。這里所用的“祖細(xì)胞”也指，具有只能分化成一種細(xì)胞類型潛能的單能細(xì)胞，其完成一種以上特定功能并具有有限的或沒有自我更新能力。 特別地，這里使用的“內(nèi)皮祖細(xì)胞”是指，具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞潛能的多能或單能細(xì)胞。這里所使用的術(shù)語“前體細(xì)胞”是指，具有分化成一種細(xì)胞類型潛能的單能再生細(xì)胞。前體細(xì)胞和它們的后代可以保持廣泛的增生能力，例如在適宜條件下能夠增生的淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
“血管生長(zhǎng)因子”或“血管生長(zhǎng)蛋白”是指，任何已知的蛋白質(zhì)，多肽或其他能夠促進(jìn)從現(xiàn)存血管生長(zhǎng)新的血管的物質(zhì)(“血管生成”)。本發(fā)明使用的適宜的血管生長(zhǎng)因子包括但不限于，胎盤生長(zhǎng)因子(Luttim等人，200 ，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Aharinejad等人， 1995)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落因子(Busclunarm等人，2003)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-A， VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (Mints 等人，2002)，神經(jīng)纖維蛋白(Wang 等人， 252003)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-1，F(xiàn)GF-2 (bFGF)，F(xiàn)GF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6 (Botta 等人，2000)，血管生成素1，血管生成素2 (Sundberg等人，2002)，紅細(xì)胞生成素(Ribatti等人，2003)，BMP-2, BMP-4, BMP-7 (Carano andFilvaroff, 2003)，TGF-β (Xiong 等人，2002)， IGF-I (Shigematsu 等人，1999)，骨橋蛋白(Asou 等人，2001)，Pleiotropin (Beecken 等人， 2000)，激活素(Lamouille 等人，2002)，內(nèi)皮素-l(Bagnato and Spinella, 2003)和它們的聯(lián)合體。血管生長(zhǎng)因子能夠獨(dú)立地發(fā)揮作用，或者與彼此聯(lián)合發(fā)揮作用。當(dāng)聯(lián)合時(shí)，血管生長(zhǎng)因子也能夠協(xié)同地發(fā)揮作用，因此因子的聯(lián)合效果大于因子單獨(dú)產(chǎn)生的效果的合計(jì)。“血管生長(zhǎng)因子”或“血管生長(zhǎng)蛋白”也這些因子的功能性類似物。功能性類似物包括，例如該等因子的功能性蛋白。功能性類似物還包括抗獨(dú)特型抗體，其連接該等因子的受體，并因此在促進(jìn)血管生成和/或組織重塑方面模擬了該等因子的活性。產(chǎn)生這樣地抗獨(dú)特型抗體的方法為本領(lǐng)域已知，并且例如在WO 97/23510中有所描述，其內(nèi)容被本文的文獻(xiàn)引用。本發(fā)明中使用的血管生長(zhǎng)因子可以制造從或任何適宜的來源得到。例如，該等因子可以從它們的天然來源純化，或人工制造或通過重組細(xì)胞表達(dá)。該等因子可以作為蛋白質(zhì)組合物被施加給病人?；蛘撸摰纫蜃涌梢砸跃幋a該等因子的表達(dá)質(zhì)粒的形式被施加給病人。適宜的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在本領(lǐng)域中是熟知的。用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的適宜的載體包括， 例如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，RNA載體，脂質(zhì)體，陽(yáng)離子脂質(zhì)體，慢病毒載體和轉(zhuǎn)位子。這里所使用的術(shù)語“干細(xì)胞數(shù)”或“干細(xì)胞頻率”是指，在細(xì)胞群落分析中觀察到的群落數(shù)量，在該分析中，脂肪細(xì)胞(ADC)以低密度(< 10. 000細(xì)胞/孔)覆蓋并在支持 MSC生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，含有10%胎牛血清，5%馬血清和15抗生物/抗真菌物質(zhì)的 DMEM/F12培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2周，然后用蘇木精染色，數(shù)出超過50個(gè)細(xì)胞群落則為CFU-F。干細(xì)胞頻率的計(jì)算式，覆蓋的每100個(gè)有核細(xì)胞中觀察到的CFU-F的數(shù)量(例如， 初始有核再生細(xì)胞數(shù)量為1000的板中數(shù)出15個(gè)群落，則其干細(xì)胞頻率為1.5%)。干細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算是，干細(xì)胞頻率乘以得到的有核ADC細(xì)胞的總數(shù)。很高比例( 100%)的由再生細(xì)胞培養(yǎng)的CFU-F表達(dá)細(xì)胞表面分子CD105，該分子也被骨髓來源的干細(xì)胞表達(dá)(Barry 等人，1999)。⑶105也被脂肪組織來源的干細(xì)胞表達(dá)(Zuk等人，2002)。這里所使用的術(shù)語“脂肪組織”是指，包括儲(chǔ)存脂肪的結(jié)締組織的脂肪。脂肪組織含有多種再生細(xì)胞類型，包括ASC和內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞。這里所使用的術(shù)語“脂肪組織單位”是指，不連續(xù)的或可測(cè)量的脂肪組織的總數(shù)。 可以通過確定一個(gè)脂肪組織單位的重量和/或體積來測(cè)量該脂肪組織單位。基于上述確定的數(shù)據(jù)，一個(gè)單位的脂肪抽吸細(xì)胞(processedlipoaspirate)，如從病人身上取下，具有至少0. 的細(xì)胞成分是干細(xì)胞的細(xì)胞成分。關(guān)于本發(fā)明，一個(gè)脂肪組織單位可以是指，從病人身上取下的全部脂肪組織，或者是少于從病人身上取下的全部脂肪組織的數(shù)量。因此，一個(gè)脂肪組織單位可以與另一個(gè)脂肪組織單位結(jié)合，形成的脂肪組織單位具有各自單位的總數(shù)的重量或體積。這里所使用的術(shù)語“部分”是指，少于全部的材料的數(shù)量。較小部分是指，小于50% 的數(shù)量，較大部分是指大于50 %的數(shù)量。因此，一個(gè)少于從病人身上取下的脂肪組織全部數(shù)量的脂肪組織單位就是取下的脂肪組織的一部分。這里所使用的術(shù)語“脂肪抽吸細(xì)胞”是指，為了從成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織中分離活性細(xì)胞成分(例如，包括再生的成分)而經(jīng)處理的脂肪組織。該片段在此是指，“脂肪來源的細(xì)胞”或“ADC”。典型地，ADC是指通過對(duì)來自脂肪組織的細(xì)胞進(jìn)行沖洗和分離和濃縮而得到的再生細(xì)胞團(tuán)塊。典型地，通過離心分離細(xì)胞懸浮液而獲得該團(tuán)塊，以便該等細(xì)胞聚集在離心室或細(xì)胞收集器的底部。這里所使用的術(shù)語“給藥”、“引入”、“釋放”、“放置”和“轉(zhuǎn)移”交替使用，是指通過
導(dǎo)致至少再生細(xì)胞部分地定位在期望部位的方法或途徑，將本發(fā)明的再生細(xì)胞放入受試者體內(nèi)。該等再生細(xì)胞可以通過任何適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，其導(dǎo)致向受試者的期望位置的釋放，在此位置至少一部分細(xì)胞或細(xì)胞成分是維持有效的。對(duì)受試者給藥后的細(xì)胞有效期間可以短為數(shù)小時(shí)，例如M小時(shí)，至數(shù)天，長(zhǎng)至數(shù)年。這里所使用的術(shù)語“處理”包括減少或減輕疾病或紊亂的至少一種不良作用或癥狀。這里所使用的術(shù)語“再生細(xì)胞的治療有效劑量”是指，足夠帶來有益或期望的臨床效果的再生細(xì)胞的數(shù)量。所述劑量可以通過一次以上的給藥方式來提供。但是，有效劑量的準(zhǔn)確確定可能是以每個(gè)病人的個(gè)體因素為基礎(chǔ)的，包括但不限于病人的年齡，身高，疾病的類型或程度，疾病的階段，再生細(xì)胞的給藥途徑，所用的輔助治療的類型或程度，正在進(jìn)行的疾病處理和期望的治療類型(例如，與常規(guī)治療相對(duì)的有創(chuàng)見的治療)。這里所使用的術(shù)語“受試者”包括恒溫動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該受試者是靈長(zhǎng)類。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，該受試者是人。如上所述，再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞可以從多種組織中獲得。本發(fā)明的系統(tǒng)可以用于所有這樣的組織。但是，脂肪組織是再生細(xì)胞的一個(gè)特別豐富的來源。所以，在此對(duì)本發(fā)明的系統(tǒng)進(jìn)行圖示說明，優(yōu)選但不限于通過實(shí)施例的方式，使用脂肪組織作為再生細(xì)胞的來源。脂肪細(xì)胞可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法得到。例如，可以通過抽脂 (輔助以注射器或動(dòng)力)或脂肪切取，例如負(fù)壓抽脂術(shù)，超聲抽脂術(shù)，和脂肪切取術(shù)或其聯(lián)用而從病人取下脂肪組織。脂肪組織被取下并收集，并可以按照所述的本發(fā)明系統(tǒng)的任意實(shí)施方式進(jìn)行處理。所收集的組織的數(shù)量依賴多種因素，包括身體質(zhì)量指數(shù)和提供者的年齡，收集的時(shí)間，可到達(dá)的脂肪組織采集部位的可用性，伴隨和預(yù)先存在的藥物治療和生理狀況(如抗凝血?jiǎng)┲委?，和收集該組織的臨床目的。例如，從瘦個(gè)體提取的IOOml脂肪組織的再生細(xì)胞比例高于從胖提供者提取得到的(表1)。這很可能反映胖個(gè)體的更多的脂肪容量的稀釋效果。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，可以期待從超重提供者得到與從較瘦病人抽取的數(shù)量相比更多的組織。這一發(fā)現(xiàn)也表明，本發(fā)明的應(yīng)用并不限于具有大量脂肪組織的個(gè)體。表1 身體質(zhì)量指數(shù)對(duì)組織和細(xì)胞收率的影響身體質(zhì)量指數(shù)狀況得到的組織的數(shù)量(g)總再生細(xì)胞正常641 ±1422. 1±0. 4肥胖1，2邪±1732. 4±0. 5P值0. 030. 6對(duì)脂肪組織進(jìn)行處理后，得到的再生細(xì)胞從成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織中充分游離。所以，本發(fā)明的系統(tǒng)產(chǎn)生大量不同種類的脂肪來源的再生細(xì)胞，其可以用于研究和/或治療目的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該等細(xì)胞適于在接受者體內(nèi)放置或再灌注。在其他實(shí)施方式中，該等細(xì)胞可以用于研究，例如該等細(xì)胞被用來建立能夠長(zhǎng)期存活、用于進(jìn)一步研究的干細(xì)胞或祖細(xì)胞系。下面具體說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其例子結(jié)合

