專利名稱：多價(jià)細(xì)菌莢膜多糖－蛋白質(zhì)結(jié)合物聯(lián)合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多價(jià)細(xì)菌莢膜多糖與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合物的聯(lián)合疫苗制劑，特別是一種含A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物的聯(lián)合疫苗。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎是一種具有悠久歷史的人類傳染性疾病，流行地域極廣，遍及全球各大洲，至今仍未得到有效的控制。該病的病原體——腦膜炎奈瑟氏球菌只感染人類，人與人之間通過飛沫或分泌物直接傳染，通常情況下，這種接觸使對方成為一個(gè)健康帶菌者，根據(jù)年齡和環(huán)境的不同，10-50％的人可成為帶菌者。在人體抵抗力下降及特定環(huán)境影響下，腦膜炎奈瑟氏菌可以侵入血流，繼而發(fā)病，通常發(fā)生在接觸該菌后的一周內(nèi)。該病來勢非常兇猛，伴有嚴(yán)重腦膜感染的綜合癥狀；嚴(yán)重的全身癥狀主要有敗血癥、休克、出血、紫癜、彌散性血管內(nèi)凝血或內(nèi)臟出血，病死率較高，盡管抗生素有較好的治療效果，病死率仍維持在5～10％之間。
腦膜炎奈瑟氏菌是引起流行性腦脊髓膜炎(以下簡稱腦膜炎球菌)的病原菌，根據(jù)其莢膜多糖的特異性可將腦膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z13個(gè)血清群，所有血清群的細(xì)菌均可致病，但A、B、C、Y和W135毒力最強(qiáng)，上述5個(gè)血清群占病例數(shù)的95％以上，其中A群、C群傳染性最強(qiáng)，是引起腦膜炎流行最常見的菌株。
A群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖疫苗是第一個(gè)用于預(yù)防A群流行性腦脊髓膜炎球菌感染的疫苗，應(yīng)用以后使A群流行性腦脊髓膜炎的發(fā)病率及病死率得以大幅度的降低。
A群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗研制成功之后，相繼研制出了A/C群腦膜炎球菌莢膜多糖雙價(jià)疫苗以及含A、C、Y、W135群四價(jià)腦膜炎球菌莢膜多糖成分的聯(lián)合疫苗。由于各國均以A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌流行為主，因此，目前各國使用的疫苗主要為A群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗、或A/C群腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗等。
b型嗜血流感桿菌(Hib)是引起兒童細(xì)菌性腦炎、肺炎、蜂窩組織炎等疾病的主要病原體。在使用有效的疫苗前，美國每年有1.6～2.5萬多名兒童因Hib引起感染；其中60％的兒童患上最嚴(yán)重的Hib感染并發(fā)癥——細(xì)菌性腦炎。其中10％因腦炎致死，許多幸存者則造成嚴(yán)重的永久性功能喪失。其他感染包括菌血癥、肺炎、膿胸、心包炎、蜂窩組織炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎及會(huì)咽炎等。1988～1991年期間，最初獲準(zhǔn)對大嬰幼兒進(jìn)行Hib結(jié)合疫苗接種，以后又獲準(zhǔn)對小嬰幼兒進(jìn)行接種，使Hib侵襲性疾病及相關(guān)的發(fā)病率及死亡率明顯減少。過去幾年里，Hib疾病患病人數(shù)降低了95％，美國疾病控制及預(yù)防中心將5歲以下兒童的Hib疾病作為一種可采用疫苗加以控制的疾病，并計(jì)劃1996年消除；到1997年7月，該目標(biāo)已接近實(shí)現(xiàn)但尚未完全達(dá)到。值得說明的是，在對18個(gè)月齡以下兒童廣泛使用疫苗前，Hib疾病發(fā)病率已開始下降。其可能是由于接種Hib結(jié)合疫苗降低了較大兒童的無癥狀攜帶率，而導(dǎo)致了18個(gè)月齡以下兒童的感染風(fēng)險(xiǎn)降低。這種“群體免疫”作用所達(dá)到的效果是使用疫苗前未預(yù)料到的，Hib結(jié)合疫苗的成功免疫，為研究及預(yù)防由其他含多糖莢膜的細(xì)菌引起的感染提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。
作為結(jié)合疫苗的載體，必須選擇安全有效的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)必須對人體沒有毒性，也不會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)又能增強(qiáng)多糖的免疫原性，因此可供選擇的種類并不多。目前使用的載體主要為微生物來源的蛋白質(zhì)，例如現(xiàn)成的白喉和破傷風(fēng)類毒素，經(jīng)基因突變發(fā)生減毒的白喉毒素(CRM-197)以及細(xì)菌的外膜蛋白質(zhì)等，而且已經(jīng)用于臨床。蛋白質(zhì)載體也可以源于與多糖同一菌種的致病菌，例如b型嗜血流感桿菌莢膜多糖偶聯(lián)疫苗可以用該菌的外膜蛋白質(zhì)作為載體；肺炎球菌莢膜多糖偶聯(lián)疫苗可以用肺炎球菌的溶血素蛋白質(zhì)作為載體，其優(yōu)點(diǎn)是能具有對不同型別的肺炎球菌感染有交叉免疫保護(hù)效果。還有一些細(xì)菌的毒素蛋白質(zhì)也可作為載體，例如霍亂毒素、霍亂毒素的B亞單位和大腸桿菌的不耐熱腸毒素，因?yàn)樗鼈兺瑫r(shí)還具有佐劑的效應(yīng)。另外還有綠膿桿菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白質(zhì)，以及不相關(guān)的蛋白質(zhì)如人血清蛋白等，但是這些蛋白質(zhì)載體仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚未用于臨床。
