專利名稱：從中藥黃精中提取黃精多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于從中草藥中提取多糖藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
多糖具有多種生理功能，因而多糖藥物研究近年來(lái)發(fā)展迅速。目前，從天然產(chǎn)物或發(fā)酵產(chǎn)物中分離制備多糖，國(guó)內(nèi)外多采用物理、化學(xué)方法。一般將原藥粉碎、脫脂后，用水、稀酸或稀堿抽提，抽提液濃縮后，先用三氯乙酸或氯仿-正丁醇法去除雜蛋白，然后透析去除小分子雜質(zhì)，濃縮后凍干或用有機(jī)溶劑沉淀即獲得多糖產(chǎn)物。多糖的精制多采用離子交換和凝膠過(guò)濾方法。上述多糖制備方法存在以下不足①多糖中含有酚型化合物，因而具有較深的黃色、棕色。這些顏色用活性炭無(wú)法脫色，用氧化劑則容易使多糖降解；②提取程序復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)、成本高，向規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化難度大；③精制多糖時(shí)用的離子交換介質(zhì)多為纖維素和葡聚糖凝膠衍生物，本身就多糖，當(dāng)受到微生物或某些化學(xué)因素作用時(shí)，多糖制品容易受到介質(zhì)降解產(chǎn)物的污染。一句話，上述方法，不易獲得高純度的多糖。
建立一種新的以生藥黃精為原料，提取工藝簡(jiǎn)單，可靠，既使收率高，成本低，又能得到高純度的黃精多糖的方法是本發(fā)明的目的。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有提取技術(shù)存在的問(wèn)題，在技術(shù)上，著重解決了以下幾個(gè)問(wèn)題1.在原藥干片加工過(guò)程中，采用蒸煮后的通風(fēng)干燥，避免了制片過(guò)程中酚類物質(zhì)氧化，解決了藥材顏色發(fā)黃問(wèn)題。
2.抽提液不用稀酸、稀堿，而用低級(jí)醇，并在室溫下浸提。此步驟可使蛋白質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)保留在固相中，使抽提物純度大為提高。
3.在多糖精制過(guò)程中，離子交換介質(zhì)采用大孔弱堿陰離子交換樹(shù)脂，凝膠過(guò)濾介質(zhì)選用聚丙烯酰胺凝膠系列，避免了多糖的污染。
具體的方法為，生黃精去須根、洗凈蒸煮一段時(shí)間后，切成2-5mm厚的片，在60°±10℃溫度下通風(fēng)烘干，粉碎過(guò)篩后，細(xì)粉用低級(jí)醇進(jìn)行二次抽提，使用的低級(jí)醇濃度第一次為80％-95％，第二次為40-60％，低級(jí)醇與黃精粉末的浸泡比第一次為3-5∶1；第二次為7-15∶1。經(jīng)第二次抽提過(guò)濾后的濾液加入2-4倍有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀、過(guò)濾、烘干，得黃精多糖粗品。用本發(fā)明所得的黃精多糖粗品用緩沖液和水進(jìn)行三次上柱層析，第一次，用20mMOL/L的Tris-Hcl緩沖液，PH為6.8～7.5，上樣量為0.4-2倍柱床體積，離子交換柱用弱堿陰離子交換樹(shù)脂；第二次溶解和洗滌仍用Tris-Hcl緩沖液，凝膠層析介質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠系列，上樣量為1～2％柱床體積；第三次溶劑和洗滌劑為蒸餾水，凝膠層析介質(zhì)仍為聚丙烯酰胺凝膠系列，上樣量為1-2％柱床體積，經(jīng)三次層析后的溶液，經(jīng)收集、濃縮、凍干即得黃精多糖精制品。上述方法中，所述的低級(jí)醇類為甲醇、乙醇、丙醇；所述的可與水互溶的有機(jī)溶劑為丙酮，二甲亞砜，二甲基甲酰胺及低級(jí)醇類。
用本發(fā)明的方法獲得的黃精多糖粗品為白色粉末狀，含糖量為95％左右，精制品為白色疏松狀固體，含糖量為100％。黃精多糖精制品的比旋度為負(fù)值，紅外顯示果糖特征吸收峰，水解產(chǎn)物簿層分析為含果糖和少量葡萄糖。精制品HPLC分析和凝膠電泳顯示為單一組份，分子量為4000左右。
藥理試驗(yàn)表明黃精多糖具有體外抗單皰病毒(HSV)I型和II型的作用。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明，0.2％的黃精多糖滴眼液治療家兔眼實(shí)驗(yàn)性單皰病毒角膜炎，效果優(yōu)于對(duì)照藥物0.1％無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷眼液，臨床治療單皰病毒性角膜炎104例112眼，結(jié)果表明0.2％黃精多糖滴眼液治療效果優(yōu)于0.1％無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷眼液。對(duì)其急毒、長(zhǎng)毒及一般藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明所制備的黃精多糖制品是安全，有效的。