。附圖和說明書中盡可能地使用了相同或相似的標(biāo)記數(shù)字，以指示相同或相似的部分。應(yīng)該注意的是，附圖為簡(jiǎn)化形式并不是準(zhǔn)確比例。關(guān)于此處的公開，為了簡(jiǎn)單明了的目的，關(guān)于附圖只使用了方向術(shù)語，如頂部，底部，左，右，上，下，上方，之上，之下，下方，后，前，末端，和最接近。這樣的方向術(shù)語不以任何方式限制本發(fā)明。雖然此處的公開涉及某些圖示說明的實(shí)施方式，但應(yīng)該理解為這些實(shí)施方式僅為舉例而并非限制。以下具體說明盡管討論的是例示的實(shí)施方式，但其目的是，覆蓋能夠落入權(quán)利要求所定義的本發(fā)明主旨和范圍內(nèi)的所有修改、選擇和等同的實(shí)施方式。本發(fā)明可以與本領(lǐng)域常規(guī)使用的多種醫(yī)療程序聯(lián)合使用。參考附圖，本發(fā)明的系統(tǒng)10 —般包括組織收集室20，處理室30，廢物室40，導(dǎo)出室50和樣品室60中的一個(gè)以上。多種室由一根以上的導(dǎo)管12相連，以便包括生物材料的流體可以在密閉、無菌的流體/組織路徑中從一個(gè)室流到另一個(gè)室。導(dǎo)管可以包括此處交替提到的剛性體或柔性體，分別如腔(lumens)和管(tubing)。在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)管是軟管的形式，如臨床設(shè)備中常規(guī)使用的聚乙烯管，硅樹脂或其他本領(lǐng)域中已知的材料。導(dǎo)管 12可以根據(jù)是希望流體通過還是希望組織通過而改變其尺寸。導(dǎo)管12也可以根據(jù)通過系統(tǒng)循環(huán)的組織或流體的數(shù)量而改變其尺寸。例如，為了使流體通過，導(dǎo)管的尺寸可以具有約 0. 060至0. 750英寸的直徑范圍，為了使組織通過，導(dǎo)管的尺寸可以具有約0. 312至0. 750 英寸的直徑范圍。通常，選擇導(dǎo)管尺寸來平衡導(dǎo)管能夠提供的體積和運(yùn)輸組織或流體通過所述導(dǎo)管需要的時(shí)間。在自動(dòng)控制的系統(tǒng)的實(shí)施方式中，必須確定所述參數(shù)，即體積和運(yùn)輸時(shí)間，以便適宜的信號(hào)能夠被傳遞到該系統(tǒng)的處理裝置。軟管也應(yīng)該能夠承受正壓力，該壓力由例如可以在該系統(tǒng)中使用的正排氣泵(positive displacementpumps)產(chǎn)生。系統(tǒng)的所有室可以包括一個(gè)以上的接口，例如出口 22或入口 21，其接受標(biāo)準(zhǔn)IV注射器和抽吸管連接。這些接口可以是密封接口，如橡膠隔膜密封的注射器針頭連接接口 51。 入口接口可以通過導(dǎo)管方式與一個(gè)以上的套管(沒有表示)連接。例如，組織入口接口 21 可以與一個(gè)完整單獨(dú)使用的抽脂套管連接，并且該導(dǎo)管可以是一軟管。一般設(shè)置這些導(dǎo)管來提供流體從系統(tǒng)的一個(gè)室到另一個(gè)室的通路。在其末端，這些導(dǎo)管和接口可以與，例如可以手動(dòng)或自動(dòng)控制的抽吸裝置(沒有表示)連接。該抽吸裝置可以是，例如注射器或電泵。
11該抽吸裝置應(yīng)該能夠提供足夠的負(fù)壓來從病人身上抽取組織。通?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員，例如外科醫(yī)生已知的任何合適的抽吸裝置。導(dǎo)管12可以進(jìn)一步包括一個(gè)以上的夾子(沒有表示)來控制該系統(tǒng)多種成分的材料流。這些夾子通過有效地密封該系統(tǒng)的不同區(qū)域，用于維持該系統(tǒng)的無菌性。 或者，導(dǎo)管12可以包括一個(gè)以上的控制通過該系統(tǒng)的材料流的閥門14。閥門12確定如附圖中的開口圓環(huán)(open circles)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些閥門可以是電動(dòng)閥門(electromechanical pinch valves)。在其他實(shí)施方式中，這些閥門可以是氣動(dòng)閥門(pneumatic valves)。在另一些實(shí)施方式中，這些閥門可以是水壓閥門(hydraulic valves)或機(jī)械閥門(mechanicalvalves)。這樣的閥門優(yōu)選通過可以與控制桿連接的控制系統(tǒng)來啟動(dòng)。這些控制桿可以手動(dòng)操縱，以便啟動(dòng)這些控制桿。在自動(dòng)控制的實(shí)施方式中， 該控制系統(tǒng)可以與控制桿和以預(yù)先確定的啟動(dòng)條件啟動(dòng)閥門的處理裝置連接。在一些自動(dòng)控制的實(shí)施方式中，閥門的啟動(dòng)可以是一部分自動(dòng)、一部分按照使用者的愛好，以便該處理可以被最優(yōu)化。在另一些實(shí)施方式中，一些閥門可以被手動(dòng)啟動(dòng)，另一些通過處理裝置被自動(dòng)啟動(dòng)。閥門14也可以與一個(gè)以上的泵，例如聯(lián)合使用蠕動(dòng)泵34或正排氣泵(沒有表示)連接。導(dǎo)管12和/或閥門14也可以包括傳感器四，例如光傳感器，超聲傳感器，壓力傳感器或本領(lǐng)域已知的其他形式的監(jiān)控器，其能夠區(qū)分流過該系統(tǒng)多種流體成分和流體級(jí)別。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，傳感器四可以是光學(xué)傳感器。該系統(tǒng)可以包括多個(gè)過濾器36。在一些實(shí)施方式中，這些過濾器可以是在系統(tǒng)觀的一個(gè)室內(nèi)。系統(tǒng)的不同的室可以包括不同的過濾器。這些過濾器可以有效地將再生細(xì)胞， 例如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞與不期望的細(xì)胞和可以按照該系統(tǒng)使用的未分解物質(zhì)分離開。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器部件36包括一個(gè)中空纖維過濾裝置。在另一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器部件36包括一個(gè)滲濾的過濾裝置，其可以使用或不使用沉淀處理。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，過濾器36包括一個(gè)離心裝置，其可以使用或不使用淘析裝置和處理。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)包括這些過濾裝置的聯(lián)用。本發(fā)明的過濾功能可以是雙重的，一些過濾器從最終的濃縮液中去除物質(zhì)，如膠原蛋白、游離脂質(zhì)體、游離脂肪細(xì)胞和殘留的膠原蛋白酶，另一些過濾器用來濃縮最終產(chǎn)物。該系統(tǒng)的過濾器可以包括多個(gè)直徑和/或長(zhǎng)度范圍為20 到800 μ m的孔。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，收集室20有一個(gè)預(yù)先固定的過濾器，其具有多個(gè)范圍為80到400 μ m孔。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，收集室20有一個(gè)預(yù)先固定的過濾器，其具有多個(gè)265gm的孔。在其他實(shí)施方式中，這些過濾器可以是可分離的和/或一次性的。該系統(tǒng)還可以包括一個(gè)以上的控溫裝置(沒有表示)，其用來調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的一個(gè)以上的室中含有的材料的溫度。該控溫裝置可以是加熱器，冷卻器或這兩者，即它可以能夠在加熱器和冷卻器之間轉(zhuǎn)換。該控溫裝置可以調(diào)節(jié)經(jīng)過該系統(tǒng)的任何物質(zhì)的溫度，包括組織、未分解的物質(zhì)，懸浮物質(zhì)，殘?jiān)镔|(zhì)，清洗物質(zhì)或添加劑。例如脂肪細(xì)胞的受熱促進(jìn)分解，而再生細(xì)胞產(chǎn)物的冷卻被期望用來維持其存活。而且，如果優(yōu)選的組織處理需要預(yù)溫的試劑，那么該控溫裝置的作用就是維持該預(yù)先確定的溫度，而不是提高或降低該溫度。為了維持一個(gè)密閉、無菌的流體/組織通路，所有接口和閥門可以包括一個(gè)維持該系統(tǒng)密閉結(jié)構(gòu)的封閉物。該封閉物可以是不能滲透液體、空氣和其他污染物的薄膜，或者是任何本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)?shù)姆忾]物。而且，該系統(tǒng)的所有的接口設(shè)計(jì)用來容納注射器、針頭或其他用于抽出室中材料的裝置，而不危及該系統(tǒng)的無菌性。如上所述，組織可以經(jīng)由任何技術(shù)上認(rèn)可的方法從病人身上提取。抽出的組織可以在被放置于處理系統(tǒng)之前被提取。典型地，抽出的組織通過導(dǎo)管12，經(jīng)密閉的進(jìn)入接口， 如橡膠隔膜密封的注射器針頭連接接口(沒有表示在收集室上)被轉(zhuǎn)移到收集室20?；蛘?， 該組織提取步驟可以是該系統(tǒng)的一。例如，該收集室20可以包括一個(gè)真空管11，其使用插入病人體內(nèi)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)套管促進(jìn)組織移動(dòng)。因此，在該實(shí)施方式中，整個(gè)系統(tǒng)與病人相連。 該組織可以通過一個(gè)入口接口 21，經(jīng)由導(dǎo)管，如作為密閉無菌通路的一部分的12a，被導(dǎo)入收集室20。收集室20可以包括多個(gè)柔性或剛性的罐或筒或其聯(lián)合體。例如，收集室20可以包括一個(gè)以上不同尺寸的剛性罐。收集室20還可以包括一個(gè)以上的軟袋子。在這樣的系統(tǒng)中，最好該袋子具有支持物，如內(nèi)部或外部的框架，其有助于在對(duì)袋子應(yīng)用吸力時(shí)，減少袋子折疊的可能性。收集室20的制造尺寸是，用以容納在處理室30中進(jìn)行清洗和濃縮處理階段前用于適當(dāng)清洗和分解該組織所需要的生理鹽水的數(shù)量。優(yōu)選，收集室20中存在的組織或流體的體積是可以容易裸眼確定的。例如，為了從脂肪組織中得到再生細(xì)胞，適宜的收集室具有容納800ml抽出脂肪和1200ml生理鹽水的容量。所以，在一個(gè)實(shí)施方式中， 收集室20具有至少2升的容納容量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，為了從血液中分離和濃縮血紅細(xì)胞，收集室20具有至少1. 5升的容量。通常，收集室20的尺寸依據(jù)從病人收集的組織的類型和數(shù)量而不同。收集室20的制造尺寸可以容納小至約5ml大至約2升的組織。對(duì)于較小的組織體積，例如5ml到100ml，該組織可以在轉(zhuǎn)移到收集室20之前被聚集。收集室20可以是使用任何適宜的能夠被消毒的生物適應(yīng)的材料構(gòu)建的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，收集室20是使用符合ISO 10993標(biāo)準(zhǔn)中所述的血管內(nèi)接觸生物適應(yīng)性需要的一次性的材料構(gòu)建的。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸(polycarbonate acrylic) 或ABS。收集室20的流體路徑優(yōu)選是無熱源的，即適于沒有疾病傳播危險(xiǎn)的血液使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，收集室20是使用使使用者能夠在視覺上確定室中存在的組織的大概體積的材料構(gòu)建的。在其他實(shí)施方式中，收集室20中組織和/或流體的體積是由自動(dòng)傳感器四確定的。收集室20的優(yōu)選設(shè)計(jì)便于在自動(dòng)控制的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)能夠以一個(gè)合理程度的準(zhǔn)確度確定室中存在的組織和/或流體的體積。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)以正負(fù)15%的準(zhǔn)確度感知收集室內(nèi)的體積。在僅以實(shí)施例方式提供的特定實(shí)施方式中，收集室20是剛性室的形式，例如一個(gè)由醫(yī)用等級(jí)的聚碳酸酯構(gòu)建的室，其含有一個(gè)預(yù)先固定的醫(yī)用等級(jí)聚酯材料的略圓錐性過濾器觀，其網(wǎng)孔尺寸為265 μ m(見圖5)。剛性組織收集器可以具有約8英寸高，約5英寸直徑的尺寸；壁厚可以為約0. 125英寸。可以通過例如一個(gè)以上用于抽吸管的接口，一個(gè)以上帶有用于利用無菌對(duì)接技術(shù)收集的管的接口，和/或一個(gè)以上用于針頭刺破橡膠隔膜連通的接口進(jìn)入該筒內(nèi)部。收集室20內(nèi)部預(yù)先固定的過濾器觀優(yōu)選的結(jié)構(gòu)是用于保留脂肪組織而濾去非脂肪組織，例如從病人身上取下的組織。更具體地，過濾器觀使脂質(zhì)體，血液和生理鹽水能夠通過，而保留脂肪組織的片段，這在該實(shí)施方式中是在脂肪組織最初獲取的期間，在另一個(gè)實(shí)施方式中是在脂肪組織最初獲取之后。因此，過濾器觀包括多個(gè)孔，尺寸相同或不同，但尺寸范圍為約20 μ m到約5mm。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，過濾器28包括多個(gè)400 μ m孔。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，過濾器28為約200 μ m厚的醫(yī)用等級(jí)聚酯網(wǎng)，其具有約265 μ m的孔尺寸和約47%的開放區(qū)域。在沖洗期間，該材料保留組織但組織分解后允