至今已經(jīng)研制成功多種不同的單價(jià)細(xì)菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗及7價(jià)肺炎球菌莢膜多糖-CRM197白喉類毒素結(jié)合疫苗。結(jié)合疫苗具有以下一些特點(diǎn)(1)能增強(qiáng)嬰幼兒對細(xì)菌莢膜多糖的免疫反應(yīng)，這主要是由于結(jié)合疫苗能激活T輔助性淋巴細(xì)胞和形成T記憶細(xì)胞，重復(fù)接種能產(chǎn)生記憶性免疫增強(qiáng)作用，使主要為IgG的抗細(xì)菌莢膜多糖抗原的抗體水平劇增，對嬰幼兒接種后能產(chǎn)生較為持久的免疫保護(hù)力。(2)細(xì)菌的多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗可成為二價(jià)疫苗。這是因?yàn)榻Y(jié)合疫苗可同時(shí)產(chǎn)生針對多糖和蛋白質(zhì)載體的抗體反應(yīng)。(3)能增強(qiáng)老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人對細(xì)菌莢膜多糖抗原的免疫反應(yīng)。例如肺炎是老年人的常見病，肺炎球菌莢膜多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合疫苗可以增強(qiáng)疫苗對老年人的免疫保護(hù)力。結(jié)合疫苗也可使一些缺乏對細(xì)菌莢膜多糖抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的個(gè)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗多糖抗原的抗體。(4)結(jié)合疫苗具有載體蛋白質(zhì)的效應(yīng)。事先或同時(shí)接種蛋白質(zhì)載體會(huì)刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，因而能增強(qiáng)結(jié)合疫苗的免疫原性。
中國專利ZL 02159032.X公開了一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，主要涉及A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖與多種蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)與純化方法及疫苗的配制方法，該專利所述的多糖-蛋白結(jié)合疫苗的價(jià)數(shù)為3價(jià)多糖，不含Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種含A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物的聯(lián)合疫苗制劑。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，由上述5種多糖-蛋白結(jié)合物混合制備的，其中5種結(jié)合物混合的重量比例在1∶0.5～2.5之間，優(yōu)選的為1∶1-2之間，更優(yōu)選的為1∶1，其中，重量比例是按多糖計(jì)算的，每一單位給藥劑量的制劑中含有A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的量在5-25μg之間，所述每一單位給藥劑量是指每次用量的制劑量，或每一制劑單位如注射劑1支中內(nèi)容物的量。而本發(fā)明的制劑優(yōu)選的為注射用的制劑，如粉針劑或水針劑?？善は禄蚣∪庾⑸?。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其中的蛋白載體選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白等。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其中多糖與蛋白載體的結(jié)合是以多糖用溴化氰或硼氰酸鈉活化，然后與己二酰肼或其他同功能的化合物反應(yīng)，在碳二亞胺的作用下與蛋白載體共價(jià)結(jié)合。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還可含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為佐劑，加入量為0.10～1.5mg鋁佐劑/每劑。其中每劑指每一單位給藥劑量的制劑。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，制劑中還可含有其他已知的可提高機(jī)體免疫的人細(xì)胞因子如GM-CSF、IL-2、IL-12、或單磷脂A、或胞壁酰二肽或其衍生物等，或與它們結(jié)合使用可提高機(jī)體免疫力。