實(shí)施例1黃精多糖粗品的制備75kg黃精生藥，經(jīng)洗凈、蒸、切片、烘干、粉碎后得12.9kg粉料，此步收率為17.2％。
取粉料200g加入1200ml 85％乙醇，回流后200目尼龍布過(guò)濾。固形物中加45％乙醇，浸提、過(guò)濾得1.6L，清液中加3.2L乙醇后有大量白色沉淀產(chǎn)生，減壓抽濾后，60℃通風(fēng)干燥磨碎得白色粉狀固體30.58g。從粉料到得粗黃精多糖，收率為15.3％，化學(xué)成份分析，含糖為94.8％，蛋白0.45％，水份5.42％。
實(shí)施例2黃精多糖的精制將40g粗多糖溶于PH7.2，20mMOL/LTris-HCL緩沖液500ml中作為上柱樣品。離子交換柱規(guī)格為2.6×30cm，介質(zhì)為CGB685樹(shù)脂，預(yù)先用Tris緩沖劑平衡，柱體積為80ml。每次上樣品40ml左右，UV206nm監(jiān)測(cè)，Tris緩沖劑洗脫，收集洗脫第一峰，合并多次收集組份減壓濃縮至8.4％，作為凝膠層析樣品，凝膠層析柱為2.6×160cm，介質(zhì)為Bio-Gel P6.柱體積800ml(先用Tris緩沖劑平衡)，每次上樣12-15ml(Tris緩沖液洗脫)收集主要糖峰，合并多次收集組份，減壓濃縮至8％濃度，作第二次凝膠層析樣品。同上P6層析柱預(yù)先用蒸餾水平衡，每次上樣10ml左右(蒸餾水洗脫)，收集糖峰。合并多次收集液減壓濃縮至10％濃度，冷凍干燥成白色疏松狀固體9.0g。從粗黃精多糖到精黃精多糖收率為22.5％。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)精制多糖280nm無(wú)吸收，即不含蛋白。用酚-硫酸法測(cè)定其含糖量為100％。
權(quán)利要求
一、從中藥黃精中提取黃精多糖的方法，其特征是先用通風(fēng)干燥將生黃精制成黃精粉，再將黃精粉以低級(jí)醇為溶劑進(jìn)行二次抽提，濾液濃縮、有機(jī)溶劑沉淀，干燥，得粗黃精多糖。將粗黃精多糖溶于20mMOL/L Tris-Hcl緩沖液上柱層析二次，再用蒸餾水進(jìn)行第三次上柱層析、濃縮、冷凍干燥得黃精多糖精制品。
二、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從黃精中提取黃精多糖的方法，其特征是在提取黃精多糖粗品過(guò)程中，所使用的低級(jí)醇的濃度第一次為80-95％，第二次為40-60％，在第一次抽提時(shí)，低級(jí)醇與黃精粉的浸泡比為3～5∶1；第二次抽提時(shí)，低級(jí)醇與黃精粉固形物的體積比為7-15∶1；有機(jī)溶劑與樣品液的體積比為2-4∶1。
三、根據(jù)權(quán)利要求2所述的從黃精中提取黃精多糖的方法，其特征是所述的低級(jí)醇為甲醇、乙醇、丙醇，所述的可與水互溶的有機(jī)溶劑為丙酮，二甲亞砜、二甲基酰胺及低級(jí)醇類。
四、根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的從黃精中提取黃精多糖的方法，其特征是精制黃精多糖的過(guò)程中，第一次抽提上柱的過(guò)濾介質(zhì)為弱堿陰離子交換樹(shù)脂，上樣量為0.4～2倍柱床體積，第二次、第三次抽提上柱的過(guò)濾介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠系列，上樣量均為1-2％柱床體積。
全文摘要
本發(fā)明是從中藥黃精中提取黃精多糖的方法,該產(chǎn)品不含蛋白質(zhì),含糖量達(dá)100%,比旋光度為負(fù)值,水解產(chǎn)物主要為果糖,少量為葡萄糖,HPLC和凝膠電泳顯示單一組分,分子量為4000左右。藥理試驗(yàn)證明,黃精多糖制品對(duì)單皰病毒(HSV)Ⅰ型Ⅱ型有較高的活性,急毒、長(zhǎng)毒及一般藥理都安全有效。臨床試驗(yàn)0.2%的黃精滴眼液治療角膜炎比0.1%的無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷眼效果好。
文檔編號(hào)A61P27/02GK1178799SQ9611773
公開(kāi)日1998年4月15日 申請(qǐng)日期1996年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月8日
發(fā)明者蒙義文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所