13許細(xì)胞通過網(wǎng)。因此，當(dāng)從病人抽取組織時(shí)，非脂肪組織可以從從脂肪組織中分離。使用不同材料、網(wǎng)尺寸和接口數(shù)量和類型可以獲得相同功能。例如，網(wǎng)孔尺寸小于ΙΟΟμπι或大到幾千微米都將獲得相同目的，即允許生理鹽水和血細(xì)胞通過而保留總脂肪組織或脂肪組織片段。類似地，通過使用可選的剛性塑料材料或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其他變體， 可以獲得相同目的。系統(tǒng)10也可以包括一個(gè)以上的溶液源(solution sources)22。該溶液源可以包括一個(gè)清洗溶液源23，和一個(gè)組織分解劑來源M，如膠原蛋白酶。收集室四包括密閉液體通路，該通路允許清洗和分解溶液或制劑以無菌的方式加入該組織。清洗溶液23和分解劑M的容器可以是能夠以無菌方式容納其內(nèi)容物的任何適宜容器，例如折疊式袋子，如臨床上使用的IV袋。這些容器可以具有與收集室20相連的導(dǎo)管 12，如導(dǎo)管12e，以便可以通過任何技術(shù)上認(rèn)可的方式將清洗溶液和分解劑運(yùn)送到收集室 20內(nèi)部，這樣的方式包括通過容器外邊使用的用于生理鹽水23和/或分解劑M的簡(jiǎn)單重力壓，或通過在導(dǎo)管例如圖4中的導(dǎo)管12d上設(shè)置正排氣泵。在自動(dòng)控制的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)的處理裝置參考多種參數(shù)，例如，生理鹽水的體積，清洗和濃縮需要的循環(huán)的時(shí)間或次數(shù)，或分解劑數(shù)量，和以使用者初始輸入信息為基礎(chǔ)的分解需要的時(shí)間(例如，被處理組織的體積)。或者，該數(shù)量，時(shí)間等可以通過使用者手動(dòng)控制。收集室內(nèi)的組織和/或流體應(yīng)該維持在范圍30°C到40°C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，收集室內(nèi)懸浮液的溫度維持在37°C。在一些實(shí)施方式中，如果外科處理或治療應(yīng)用需要延遲，則所選擇的組織可以被儲(chǔ)存在收集室中待用。該組織在約室溫下或約4°C最多可以被儲(chǔ)存96小時(shí)。該清洗溶液可以是任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜溶液，包括生理鹽水或其他緩沖液或非緩沖電解液。被處理的組織的類型決定所用的清洗溶液的類型或其聯(lián)用。典型地，脂肪組織被從病人身體取下并放在收集室內(nèi)后，向收集室20中加入該清洗溶液，如生理鹽水。但是，清洗溶液可以在脂肪組織被提取前加入收集室20，或者可以和脂肪組織同時(shí)加入收集室20。在收集室20中，清洗溶液和提取的脂肪組織可以利用包括下述方法的任何手段被混合。例如，該組織可以被攪動(dòng)清洗(其使細(xì)胞存活最大化并使釋放的游離脂質(zhì)體最小化)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該組織的攪動(dòng)是通過以不同弧度(例如，通過約45度到約90度)， 不同速度例如每分鐘約30轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)整個(gè)收集室20而進(jìn)行的。在其他實(shí)施方式中，該組織的攪動(dòng)是通過以不同弧度(例如，通過約45度到約90度)，不同速度例如每分鐘約30轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)整個(gè)收集室20而進(jìn)行的，其中，該收集室20包括一個(gè)以上的槳或緊貼在收集室內(nèi)表面的突起。上述收集室20的旋轉(zhuǎn)可以是借助與收集室20相連或鄰近的驅(qū)動(dòng)裝置完成的。該驅(qū)動(dòng)裝置可以是一個(gè)簡(jiǎn)單的皮帶或齒輪或本領(lǐng)域已知的其他裝置。旋轉(zhuǎn)速度可以是，例如，每分鐘30轉(zhuǎn)。通常，更高的速度產(chǎn)生更大體積的游離脂質(zhì)體，是不理想的。在其他實(shí)施方式中，該組織的攪動(dòng)是通過在收集室20內(nèi)放置一個(gè)可旋轉(zhuǎn)桿25，其中，該可旋轉(zhuǎn)桿包括一個(gè)以上的槳2 或緊貼于可旋轉(zhuǎn)桿25的突起，當(dāng)桿旋轉(zhuǎn)時(shí)其經(jīng)過混合物。在一些實(shí)施方式中，具有緊貼的2 槳的可旋轉(zhuǎn)桿25可以被置于收集室20的底部。 例如，這可以通過將槳狀裝置放置于旋轉(zhuǎn)的磁性區(qū)域(例如，磁力攪拌器)。或者，該組織的攪動(dòng)可以使用本領(lǐng)域已知的簡(jiǎn)單的攪拌器，即進(jìn)行上下?lián)u動(dòng)而非旋轉(zhuǎn)的裝置。該組織也可以使用包括搖晃，攪拌，倒置等任何技術(shù)上認(rèn)可的其他方法進(jìn)行清洗。
在期望數(shù)量的循環(huán)后，可以向收集室20中加入組織分解劑，從殘留的脂肪組織成分中分離再生細(xì)胞。分解劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分解劑?？梢允褂玫姆纸鈩┌ㄖ行缘鞍酌福z原蛋白酶，胰島素，脂肪酶，透明質(zhì)酸酶，脫氧核糖核酸酶，混合酶酶混合物族成員，例如Liberase Hl,胃蛋白酶，超聲或其他物理能量，激光，微波，其他機(jī)械裝置和/或其聯(lián)合。本發(fā)明優(yōu)選的分解劑為膠原蛋白酶。分解劑可以與其他溶液一起加入。例如，生理鹽水，如從上述生理鹽水源23釋放的生理鹽水，可以與或膠原蛋白酶一同或在膠原蛋白酶加入后即刻加入。在一個(gè)實(shí)施方式中，被清洗的脂肪組織在約37°C與含有膠原蛋白酶的酶溶液混合約20-60分鐘。在其他實(shí)施方式中，可以加入更高濃度的膠原蛋白酶或類似物質(zhì)來減少分解時(shí)間。然后，被清洗的脂肪組織和該組織分解劑可以通過與上述攪動(dòng)方式類似的方法攪動(dòng)，直至被清洗的脂肪組織被分解。例如，被清洗的脂肪組織和該組織分解劑的攪動(dòng)可以是，通過以大約90度的弧度旋轉(zhuǎn)整個(gè)收集室而進(jìn)行，通過使用包括一個(gè)以上槳的旋轉(zhuǎn)桿而進(jìn)行，該槳當(dāng)旋轉(zhuǎn)桿旋轉(zhuǎn)時(shí)經(jīng)過該溶液，和/或通過旋轉(zhuǎn)整個(gè)收集室而進(jìn)行，該收集室包括槳或收集室內(nèi)表面的突起。根據(jù)脂肪來源的細(xì)胞的使用目的，脂肪組織可以被部分分解，或完全分解。例如， 在脂肪來源的細(xì)胞與脂肪組織單位連接的實(shí)施方式中，期望獲得的脂肪組織部分地分解， 以去除一部分部分性分解的脂肪組織，然后對(duì)殘留在收集室中的剩余部分的脂肪繼續(xù)進(jìn)行分解?；蛘?，在任何分解之前，一部分經(jīng)清洗的脂肪組織可以被清除并留在樣品容器中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在再導(dǎo)回病人體內(nèi)之前，獲得的脂肪組織被部分地分解，濃縮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪組織與一種組織分解劑混合一段時(shí)間，通常小于約20分鐘。然后，可以從收集室清除一部分部分分解的組織，并通過將該脂肪組織與脂肪組織分解劑再混合40 分鐘，以保持剩余的部分分解的脂肪組織可以進(jìn)一步被分解。當(dāng)脂肪來源的細(xì)胞作為必需的純?cè)偕?xì)胞群使用時(shí)，脂肪組織可以被充分分解。分解后，該組織和分解劑溶液可以充分靜置一段時(shí)間，以使溶液中易浮起和不易浮起的成分在收集室中分化。典型地，在改進(jìn)的實(shí)施方式中，可以施行約15秒到幾分鐘的時(shí)間范圍，而非其他時(shí)間。易浮起層包括需要進(jìn)一步清洗和濃縮的再生細(xì)胞。不易浮起層包括血液，膠原蛋白，脂質(zhì)體和組織的其他非再生細(xì)胞成分。不易浮起層應(yīng)該被清除到廢物室。所以，優(yōu)選收集室20在該室的最低點(diǎn)包括一個(gè)出口接口 22，以發(fā)便血液和組織的其他不易浮起成分經(jīng)一個(gè)以上的導(dǎo)管12，可以被排出到一個(gè)以上的廢物容器40。收集室20 通常位于(或可以被放置于)垂直位置，以便出口接口 22被置于收集室的底部。這樣的排出可以是被動(dòng)的或主動(dòng)的。例如，利用重力，通過使用正或負(fù)壓力，通過使用泵34或通過使用排放口 32，上述不易浮起成分可以被排出。在自動(dòng)控制的實(shí)施方式中，處理裝置可以發(fā)出信號(hào)指示一些閥門和/或泵，從收集室20中排出不易浮起層。這些自動(dòng)控制的實(shí)施方式還可以包括傳感器四，其能夠檢測(cè)易浮起液體和不易浮起液體界面的形成。自動(dòng)控制的實(shí)施方式還可以包括傳感器四，例如光學(xué)傳感器，其能夠檢測(cè)經(jīng)導(dǎo)管流出收集室的排出物的光折射的變化。光折射可以以信號(hào)表明導(dǎo)出導(dǎo)管中不易浮起層的存在，這說明不易浮起層已經(jīng)排出。然后，傳感器四能夠發(fā)出信號(hào)指示處理裝置繼續(xù)進(jìn)行下一步。但是，在一些實(shí)施方式中，該組織可以經(jīng)處理重新得到組織的非再生細(xì)胞成分。例如，在一些治療或研究應(yīng)用中，可以期望的是膠原蛋白，蛋白質(zhì)，間質(zhì)或基質(zhì)成分，脂質(zhì)體，脂肪細(xì)胞或該組織的其他成分。在這樣的實(shí)施方式中，包括再生細(xì)胞的易浮起層如上所述必須被清除到廢物室。那么，不易浮起層被保持在系統(tǒng)中用于根據(jù)需要的進(jìn)一步處理。一旦不易浮起層被清除，則包括再生細(xì)胞的易浮起層可以進(jìn)行一次以上的清洗， 以清除殘留污染物。所以，典型地，收集室20包括一個(gè)以上用于向該室內(nèi)部運(yùn)送清洗溶液的接口 21，和一個(gè)以上用于將廢物和其他物質(zhì)從收集室20中直接排出的接口 22。例如，收集室可以包括一個(gè)以上所述的密閉的入口接口。收集室20還可以包括一個(gè)以上蓋子(沒有表示)，例如頂蓋和底蓋，用來進(jìn)一步保證該系統(tǒng)在廢物溶液被運(yùn)送進(jìn)入收集室和/或廢物被排出時(shí)，能夠維持無菌狀態(tài)。接口 21可以位于收集室蓋子上或收集室的側(cè)壁上?？梢允褂眯迈r洗液反復(fù)進(jìn)行清洗處理，直至該溶液中的不易浮起污染物殘留容量達(dá)到預(yù)先確定的水平。換言之，收集室中剩余的物質(zhì)可以被額外清洗一次以上，直至不期望的物質(zhì)的數(shù)量減少到期望的預(yù)先確定的水平，其中，收集室中剩余的物質(zhì)含有包括脂肪組織片段的上述易浮起物質(zhì)的混合物。確定清洗終點(diǎn)的一個(gè)方法是測(cè)量組織溶液中血紅細(xì)胞的數(shù)量。其可以通過測(cè)量^Onm波長(zhǎng)下的吸光度而完成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，約0. 546 到約0. 842是可以接受的。在清洗和/或分解期間，可以按需要向多個(gè)容器中加入一種以上添加劑來強(qiáng)化結(jié)果。添加劑的一些例子包括，優(yōu)化清洗和分解的物質(zhì)，增強(qiáng)處理期間活性細(xì)胞群存活能力的添加劑，抗菌劑(例如，抗生素)，溶解脂肪細(xì)胞和/或血紅細(xì)胞的添加劑，或豐富細(xì)胞群益處的添加劑(通過對(duì)固定相部分不同的附著性或其他方式促進(jìn)實(shí)質(zhì)性減少或豐富細(xì)胞群)。其他可能的添加劑包括促進(jìn)再生細(xì)胞恢復(fù)和生存發(fā)育的添加劑(例如，凋亡酶抑制劑)或減少對(duì)灌注或設(shè)置(emplacement)的不良反應(yīng)的可能性(例如，細(xì)胞或結(jié)締組織凝集的抑制劑)。充分靜置后，得到的被清洗的脂肪組織片段和組織分解劑的混合物的不易浮起部分將含有再生細(xì)胞，例如，干細(xì)胞和其他脂肪來源的祖細(xì)胞。如上所述，含有再生細(xì)胞的不易浮起部分將被輸送到處理室30，在這里，有益的再生細(xì)胞，例如脂肪來源的干細(xì)胞，將與該混合物的不易浮起部分的其他細(xì)胞和物質(zhì)分離。該不易浮起部分是指再生細(xì)胞組合物， 并含有多種不同類型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞，祖細(xì)胞，內(nèi)皮前體細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和此處所述的其他再生細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物還可以包括一種以上的污染物，如存在于脂肪組織片段中的膠原蛋白和其他結(jié)締組織蛋白質(zhì)及其片段，或來自組織分解過程的殘留的膠原蛋白酶。本發(fā)明的處理室30優(yōu)選設(shè)置在系統(tǒng)內(nèi)，以便再生細(xì)胞組合物通過導(dǎo)管12，閥門14 和泵34，以無菌方式從收集室20移動(dòng)到處理室30。設(shè)計(jì)處理室的尺寸以適應(yīng)IOml到1. 2L 范圍的組織/流體混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)該處理室的尺寸以適應(yīng)800ml。在一些實(shí)施方式中，全部再生細(xì)胞組合物從收集室20導(dǎo)入處理室30。但是，在其他實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物的一部分被導(dǎo)入處理室30，另一部分被導(dǎo)入系統(tǒng)的不同區(qū)域，例如樣品室60，稍后與在處理室30中被處理的細(xì)胞重新組合。處理室30可以使用任何適宜的可以消毒的生物適應(yīng)性材料構(gòu)建。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，處理室30是使用符合ISO 10993 標(biāo)準(zhǔn)中所述的血管內(nèi)接觸生物適應(yīng)性需要的一次性的材料構(gòu)建的。例如可以使用聚碳酸酯、丙烯酸、ABS、乙烯乙酸乙烯酯共聚物或苯乙烯-丁二烯共聚物(SBC)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該一次性處理室的流體通路是無熱源的。該處理室可以是塑料袋的形式，例如血庫(kù)中處理血時(shí)常規(guī)使用的塑料袋；或在其他實(shí)施方式中，其在結(jié)構(gòu)上可以使剛性的(圖6)。在一個(gè)實(shí)施方式中，處理室30可以與2001年12月7日提交的U. S.申請(qǐng)No. 10/316，127和 2002年12月20日提交的U. S.申請(qǐng)No. 10/325. 7 中公開的處理室類似，其內(nèi)容作為文獻(xiàn)全部引用。處理室30可以以任何適于分離和濃縮細(xì)胞的方式，包括過濾和離心和/或它們的聯(lián)合來構(gòu)建。在一些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物被從收集室20導(dǎo)入處理室30，在那里， 該組合物被過濾來分離和/或濃縮特定的再生細(xì)胞群。細(xì)胞分離是一種從其他不同成分或類型細(xì)胞中分離特定成分和細(xì)胞的方法。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物含有多種不同類型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞，祖細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，以及一種以上的污染物，如存在于脂肪組織片段中的膠原蛋白，或來自組織分解過程的殘留的膠原蛋白酶。存在于處理室30中的過濾器 36可以分離和濃縮再生細(xì)胞的特定亞群，例如干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞等。與細(xì)胞從液體中的過濾有關(guān)的一些變量包括但不限于，過濾器介質(zhì)的孔徑，孔的幾何學(xué)(形狀)，過濾器的表面積，被過濾溶液的流動(dòng)方向，跨膜壓力，該特定細(xì)胞群的稀釋，微粒尺寸和形狀，以及細(xì)胞尺寸和細(xì)胞活性。根據(jù)這里公開的內(nèi)容，典型地，期望分離或過濾的特定細(xì)胞是脂肪來源的干細(xì)胞。但是，在一些實(shí)施方式中，特定細(xì)胞可以包括單獨(dú)的或與干細(xì)胞結(jié)合的脂肪來源的祖細(xì)胞，如內(nèi)皮前體細(xì)胞，。再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)經(jīng)過過濾裝置，如過濾裝置36。在一些實(shí)施方式中， 過濾裝置36包括多個(gè)過濾器，其設(shè)置是為了完成不同功能和將再生細(xì)胞分成不同部分。例如，一個(gè)過濾器可以被設(shè)置用于從再生細(xì)胞組合物中分離膠原蛋白，一個(gè)過濾器可以被設(shè)置用于從再生細(xì)胞組合物中分離脂肪細(xì)胞和/或脂質(zhì)體，一個(gè)過濾器可以被設(shè)置用于從再生細(xì)胞中分離殘留的酶，如組織分解劑。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)過濾器能夠完成兩項(xiàng)功能，例如從組合物中分離膠原蛋白和組織分解劑。典型地，多個(gè)過濾器為連續(xù)設(shè)置；但是，最好至少一部分過濾器可以平行設(shè)置。過濾裝置36的連續(xù)設(shè)置的過濾器如圖2所示。過濾裝置36的平行設(shè)置的過濾器如圖3所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾裝置36包括第一過濾器，第二過濾器，和第三過濾器。第一過濾器被設(shè)置用來清除再生細(xì)胞組合物中存在的膠原蛋白微粒。典型地，這些膠原蛋白微粒為直徑約0. 1微米，長(zhǎng)度最長(zhǎng)20微米。這些膠原蛋白微粒根據(jù)分解而有各種不同的尺寸。它們還可以是纖維，意味著它們具有螺旋和扭曲。此處所述的任何過濾器可以是由聚醚砜、聚酯，PTFE，聚丙烯，PVDF，或可能的纖維素制造的。過濾膠原蛋白有兩種可能。一種是，先除去較大微粒，讓細(xì)胞通過，這需要約10微米范圍的過濾器的例子。第二種方法是， 使用較小尺寸的過濾器，如4. 5微米，目的是膠原蛋白被良好地分解，以便捕獲細(xì)胞，讓膠原蛋白通過。這需要使細(xì)胞流回過濾器的方式。還有一種完成過濾的可能是吸引并保留膠原蛋白纖維。第二過濾器被設(shè)置用來清除游離的不成熟的脂肪細(xì)胞，其在再生細(xì)胞組合物中不浮起。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二過濾器可以由聚酯材料構(gòu)建并具有約30到約50微米之間的孔徑，優(yōu)選孔徑為約40微米。盡管作為第二過濾器被提到，但這樣的裝置的設(shè)置可以是在第一位置，而非第二位置，來進(jìn)行初始的較大細(xì)胞和微粒的清除。第三過濾器被設(shè)置用來清除未被使用的或殘留的膠原蛋白酶或組合物中存在的其他組織分解劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶可能經(jīng)時(shí)降解。在一個(gè)實(shí)施方式中，第三過濾器包括多個(gè)直徑或長(zhǎng)度小于Iym的孔。在一些實(shí)施方式中，孔徑可以小于lym。在其他實(shí)施方式中，孔徑在IOkD
17和5之間。在一些實(shí)施方式中，第三過濾器可以被設(shè)置用來將再生細(xì)胞群濃縮進(jìn)入如上所述的小體積的生理鹽水或其他清洗溶液中。優(yōu)選，只有最后的過濾器是中空的纖維單元。不必所有過濾器都是中空的纖維類型。在優(yōu)選的實(shí)施中，中空纖維單元被用于最后的過濾器， 這是因?yàn)槠渥钣行У厍宄z原蛋白酶并具有對(duì)再生細(xì)胞的最小損害效果。在該裝置是分離隔板集合體的一個(gè)實(shí)施方式中，三個(gè)過濾器在分離的框架中。如果中空的纖維單元被用于第三過濾器，則將第一和第二過濾器合并在一個(gè)框架中就是可行的。如果最后的過濾器不是中空纖維構(gòu)成的，那么所有的三個(gè)過濾器都可以被包含在一個(gè)框架中。過濾裝置36的過濾器可以設(shè)置于處理室30中或作為與處理室30分離的組成而被提供。另外，過濾裝置36的過濾器可以被提供在多個(gè)處理室中或以內(nèi)部連接(inline) 的形式提供。在一些實(shí)施方式中，導(dǎo)管或通道可以用作一個(gè)或多個(gè)處理室?？梢詼p小處理室的尺寸以便其成為連接過濾器的導(dǎo)管的內(nèi)部體積。如果組織溶液的體積大小適宜，則此類型的系統(tǒng)經(jīng)正確地發(fā)揮作用。因此，當(dāng)細(xì)胞流流過過濾器時(shí)，通過容納細(xì)胞流而作為處理室發(fā)揮作用。注意使導(dǎo)管體積最小化，以便在填裝和運(yùn)行該系統(tǒng)時(shí)，細(xì)胞/組織不會(huì)不必要的損失。關(guān)于上述實(shí)施方式，包括被清洗的細(xì)胞和殘留膠原蛋白、脂肪細(xì)胞、和/或未分解的組織分解劑的再生細(xì)胞組合物，可以被導(dǎo)入第一過濾器，用以從組合物中清除至少一部分，優(yōu)選全部膠原蛋白微粒，以便極少，優(yōu)選沒有膠原蛋白微粒存在于被過濾的溶液中。然后，含有脂肪細(xì)胞和/或未分解的組織分解劑的被過濾的再生細(xì)胞組合物，可以被導(dǎo)入第二過濾器，用以從經(jīng)過濾的再生細(xì)胞中清除至少一部分，優(yōu)選全部游離脂肪細(xì)胞。隨后，經(jīng)兩次過濾的再生細(xì)胞被導(dǎo)入第三過濾器，例如所述的中空纖維過濾裝置，用以從再生細(xì)胞組合物中清除或減少未分解的組織分解劑。經(jīng)三次過濾的再生細(xì)胞組合物(即，經(jīng)過第一、 第二、第三過濾器后殘留的組合物)可以被導(dǎo)向多個(gè)出口，其可以包括具有多個(gè)出口的處理室30的一部分。這些出口能夠幫助維持必要的壓力，和提供經(jīng)由導(dǎo)管與其他容器的連接，容器可以包括收集室20，導(dǎo)出室50，和/或廢物容器40。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾裝置36的過濾器包括一個(gè)中空纖維過濾器成員?；蛘?，換言之，該過濾器包括由纖維介質(zhì)形成的中空管的集合體?？梢栽诠_的系統(tǒng)10中使用的過濾器介質(zhì)的例子包括聚砜，聚醚砜或混合的酯材料等。過濾介質(zhì)的這些中空纖維或中空管可以被包含在過濾裝置36的一個(gè)圓柱筒中。典型地，過濾介質(zhì)的單個(gè)管道或纖維具有范圍約0. Imn到約Imm的內(nèi)徑，優(yōu)選約0. 5mm。適宜的圓柱筒的直徑和長(zhǎng)度將決定能放置在圓筒內(nèi)的的過濾介質(zhì)單個(gè)管道的的數(shù)量。一個(gè)適宜的中空纖維過濾器筒的的例子是FiberFlo Tangential Flow Filter，批號(hào)#M-C_050K(Minntech，Minneapolis, Minnesota)。過濾器介質(zhì)的孔的尺寸范圍為約IOkilo Daltons到約5微米，優(yōu)選約0. 5微米。在中空纖維過濾器中，每個(gè)中空管的管身都具有第一末端和第二末端，以及位于管身內(nèi)并在第一末端和第二末端之間延伸的內(nèi)腔。每個(gè)中空管的管身包括多個(gè)孔。通常確定這些孔的方向，以便再生細(xì)胞組合物通過流經(jīng)管身內(nèi)腔而被過濾，并且如圖12A所示，要過濾的產(chǎn)物切向通過這些孔。換言之，液體中的較小微粒切向通過這些孔，相對(duì)地，流體通過管身內(nèi)腔。當(dāng)再生細(xì)胞組合物被過濾時(shí)，該組合物通過每個(gè)中空管的內(nèi)腔。優(yōu)選，組合物流與每個(gè)中空管的管身是相切的。通過使用切線流體，與其他過濾技術(shù)相比，可以增強(qiáng)干細(xì)胞的過濾效果。例如，根據(jù)一些過濾技術(shù)，過濾介質(zhì)孔的設(shè)置方式是，過濾器的方向與流體垂直，以致過濾介質(zhì)阻礙被過濾流體的通路，如圖12B所示。在這樣的過濾中，被過濾離開再生細(xì)胞組合物的微粒，例如干細(xì)胞，往往堵塞在過濾器的另一側(cè)而阻礙流體通過孔。這樣的阻礙降低過濾效果。另外，細(xì)部一直受到流體壓力加上細(xì)胞的重量，導(dǎo)致其聚集在過濾器的上游側(cè)。這可能導(dǎo)致增加干細(xì)胞溶解。因此，在這樣流體與過濾器孔方向平行的過濾技術(shù)中，當(dāng)流體通過孔時(shí)，大細(xì)胞和小微粒的導(dǎo)向都與過濾器相反，只是不期望的。結(jié)果，液體中的較大產(chǎn)物，如細(xì)胞，可能阻塞孔，因而降低過濾效果并增加細(xì)胞破裂或損傷的發(fā)生。相反，在本系統(tǒng)10的中空纖維結(jié)構(gòu)中，被過濾的流體在中空管內(nèi)腔流動(dòng)。在流體施加于管身內(nèi)側(cè)的正壓力和管身外側(cè)的負(fù)壓力的作用下，部分流體能夠通過過濾器管身的孔。在該實(shí)施方式中，細(xì)部沒有承受流體壓力或其他細(xì)胞的重量，因而干細(xì)胞上的剪應(yīng)力強(qiáng)度減小。因此，通過堵塞率和再生細(xì)胞溶解的減少，可以增加過濾效率。由于生理鹽水和多余蛋白質(zhì)的大小，過濾過程中，這些分子和其他小組分通過中空管管身的孔，到達(dá)中空管外側(cè)，并被導(dǎo)向廢物室40。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過中空管過濾介質(zhì)外側(cè)形成真空而使過濾加強(qiáng)。由于再生細(xì)胞的大小，例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞，這戲細(xì)胞不能通過管身的孔并因而保留的中空管過濾器的內(nèi)側(cè)(例如，在管腔內(nèi))，并經(jīng)由過濾器和處理室之間的導(dǎo)管被導(dǎo)回處理室 30或?qū)С鍪?0。在特定的實(shí)施方式中，中空纖維過濾器具有約0. 05微米的孔經(jīng)，并包括大約 550cm2表面積的過濾介質(zhì)。單個(gè)介質(zhì)管道具有約0. 5mm的直徑。在130ml再生細(xì)胞組合物的處理中，可以加入約120ml額外的生理鹽水。處理或過濾時(shí)間約8分鐘。中空纖維管管身兩側(cè)的壓力差(例如，管身腔內(nèi)的壓力和管身外的壓力)即被認(rèn)為是跨膜壓力。該跨膜壓力的范圍為約ImmHg到約500mmHg，優(yōu)選約200mmHg。使用中空纖維過濾器，有核細(xì)胞的平均修復(fù)和存活能力可以是可存活細(xì)胞的約80%。在這樣一個(gè)系統(tǒng)中減少的膠原蛋白酶的數(shù)量等于對(duì)數(shù)上降低3(three logreduction)。例如，如果從收集室輸送到處理室的再生細(xì)胞組合物中初始膠原蛋白酶濃度是0. 078U/ml，那么最終再生細(xì)胞組合物中的膠原蛋白酶濃度則是0. 00078U/ml。膠原蛋白酶在中空纖維過濾器中被清除，該中空纖維過濾器相當(dāng)于上述的第三過濾器。圖示說明一種以上的上述細(xì)胞過濾方法的處理室如附圖所示，特別是附圖1-3。關(guān)于附圖1-3，在處理室30和過濾裝置36的過濾室之間可以安裝一個(gè)泵，如泵34。另外，排放口和壓力傳感器，如排放口 32和壓力傳感器39可以與處理室30和過濾裝置36線形排放。 還可以裝配導(dǎo)出室50。在處理室30和過濾裝置36之間可以提供這些可選組成(例如，泵 34，排放口 32，壓力傳感器39和配置導(dǎo)出室50)，以便處理室30中的液體可以在流過過濾裝置36之前從這些可選組成的一個(gè)流向另一個(gè)。例如，液體在通過過濾裝置36之前可以流經(jīng)泵34?；蛘撸谠撓到y(tǒng)中，液體可以在通過過濾裝置之前通過壓力傳感器30，以獲得一個(gè)過濾前液壓。在一些情況下，也可以提供一個(gè)以上的這些組成作為處理室30的一部分， 如圖6中所示的排放口 32。在圖示的實(shí)施方式中，壓力傳感器30線形排列，用來確定再生細(xì)胞組合物進(jìn)入過濾裝置36的過濾室時(shí)由泵34產(chǎn)生的再生細(xì)胞組合物的壓力。這一構(gòu)造有助于監(jiān)測(cè)跨越濾膜的跨膜壓力。可以向再生細(xì)胞組合物中加入額外的生理鹽水或其他緩沖液或洗液，用以在該組合物通過過濾裝置36進(jìn)行過濾時(shí)，協(xié)助清除多余蛋白質(zhì)?？梢赃M(jìn)行反復(fù)多次的清洗來提高再生細(xì)胞的純度。在一些實(shí)施方式中，可以在任何步驟中加入生理鹽水，這被認(rèn)為對(duì)于增強(qiáng)過濾是必須的。在一個(gè)以實(shí)施例方式提供但不限于實(shí)施例的特定實(shí)施方式中，多余蛋白質(zhì)和生理鹽水或其他洗液以下述方式被清除。含有再生細(xì)胞、膠原蛋白、結(jié)締組織顆粒或片段的組合物通過一系列過濾器循環(huán)，直至得到最小體積。該最小體積是由總的滯留體積(hold up volume)決定的，是一些預(yù)先確定的常量。滯留體積就是當(dāng)所有處理室空時(shí)，保留在通道和導(dǎo)管中的液體體積。在一個(gè)實(shí)施方式中，最小體積是15ml。當(dāng)達(dá)到該最小體積時(shí)，預(yù)先確定體積的清洗液被導(dǎo)入該系統(tǒng)并與再生細(xì)胞組合物混合。然后，該清洗液和再生細(xì)胞組合物的混合物通過過濾器循環(huán)，直至再次達(dá)到最小體積。可以多次重復(fù)該循環(huán)以提高在世細(xì)胞的純度，或者換句話，是為了提高組合物中再生細(xì)胞向?qū)τ谄渌镔|(zhì)的比例。見圖10和 11。根據(jù)特定的實(shí)施方式，確定再生細(xì)胞組合物已經(jīng)洗去多余蛋白并被充分濃縮(在例示的實(shí)施方式中，可以使用約IXlO5到約IXlO7細(xì)胞/ml范圍的最小濃度，在優(yōu)選實(shí)施方式中，最小濃度可以是約IXlO7細(xì)胞/ml)后，可以將導(dǎo)出室50，例如一個(gè)導(dǎo)出袋與處理室30和/或過濾裝置36的出口接口連接。然后，可以打開排放口 32促使?jié)饪s的再生細(xì)胞排出。在一個(gè)實(shí)施方式中，在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行并被安排進(jìn)入電子控制的設(shè)備后，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定何時(shí)達(dá)到最小濃度。該確定可以是期望得到的-即期望得到多少干/祖細(xì)胞，或細(xì)胞濃度的范圍-的處理過程的輸入值?；诳茖W(xué)數(shù)據(jù)，需要獲得預(yù)先確定數(shù)量的脂肪組織，并放入系統(tǒng)以獲得期望的輸出。隨著排放口 32的打開，泵，如泵34可以發(fā)揮作用將濃縮的再生細(xì)胞輸送到導(dǎo)出袋。在一個(gè)實(shí)施方式中，導(dǎo)出袋50與具有一端帶配件的導(dǎo)管的空血袋相似。導(dǎo)出袋上的配件可以以無菌方式與出口接口連接，濃縮的再生細(xì)胞可以被輸送到導(dǎo)出袋。如圖1-3所示，系統(tǒng)10中可以安裝真空泵沈，來改變系統(tǒng)內(nèi)的壓力。例如，真空泵沈可以經(jīng)由導(dǎo)管，如導(dǎo)管12b，與收集室20相連，以引起收集室20內(nèi)的壓力降低。真空泵 26還可以經(jīng)導(dǎo)管，如導(dǎo)管12g與處理室30相連。關(guān)于與泵34連接的真空泵沈的操作，，可以裝備兩個(gè)分開的真空泵或真空源，或者通過使用閥門裝備一個(gè)單個(gè)真空泵，該閥門在處理過程的特定點(diǎn)將真空引力導(dǎo)向需要它的不同的導(dǎo)管。另外，真空泵沈可以經(jīng)由導(dǎo)管，如導(dǎo)管12f，與廢物室40相連。關(guān)于圖10和11，由真空泵沈產(chǎn)生的壓力可以被用來通過導(dǎo)管引導(dǎo)流體，包括再生細(xì)胞。該壓力可以在多個(gè)方向上供應(yīng)，例如，通過自動(dòng)或手動(dòng)控制系統(tǒng)10中一個(gè)以上的閥門14的位置。可以通過使用正壓力或使用負(fù)壓力，或者兩者的結(jié)合，使系統(tǒng)10發(fā)揮作用。 例如，再生細(xì)胞被拉動(dòng)經(jīng)過上述第一和第二過濾器進(jìn)入一個(gè)與第三過濾器相連的有支撐的軟容器中。該有支撐的軟容器可以是與第三過濾器的前部線形(連續(xù))連接。最終的導(dǎo)出室可以是位于第三過濾器的另一側(cè)(例如，下游側(cè))的一個(gè)有支撐的軟容器。在這一實(shí)施方式中，利用壓力，經(jīng)過過濾器將再生細(xì)胞從一個(gè)有支撐的柔軟容器移動(dòng)到另一個(gè)有支撐的柔軟容器中。在系統(tǒng)10的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以利用滲濾和沉降相結(jié)合，完成干細(xì)胞和/或脂肪來源的祖細(xì)胞的過濾。例如，這樣的系統(tǒng)使用先經(jīng)過再生細(xì)胞組合物(例如，包括干細(xì)胞和/或脂肪來源的祖細(xì)胞的組合物)，再經(jīng)過過濾器的生理鹽水。一些與細(xì)胞從再生細(xì)胞中的滲濾過濾有關(guān)的變量包括但不限于，過濾介質(zhì)的孔徑，孔的幾何學(xué)或形狀，過濾器的表面積，被過濾的再生細(xì)胞組合物的流動(dòng)方向，灌注的生理鹽水的流速，跨膜壓力，細(xì)胞群的稀釋，細(xì)部大小和活性。在系統(tǒng)10的一個(gè)實(shí)施方式中，處理室30使用了一個(gè)過濾裝置36，其進(jìn)行滲濾和沉降來分離和濃縮再生細(xì)胞。借助但不限于實(shí)施例的方式，處理室30被定義為如圖6所示的具有側(cè)壁30a，頂面30b，底面30c的圓柱體。頂面30b安裝有一個(gè)無菌排放口 32。在圖6的實(shí)施方式中，對(duì)包括過濾裝置的處理室30進(jìn)行了圖示說明，其包括兩個(gè)過濾器，如大孔過濾器36a和小孔過濾器36b。過濾器36a和過濾器36b的孔的大小范圍為約0.05微米到約10微米之間。大孔過濾器36a可以包括直徑約5μπι的孔，小孔過濾器 36b可以包括直徑約1-3 μ m的孔。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器具有約785mm2的表面積。過濾器36a和3 將處理室30的內(nèi)部分成第一室37a，第二室37b，和第三室37c。如圖6所示，第一室37a位于第二室37b和第三室37c之間。而且，所示第一室37a是處理室30中具有入口接口 31a和出口接口 31b的區(qū)域。圖示的處理室30包括提供由處理室30外向處理室30內(nèi)的流通路徑的多個(gè)接口，如接口 31a，北和31c。如圖所示，接口 31a，北和31c被安裝在處理室30室體的側(cè)壁30a。但是，接口 31a，北和31c也可以被設(shè)置在其他區(qū)域。圖示的接口 31a是入口接口的例子，其與一個(gè)導(dǎo)管相連以便含有再生細(xì)胞的組合物能夠通過并進(jìn)入處理室30內(nèi)。圖示的接口北是出口接口，其連有導(dǎo)管以便被分離和濃縮的細(xì)胞可以從處理室30排出。圖示的接口 31c是入口接口，其連有導(dǎo)管以便將新鮮的清洗液，如生理鹽水輸入處理室30內(nèi)。使用時(shí)，可以將再生細(xì)胞經(jīng)入口接口 31a導(dǎo)入中央室37a。生理鹽水或其他緩沖液經(jīng)入口接口 31c被導(dǎo)入底部室37b。生理鹽水也可以以約lOml/min的速率被引導(dǎo)通過室 37a中的再生細(xì)胞組合物。使生理鹽水的流速可以抵消重力。生理鹽水的流動(dòng)使室內(nèi)的細(xì)胞能夠基于細(xì)胞密度進(jìn)行分離。典型地，當(dāng)生理鹽水被向上推動(dòng)經(jīng)過組合物時(shí)，組合物中的較大細(xì)胞會(huì)沉到中央室37a的底部，而較小細(xì)胞和蛋白質(zhì)將被運(yùn)載經(jīng)過第二過濾器36b進(jìn)入頂部室37c。進(jìn)行過濾時(shí)調(diào)整生理鹽水的流速，以便較大細(xì)胞被帶動(dòng)到能使較小微粒被釋放并被生理鹽水帶走的位置。處理室30中還包括無菌閥門32，以保證在該處理裝置的三個(gè)室中維持適當(dāng)?shù)膲毫μ荻取?7c可以包括吸收介質(zhì)33。該吸收介質(zhì)的目的是捕捉溶液中的多于蛋白質(zhì)，以保證如果生理鹽水流速降低的話，它們不會(huì)越過過濾器返回處理溶液。吸收介質(zhì)可以是一種類型的過濾材料，其具有對(duì)物質(zhì)的吸收性或捕捉被濾除的物質(zhì)或成分。在頂部過濾器上可以加裝流出接口，幫助廢物流出。其另一個(gè)實(shí)施方式是在頂部應(yīng)用緩和的真空狀態(tài)，推動(dòng)廢物排出。如圖示的實(shí)施方式，吸收介質(zhì)可以在流速相對(duì)小時(shí)使用。然后， 多余的生理鹽水和蛋白質(zhì)被運(yùn)到廢物容器。如上所述，當(dāng)較大細(xì)胞(例如，脂肪來源的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)與較小細(xì)胞和蛋白質(zhì)充分分離后，含有被分離細(xì)胞的組合物就可以被濃縮。該組合物在經(jīng)出口接口 31b從室37a移出后或在室37a中時(shí)，可以被進(jìn)一步濃縮。在一個(gè)實(shí)施方式中，以下述方式使組合物中細(xì)胞的濃度提高。細(xì)胞被充分分離后，過濾器，如過濾器36a和36b可以向彼此移動(dòng)。 此移動(dòng)具有使兩過濾器間的體積(例如，室37a的體積)減小的作用。還可以提供一個(gè)與處理室30連接的振動(dòng)部分，來促進(jìn)組合物內(nèi)細(xì)胞的濃縮。在一個(gè)實(shí)施方式中，該振動(dòng)部分可以與過濾器36b (例如，小孔過濾器)連接。振動(dòng)可以減少過濾器中細(xì)胞溶解的發(fā)生。組合物體積的減少使多余的生理鹽水能夠作為廢物排出，并且細(xì)胞被濃縮為更小的體積。在另一個(gè)實(shí)施方式中，再生細(xì)胞的濃縮是以下述方式實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞被充分分離后，
21再生細(xì)胞組合物可以被運(yùn)送到另一個(gè)室(沒有表示)，其利用重力濾除多余的生理鹽水。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以在滲濾的同時(shí)發(fā)生沉降。該沉降可以通過在過濾器頂部引入該組合物而實(shí)現(xiàn)，該過濾器的孔的尺寸范圍是約IOkD到約2微米。在一個(gè)實(shí)施方式中，適宜的過濾器具有約1微米的孔。重力使生理鹽水和較小微粒通過過濾器而阻止該組合物中的細(xì)胞流過該過濾器。在得到期望的細(xì)胞濃度并且被過濾的較小微粒已經(jīng)被從下方的過濾器清除后，可以攪動(dòng)再生細(xì)胞組合物使其離開過濾器，接著該被濃縮得再生細(xì)胞可以被輸送到導(dǎo)出袋。較小微?？梢宰鳛閺U物經(jīng)出口被排出。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，來自收集室20的再生細(xì)胞組合物被運(yùn)送到處理室30， 在那里該組合物被離心來分離和濃縮再生細(xì)胞。離心的原理為本領(lǐng)域已知，出于簡(jiǎn)略的目的，在此不再重復(fù)。這里使用的是標(biāo)準(zhǔn)的、經(jīng)認(rèn)可的離心分離設(shè)備，成分和變量。一個(gè)用作離心分離設(shè)備部分的例示的處理室如圖7和8所示。典型地，離心設(shè)備使離心室(如圖7 所示)繞軸旋轉(zhuǎn)，因而使加在溶液中細(xì)胞上的力大于重力。溶液中濃重的物質(zhì)沉淀到離心室的一端，即圖7的導(dǎo)出室50，形成再生細(xì)胞團(tuán)塊。然后，該團(tuán)塊被再次懸浮以獲得具有期望濃度的細(xì)胞和/或期望體積的細(xì)胞和溶劑的溶液。圖7所示的處理室使用離心和重力兩者來分離和濃縮細(xì)胞。具體地，離心過程中，離心力引導(dǎo)再生細(xì)胞組合物中較濃的成分，例如再生細(xì)胞向著離心室的遠(yuǎn)端。當(dāng)離心室變慢并最終停止時(shí)，重力幫助該再生細(xì)胞停留在該離心室的遠(yuǎn)端并形成細(xì)胞團(tuán)塊。所以，再生細(xì)胞組合物的多余成分，即廢物可以被清除而不會(huì)破壞細(xì)胞團(tuán)塊。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，處理室可以包括一個(gè)旋轉(zhuǎn)薄膜過濾器形式的細(xì)胞濃縮器。在離心處理的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，也可以使用離心淘洗法。在此實(shí)施方式中，可以基于單個(gè)細(xì)胞的沉降率進(jìn)行細(xì)胞分離，以便離心所使用的定向力(例如，向外)使細(xì)胞和溶質(zhì)以不同的速度沉降。淘析中，靶細(xì)胞群的沉降速度與一個(gè)相反流速(例如，向內(nèi))對(duì)抗， 該相反流速是由與離心力反向注入的溶液產(chǎn)生的。調(diào)整改逆流，以便使該溶液中的細(xì)胞和微粒分離。淘析已經(jīng)被應(yīng)用在許多細(xì)胞分離的例子中(Inoue，Carsten等人1981 ；Hayner, Braim等人1984 ;Noga 1999)，并且根據(jù)本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在此應(yīng)用用于優(yōu)化流動(dòng)和離心參數(shù)的理論和實(shí)踐。圖9說明與本發(fā)明的淘析有關(guān)的原理。該淘析的實(shí)施方式在使用旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子對(duì)溶液施加力的方面與離心是類似的。一些與本發(fā)明的淘析分離有關(guān)的變量包括但不限于，旋轉(zhuǎn)室的大小和形狀，轉(zhuǎn)子的直徑，轉(zhuǎn)子的速度，逆流管的直徑，逆流的流速，和從溶液中清除的細(xì)胞和微粒的大小和密度。離心時(shí)，再生細(xì)胞可以基于單個(gè)細(xì)胞的密度而被分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物，例如含有再生細(xì)胞和膠原蛋白的溶液，如圖9. 1所示，被導(dǎo)入旋轉(zhuǎn)子的室中。該溶液被加入該室中后，以預(yù)先確定的速度向該室中加入生理鹽水。該生理鹽水流速的預(yù)先確定取決于轉(zhuǎn)子速度，細(xì)胞直徑，和以經(jīng)驗(yàn)確定的該室的常數(shù)。例如，可以使用一個(gè)類似于IV泵的設(shè)備控制流速。額外的生理鹽水的目的是在轉(zhuǎn)子內(nèi)提供一個(gè)環(huán)境，在那里較大微粒將移動(dòng)到該室的一端，而較小微粒將移動(dòng)到另一端，如圖9. 2所示。應(yīng)用時(shí)，調(diào)整生理鹽水流，以便較小微粒離開該室，移動(dòng)到廢物容器，如圖9. 3所示。該運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大體同源的細(xì)胞群，如干細(xì)胞。確定干細(xì)胞已經(jīng)同溶液中的其他物質(zhì)分離后(多余蛋白質(zhì)和游離脂質(zhì)體被從該室清除)，停止該逆流。然后，室內(nèi)的細(xì)胞會(huì)在該室的外側(cè)壁上形成濃縮的團(tuán)塊。倒轉(zhuǎn)逆流，細(xì)胞團(tuán)塊被運(yùn)送到導(dǎo)出袋。
如上所述，處理室30或?qū)С鍪?0可以包括一個(gè)以上的接口，例如接口 51或52。 一個(gè)以上的這些接口被設(shè)計(jì)用來將再生細(xì)胞或其一部分經(jīng)由導(dǎo)管運(yùn)送到其他外科設(shè)備，細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，細(xì)胞浸泡(cell marinading)設(shè)備，基因治療設(shè)備或純化設(shè)備中，這些再生細(xì)胞是使用上述任何方法的聯(lián)合得到的。這些接口也可以被設(shè)計(jì)用來將再生細(xì)胞經(jīng)由導(dǎo)管運(yùn)送到該系統(tǒng)中附加的室或容器中，或?yàn)榱伺c上述相同的目的作為另一個(gè)系統(tǒng)的一部分。這些接口和導(dǎo)管也可以用來添加一種以上的添加劑，例如生長(zhǎng)因子，再懸浮流體，細(xì)胞培養(yǎng)劑，細(xì)胞擴(kuò)張劑，細(xì)胞保存劑或細(xì)胞修飾劑，包括將基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的制劑。這些接口和導(dǎo)管也可以用來將再生細(xì)胞運(yùn)送到其他目標(biāo)，如植入材料(例如，支架或骨架片段(bone fragments)和其他外科植入物和設(shè)備。還可以通過重新組裝現(xiàn)存系統(tǒng)的一次性部件的相互連接，通過重新設(shè)計(jì)現(xiàn)存系統(tǒng)的處理方案，通過為現(xiàn)存系統(tǒng)提供不同或額外的容器和/或室，通過將細(xì)胞運(yùn)送到一個(gè)以上附加系統(tǒng)或設(shè)備和/或它們的聯(lián)合，從而開始對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步處理。例如，該系統(tǒng)可以通過上述的任何方式進(jìn)行重組，以便使用該系統(tǒng)得到的再生細(xì)胞可以經(jīng)受如下的一種以上 細(xì)胞擴(kuò)張(一種以上的再生細(xì)胞類型)和細(xì)胞維持(cell maintenance)(包括細(xì)胞片清洗和介質(zhì)更換)；移種；細(xì)胞接種；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(包括來自大量供應(yīng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的接種)；或取 (包括酶或取，非酶或取和機(jī)械刮擦獲取)；測(cè)量細(xì)胞活性；細(xì)胞平埋(例如，在微量滴定板上，包括從單個(gè)孔采摘細(xì)胞用于擴(kuò)張，細(xì)胞擴(kuò)張進(jìn)入新的孔)；高通量篩選；細(xì)胞治療用；基因治療用；組織工程學(xué)應(yīng)用；治療蛋白用；病毒疫苗用；獲取再生細(xì)胞或懸浮液用于儲(chǔ)備或篩選，細(xì)胞生長(zhǎng)、溶解、接種、傳染、誘導(dǎo)的測(cè)量；細(xì)胞系的產(chǎn)生(包括雜交瘤細(xì)胞)；用于滲透性研究的西部的培養(yǎng)；用于RNAi和抗病毒研究的細(xì)胞；用于基因敲除和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的細(xì)胞；親和純化研究；結(jié)構(gòu)生物學(xué)應(yīng)用；化驗(yàn)開發(fā)和蛋白質(zhì)工程應(yīng)用。例如，如果為了特定的使用而需要再生細(xì)胞的擴(kuò)張，則可以使用以下方法，即利用培養(yǎng)條件優(yōu)先擴(kuò)張?jiān)撊憾渌河捎谌鄙偕L(zhǎng)條件而或者維持或者喪失。kkiya等人已經(jīng)描述了相關(guān)的可以用于骨髓來源的干細(xì)胞的條件Gekiya等人，200 。該方法(有或沒有對(duì)組織培養(yǎng)塑料品的不同黏附性)可以用于本發(fā)明的更多的實(shí)施方式。在該實(shí)施方式中，最終的再生細(xì)胞團(tuán)塊被從導(dǎo)出室清除并被置于另一個(gè)系統(tǒng)，提供細(xì)胞培養(yǎng)成分。這可以是以常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)孵育器方式或生物反應(yīng)器型設(shè)備，如Tsao等人，美國(guó)專利 No. 6，001，642，或Armstrong等人，美國(guó)專利No. 6，238，908中所述。在另一個(gè)備選的實(shí)施方式中，細(xì)胞擴(kuò)張貨細(xì)胞培養(yǎng)成分可以被加入到現(xiàn)存的系統(tǒng)中，例如，加入到處室，提供短期黏附和脂肪來源的細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)。該備選的實(shí)施方式允許細(xì)胞培養(yǎng)和/或細(xì)胞擴(kuò)張成分的結(jié)合，并排除了從該系統(tǒng)中清除該細(xì)胞并放置在另一系統(tǒng)內(nèi)的需要。處理期間，可以根據(jù)需要加入一種以上的添加劑或提供多個(gè)室或容器，以強(qiáng)化結(jié)果。這些添加劑也可以作為與現(xiàn)存系統(tǒng)有關(guān)的或與現(xiàn)存系統(tǒng)分離的另一系統(tǒng)的一部分被提供。例如，在一些實(shí)施方式中，添加劑被加入或提供，并不需要從該系統(tǒng)中清除再生細(xì)胞。在另一些實(shí)施方式中，通過以無菌的方式將含有添加劑的容器或室與該系統(tǒng)未使用的接口連接，添加或提供添加劑。在其他實(shí)施方式中，添加劑被加入或提供在另一個(gè)系統(tǒng)或設(shè)備中， 其并不語本發(fā)明的系統(tǒng)相連。一些添加劑的例子包括優(yōu)化清洗和分解的制劑，增強(qiáng)活性細(xì)胞群在處理過程中的存活能力的添加劑，抗菌劑(例如，抗生素)，溶解脂肪細(xì)胞和/或血紅細(xì)胞的添加劑，或豐富細(xì)胞群益處的添加劑(通過對(duì)固定相部分不同的附著性或其他方式促進(jìn)實(shí)質(zhì)性減少或豐富細(xì)胞群)。例如，為了得到同源再生細(xì)胞群，可以使用用于分離和濃縮特定再生細(xì)胞類型的任何適當(dāng)?shù)姆椒?，例如使用識(shí)別并結(jié)合抗原的細(xì)胞特異性抗體，該抗原存在于例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞上，例如內(nèi)皮前體細(xì)胞。這些既包括陽(yáng)性選擇(選擇靶細(xì)胞)也包括陰性選擇(選擇性去除多余細(xì)胞)，或它們的結(jié)合。使用與特定酶作用發(fā)出熒光的分子，則細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，如酶也可以用在選擇中。另外，在本系統(tǒng)的到處室中可以附有具有粘性的固相材料，其用來提供最終細(xì)胞團(tuán)塊中特定再生細(xì)胞群的特異性黏附和/或洗脫。該特異性黏附方法的一個(gè)備選實(shí)施方式包括，使用特異性表達(dá)在靶再生細(xì)胞和多余細(xì)胞表面的分子的抗體和/或抗體的結(jié)合物。另一項(xiàng)普遍應(yīng)用的技術(shù)是，基于特定細(xì)胞表面標(biāo)記物(或其結(jié)合物)的表達(dá)的選擇，其中，抗體附于固相支持結(jié)構(gòu)上(Geiselhart等人，1996 ；Formanek 等人，1998 ；Graepler 等人，1998 ；Kobari 等人，2001 ；Mohr 等人，2001)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞團(tuán)塊可以被再懸浮，在流體物質(zhì)上(或下)成層，形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，并被置于離心機(jī)中，根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行分離。在類似的實(shí)施方式中，可以使用連續(xù)流動(dòng)方法，如血漿分離置換法(Smith，1997)和淘析法(有或沒有逆流) (Lasch 等人，2000) (Ito 和 Shinomiya, 2001)。添加劑的其他例子包括附加的生物或結(jié)構(gòu)成分，例如所述的細(xì)胞分化因子，生長(zhǎng)促進(jìn)劑，免疫抑制劑，醫(yī)療設(shè)備，或它們的連用。例如，可以加入其他的細(xì)胞，組織，組織片段，生長(zhǎng)因子，如VEGF和其他已知的血管或動(dòng)脈(arteriogenic)生長(zhǎng)因子，生物活性或惰性化合物，吸收性支架，或其他能夠增強(qiáng)再生細(xì)胞群的傳遞性，有效性，耐受性或功能的添加劑。也可以通過DNA插入或通過放置于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如本文所述或已知技術(shù))中，而在改變，增強(qiáng)，或補(bǔ)充再生細(xì)胞用于結(jié)構(gòu)或治療目的所需的功能方面，使再生細(xì)胞群得到改進(jìn)。例如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的干細(xì)胞的基因移植技術(shù)，如(Morizono等人，2003 ； Mosca等人，2000)中的公開，并可以包括病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，和更具體的，腺相關(guān)病毒基因移植技術(shù)，如(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中的公開。也可以施用(Muramatsu等人，1998)中公開的基于非病毒的技術(shù)。還可以加入一個(gè)基因編碼的一種以上的細(xì)胞分化因子，例如，生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子。(Gimble等人，1995 ；Lermon等人，1995 ； Majumdar 等人，1998 ；Caplan 和 Goldberg，1999 ；Ohgushi 和 Caplan，1999 ；Pittenger 等人， 1999 ；CapIan和 Bruder，2001 ；Fukuda, 2001 ；Worster 等人，2001 ；Zuk 等人，202001)中公開了多個(gè)細(xì)胞分化劑的例子。也可以加入多個(gè)基因編碼的抗調(diào)亡因子或物質(zhì)。基因增加(或基因結(jié)合)可以是通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，包括但不限于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，“基因槍”，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，和反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，質(zhì)粒，腺相關(guān)病毒。然后，這些再生細(xì)胞可以與攜帶基因傳遞媒介的載體材料一同被灌注，這些基因傳遞媒介能夠經(jīng)時(shí)將基因釋放和/或提供給細(xì)胞，以便轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠在原位繼續(xù)或被啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞和/或含有該細(xì)胞的組織被施加該細(xì)胞和/或組織來源病人以外的病人時(shí)，可以對(duì)接受該細(xì)胞和/或組織的病人施加一種以上的免疫抑制劑，以便減輕，優(yōu)選阻止移植排斥。這里所用的術(shù)語“免疫抑制藥或免疫抑制劑”是指，抑制或干擾正常免疫功能的藥物。適用于此處公開的方法的免疫抑制劑的例子包括，抑制T細(xì)胞/B細(xì)胞協(xié)同刺激途徑的物質(zhì)，如美國(guó)專利公開No. 20020182211中公開的，干擾T細(xì)胞和B細(xì)胞經(jīng)CTLA4 和B7偶聯(lián)的途徑。優(yōu)選的免疫抑制劑為環(huán)孢霉素A。其他例子包括霉酚酸酯、納巴霉素(rapamicin)和抗胸腺細(xì)胞球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫抑制藥與至少一種其他治療劑一同給藥。免疫抑制藥以與藥途徑相匹配的方式和足以得到期望療效的劑量被施加。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫抑制藥被短期地施加足夠的時(shí)間，以引起對(duì)本發(fā)明的再生細(xì)胞的耐受性。在這些實(shí)施方式中，可以通過任何公認(rèn)的方式，包括裝置如攪拌裝置和這里所述的有關(guān)方法，將再生細(xì)胞與添加劑接觸，合并，混合或添加。例如，可以使用搖動(dòng)，倒置，脈沖加壓或移動(dòng)滾筒。另一方面，細(xì)胞群可以被放入接收者體內(nèi)，并被可再吸收的塑料外殼或其他材料和有關(guān)成分，如MacroPore Biosurgery, Inc制造的材料(見例如，美國(guó)專利 Nos. 6，269，716 ；5. 919，234 ；6，673，362 ；6，635，064 ；6，653，146 ；6，391，059 ；6，343，531 ； 6，280，473)所包圍。在上述所有的實(shí)施方式中，至少一部分被分離和濃縮的再生細(xì)胞可以被低溫保存，如2002年9月12日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/242, 094，題目是來自非造血組織的非胚胎細(xì)胞的保存(PRESERVATION OF N0NEMBRY0NIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETIC TISSUES)，其要求保護(hù)2001年9月14日提出的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/322，070的權(quán)利，其被普遍發(fā)行，且其全部?jī)?nèi)容在此被清楚地弓I用。處理結(jié)束，再生細(xì)胞可以被手動(dòng)地從到處室取回。該細(xì)胞可以被裝入一個(gè)傳遞釋放設(shè)備，如注射器，通過皮下注射、肌肉注射、或其他能夠使該細(xì)胞釋放到病人體內(nèi)目標(biāo)部位的技術(shù)，被放入接收者體內(nèi)。換言之，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式將細(xì)胞放入病人體內(nèi)。優(yōu)選的實(shí)施方式包括，通過針頭或?qū)Ч?，或直接的外科植入方式。在其他?shí)施方式中，該細(xì)胞可以被自動(dòng)輸送到導(dǎo)出室，導(dǎo)出室可以是容器、注射器或?qū)Ч艿刃问?，其可以用來將?xì)胞放入病人體內(nèi)。容器也可以用來為以后的使用或低溫保存而儲(chǔ)藏細(xì)胞。全部取回方式都是以無菌方式完成的。在外科植入的實(shí)施方式中，西部可以與添加劑，如所述預(yù)成型的模具或支架聯(lián)合使用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中(例如，圖4所示的實(shí)施方式)，該系統(tǒng)是自動(dòng)控制的。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)既是自動(dòng)控制也是手動(dòng)控制的組件。該系統(tǒng)可以包括一個(gè)以上一次性構(gòu)件，其連接于或安裝在可重復(fù)使用的金屬構(gòu)架或組合部件內(nèi)。本發(fā)明的自動(dòng)控制的系統(tǒng)提供提示系統(tǒng)正確操作的屏幕顯示(見圖16)。自動(dòng)控制系統(tǒng)還可以提供一個(gè)提供屏幕，其提供程序狀況和/或關(guān)于正確建立該系統(tǒng)的一次性構(gòu)造一步一步的指示。如果系統(tǒng)中發(fā)生問題或錯(cuò)誤時(shí)，該屏幕還可以進(jìn)行指示，并提供“故障判斷并排除”的指導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該屏幕一個(gè)使用者的界面屏幕，它允許使用者通過例如觸摸屏，向該系統(tǒng)中輸入?yún)?shù)。部分或全部自動(dòng)控制系統(tǒng)可以包括一個(gè)處理設(shè)備(例如，微處理器或個(gè)人電腦) 和有關(guān)軟件程序，其基于使用者的輸入為系統(tǒng)提供控制邏輯來操作和自動(dòng)控制一個(gè)以上的處理步驟。在一些實(shí)施方式中，一項(xiàng)以上的內(nèi)容是使用者可以利用處理設(shè)備內(nèi)的軟件進(jìn)行預(yù)先編程的。該處理設(shè)備在只讀存儲(chǔ)器中可以具有一個(gè)以上預(yù)先編程的軟件程序。例如， 該處理設(shè)備可以具有適合處理血液的預(yù)先編程的軟件，用于處理脂肪組織來獲得小體積的再生細(xì)胞的另一個(gè)程序，和用于處理脂肪組織來獲得大體積的再生細(xì)胞的另一程序。該處理設(shè)備還可以具有如下預(yù)先編程的軟件，其根據(jù)使用者輸入的相關(guān)信息，如所需要的再生細(xì)胞數(shù)量，被處理的組織類型，所需要的后處理操作的類型，質(zhì)量應(yīng)用的類型等，為使用者提供合適的參數(shù)來優(yōu)化該處理。該軟件還可以提供一些自動(dòng)控制步驟，例如通過控制泵和系統(tǒng)的閥門控制流體和組織沿特定通道的出入；控制活化的正確順序和/或方向；用壓力傳感器檢測(cè)障礙；混合機(jī)構(gòu)，使用測(cè)定體積的機(jī)構(gòu)測(cè)量沿特定通路移動(dòng)的組織和/或流體的數(shù)量；使用熱控裝置保持多種成分的溫度；和利用定時(shí)和軟件機(jī)制合并分離和濃縮處理。該處理設(shè)備還能夠根據(jù)被處理的組織類型和/或被獲得的細(xì)胞群或亞群，和被執(zhí)行的程序的類型(例如，使用再生細(xì)胞擴(kuò)張的脂肪組織的脂肪增加，或用于使用再生細(xì)胞涂覆的骨移植進(jìn)行骨修復(fù)的細(xì)胞的處理)，對(duì)離心的速度進(jìn)行控制。該處理設(shè)備還可以包括標(biāo)準(zhǔn)的平行或連續(xù)的接口或者與其他計(jì)算機(jī)或網(wǎng)絡(luò)連通的其他方式。所以，該處理設(shè)備可以使一個(gè)單獨(dú)的單元，或與一個(gè)以上用于這里所述的進(jìn)一步處理方法的附加設(shè)備相連。軟件可以允許“運(yùn)行數(shù)據(jù)”的自動(dòng)采集，包括例如一次性成分的份數(shù)，測(cè)量的溫度和體積，組織體積和細(xì)胞數(shù)量參數(shù)，所用酶的劑量，孵育時(shí)間，操作者身份，日期和時(shí)間，病人身份等。在被設(shè)備的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將引入一個(gè)特征識(shí)別系統(tǒng)，如條碼讀解系統(tǒng)， 來準(zhǔn)許這些變量(例如一次性裝置的份數(shù)和有效日期，膠原蛋白酶的份數(shù)和有效期，病人/ 樣品標(biāo)識(shí)符等)的數(shù)據(jù)作為處理文件的一部分輸入該處理設(shè)備。這將減少數(shù)據(jù)輸入錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)。使用USB或其他本領(lǐng)域已知的界面接口和系統(tǒng)，這樣的條碼讀解系統(tǒng)可以被很容易地引入。以此方式，該設(shè)備將提供數(shù)據(jù)輸入和文件處理的綜合控制。這些參數(shù)的打印輸入報(bào)告將是該系統(tǒng)變成操作中由使用者定義的參數(shù)的一部分。自然地，這將需要打印機(jī)部分 (硬件和驅(qū)動(dòng)程序)或軟件中的打印機(jī)驅(qū)動(dòng)加上設(shè)備硬件中連接打印機(jī)的端口輸出(例如， USB 接口)。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)為全自動(dòng)系統(tǒng)。例如，使用者可以初始選擇被處理組織的數(shù)量，將該系統(tǒng)與病人相連，該系統(tǒng)可以自動(dòng)抽取所需組織，并以不間斷的順序分離和濃縮再生細(xì)胞，而不需要使用者的進(jìn)一步輸入。使用者也可以輸入所需要的再生細(xì)胞的數(shù)量， 并允許該系統(tǒng)抽取需要數(shù)量的組織并進(jìn)行處理。全自動(dòng)系統(tǒng)還包括，能夠根據(jù)多個(gè)(例如， 兩個(gè)以上)使用者輸入的參數(shù)，例如清洗循環(huán)的數(shù)量、離心速度等，進(jìn)行重組的系統(tǒng)。該系統(tǒng)也可以以半自動(dòng)的模式運(yùn)行，運(yùn)行過程中該系統(tǒng)一些步驟的進(jìn)行可以不需要使用者的干涉，但某些處理的發(fā)生需要使用者的干涉。其他實(shí)施方式中，該系統(tǒng)是一個(gè)單個(gè)完整的系統(tǒng)，其顯示指令來指導(dǎo)使用者在預(yù)先確定的時(shí)間完成預(yù)先確定的操作。例如，處理設(shè)備可以提示使用者導(dǎo)管、室和系統(tǒng)其他構(gòu)造正確插入所必需的步驟。所以，使用者能夠確保操作正確順序的進(jìn)行。這樣地系統(tǒng)可能額外需要使用者確認(rèn)每個(gè)操作步驟，以防止處理中的疏忽行為或終止步驟。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)可以啟動(dòng)自動(dòng)檢測(cè)來確定導(dǎo)管、室的正確插入，無障礙等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠被編程，自動(dòng)控制流經(jīng)系統(tǒng)的組織， 來完成多個(gè)分離和濃縮處理。這一特點(diǎn)在例如在對(duì)病人進(jìn)行的外科手術(shù)中是很重要的，其將可能流失的組織收集到系統(tǒng)中，并再生細(xì)胞從該組織中分離和濃縮，返回病人。如上所述，該系統(tǒng)的組件可以是一次性的(這里稱為“一次性裝置”)，以便該系統(tǒng)的部分在一次使用后可以被除去。這一操作能夠幫助保證，與病人的組織接觸的任何表面在使用后被適當(dāng)處理掉。一個(gè)示范的一次性裝置如圖13所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的一次性構(gòu)造被預(yù)先消毒并包裝，以成為可以使用的“現(xiàn)成”產(chǎn)品，其便于使用和裝載，并且排除了對(duì)于許多管道連接和管道連接的復(fù)雜線路的需要。這樣的一次性構(gòu)造相對(duì)于產(chǎn)品是比較便宜的，并因?yàn)樗鼈兊目梢淮问褂眯远辉斐蓪?shí)質(zhì)的費(fèi)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，該一次性系統(tǒng)(交替稱為“一次性裝置”)包括收集室20，處理室30，廢物室40，導(dǎo)出室50，過濾裝置36，樣品袋60和有關(guān)導(dǎo)管12或管道，基本由這些組成，或由這些組成。在本系統(tǒng)一次性裝置的優(yōu)選實(shí)施方式中，收集室20和處理室30由導(dǎo)管12連接，并被安裝在一個(gè)剛性框架中。處理室30的旋轉(zhuǎn)密閉網(wǎng)(圖7和8)也可以被安裝在相同的剛性框架中。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，一次性裝置的多個(gè)室和容器包括能夠與該系統(tǒng)的處理設(shè)備連通的必需的端口，以便泵、閥門、傳感器和自動(dòng)控制該系統(tǒng)的其他設(shè)備可以根據(jù)需要啟動(dòng)或不啟動(dòng)，而無需使用者的干預(yù)。該端口也可以減少建立該系統(tǒng)需要的時(shí)間和專門技術(shù)，并通過指示如何正確安裝該系統(tǒng)和在錯(cuò)誤發(fā)生時(shí)發(fā)出信號(hào)而減少錯(cuò)誤的發(fā)生。本發(fā)明的多數(shù)一次性裝置具有許多普通元件。但是，普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，該系統(tǒng)的不同應(yīng)用可能需要額外的構(gòu)造，其也許是一次性裝置的一部分。所以，該一次性裝置可以進(jìn)一步包括，一個(gè)以上適于從病人獲得脂肪或其他組織并將再生細(xì)胞返回病人的針頭或注射器。所包括的針頭和注射器的型號(hào)、數(shù)量和種類依賴于被處理的組織的類型和數(shù)量。該一次性裝置可以進(jìn)一步包括一個(gè)以上剛性或柔性容器，來容納洗液和系統(tǒng)中使用的其他處理試劑。例如，該一次性裝置可以包括容納生理鹽水、酶和過程需要的任何其他處理或置換的液體。另外，適宜的洗液、再懸浮流體、添加劑、試劑或移植材料可以與該一次性裝置一起提供，協(xié)助本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的使用。可以以試劑盒的形式提供實(shí)施本發(fā)明所需要的系統(tǒng)構(gòu)造、裝備或所述增補(bǔ)品的合并等。例如，本發(fā)明的試劑盒可以包括，例如用于吸脂注射器的最佳長(zhǎng)度和定量的針頭，和包括能夠處理小體積組織的優(yōu)選過濾介質(zhì)的注射器。其他例示的可以用于本發(fā)明并且也可以被包括在本發(fā)明的試劑盒中的裝備和增補(bǔ)品如表II和III所列。表II以下確定了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得脂肪來源的再生細(xì)胞的物品表II
權(quán)利要求
1.包含濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群的組合物在制備用于在傷口部位促進(jìn)上皮形成的藥物中的應(yīng)用，其中，在被配置為維持密閉、無菌的流體/組織路徑中分離所述濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述藥物的制備無需培養(yǎng)所述濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述脂肪來源的再生細(xì)胞群包含脂肪來源的干細(xì)胞。
4.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述脂肪來源的再生細(xì)胞群包含祖細(xì)胞。
5.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述藥物還包括添加劑。
6.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述藥物在傷口部位促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。
7.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述藥物被配制用于一團(tuán)導(dǎo)入。
8.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，制備所述藥物用于皮下、真皮、肌肉內(nèi)或血管內(nèi)給藥。
9.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，由得自被給予藥物的相同受試者的濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群制備所述藥物。
10.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述藥物提供每毫升IXlO5 1XIO7個(gè)脂肪來源的再生細(xì)胞的最小濃度。
11.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述傷口選自由下列所組成的組 手術(shù)后的皮膚傷口、機(jī)械性外傷引起的皮膚擦傷、苛性劑引起的皮膚擦傷、燒傷、角膜擦傷、 感染或藥物治療后的粘膜上皮的傷口、糖尿病傷口、移植后的皮膚傷口、缺血性潰瘍傷口、 糖尿病傷口和外傷性傷口。
12.根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中，所述藥物促進(jìn)新皮形成。
13.包含濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群的組合物在制備用于加速毛發(fā)再生或修復(fù)毛發(fā)的藥物中的應(yīng)用，其中，在被配置為維持密閉、無菌的流體/組織路徑中分離所述濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群。
全文摘要
本發(fā)明涉及再生細(xì)胞用于促進(jìn)傷口愈合的應(yīng)用。包含濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群的組合物在制備用于在傷口部位促進(jìn)上皮形成的藥物中的應(yīng)用，其中，在被配置為維持密閉、無菌的流體/組織路徑中分離所述濃縮的脂肪來源的再生細(xì)胞群。所述應(yīng)用包括，處理脂肪組織，將從該脂肪組織中得到的一定濃縮數(shù)量的再生細(xì)胞給予病人。該方法可以在一個(gè)封閉系統(tǒng)中實(shí)踐，以便該再生細(xì)胞在被給予病人之前，不會(huì)暴露在外部環(huán)境中。所以，在一個(gè)優(yōu)選方法中，脂肪組織中存在的細(xì)胞，與促進(jìn)、產(chǎn)生或維持治療效果所需的添加劑一起，被直接放入接受者體內(nèi)。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102204928SQ20111011617
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者埃里克·丹尼爾斯, 約翰·K.·弗雷澤, 馬克·H.·赫德里克 申請(qǐng)人:馬克羅珀?duì)柹锿饪乒?br>