本發(fā)明也可以用人血清IgG作為載體蛋白制備結(jié)合疫苗，其所含的蛋白載體——IgG的Fc片段可與人體內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，使其主動(dòng)吞噬并處理抗原，增強(qiáng)多糖抗原的免疫原性。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗可以和目前市售的多種含鋁佐劑疫苗如氫氧化鋁/磷酸鋁吸附白喉-百日咳-破傷風(fēng)疫苗、基因重組乙型肝炎疫苗、破傷風(fēng)類毒素疫苗等混合使用。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，可通過以下制備工藝制備多糖原料選用A、C、Y、W135群腦膜炎球菌菌種、b型嗜血流感桿菌菌種經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)出A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，其純化步驟可以為目前通用的常規(guī)步驟，也可以采用本發(fā)明所述的大孔合成樹脂精制細(xì)菌莢膜多糖的方法，該方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成樹脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白質(zhì)及核酸類污染物，再以蛋白變性劑苯酚除去多糖溶液中殘留的不能被大孔樹脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量為目前世界衛(wèi)生組織推薦工藝的1/4至1/10。
載體蛋白原料精制破傷風(fēng)類毒素系用破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌菌種，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制而成；其方法為常規(guī)制備方法。
精制白喉類毒素系用白喉?xiàng)U菌菌種，在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的毒素經(jīng)甲醛脫毒、精制而成。其方法為常規(guī)制備方法。
人血清IgG系市售的靜脈注射用生物制品，可以從市場上買到。
制備方法經(jīng)過活化的多糖原料和載體蛋白原料在碳二亞胺的作用下，通過共價(jià)鍵結(jié)合，形成多糖-蛋白結(jié)合物。具體是A群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、C群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、Y群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、W135群流行性腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖分別與蛋白結(jié)合，制備各自的多糖-蛋白結(jié)合物原液，其方法為常規(guī)制備方法。然后，再按本發(fā)明規(guī)定的比例混合，制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗。根據(jù)需要，可以加入氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑后即成為含鋁佐劑的疫苗。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑，以破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)作為腦膜炎球菌莢膜多糖的載體蛋白免疫兒童，可喚起免疫系統(tǒng)對破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、OMP(先前感染B群腦膜炎球菌)的回憶反應(yīng)，從而得到較好的對腦膜炎球菌莢膜多糖的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的疫苗可用于免疫2月齡以上各年齡段的兒童，預(yù)防兒童罹患A、C、Y、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌、b型嗜血流感桿菌引起的感染性疾病。它的特點(diǎn)是既能增強(qiáng)多糖抗原的免疫原性，又能減少嬰幼兒接種疫苗的次數(shù)，減輕嬰幼兒的痛苦和家長的精神負(fù)擔(dān)。降低免疫接種成本，提高免疫覆蓋率。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例一A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的提取生產(chǎn)多糖疫苗可選用適宜培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的液體培養(yǎng)基不含能與十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養(yǎng)基中不含對人體有害或其它過敏原物質(zhì)。
在適宜的培養(yǎng)基中接種菌種后，于對數(shù)生產(chǎn)期后或靜止期前期收獲。將培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌或加熱殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體多糖為宜。將已殺菌的單一收獲物(或合并收獲物)離心去菌體，收集上清液，用50～100KD截留分子量的超濾膜濃縮已收獲的上清液至原體積的1/8，加入十六烷基三甲基溴化銨混勻，室溫?cái)嚢?0分鐘，1-5℃靜置6～12小時(shí)，15000×g高速離心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，終濃度為1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，過濾除去不溶物，加入乙醇至最終濃度為25-35％(v/v)。1～10℃靜置3小時(shí)以上，離心去除核酸沉淀物，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至最終濃度為70～80％(v/v)，充分振搖。離心收集沉淀，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待進(jìn)行一步提取。
將粗制品溶解于中性醋酸鈉緩沖液中，使其濃度達(dá)10～20mg/ml，然后流經(jīng)用中性乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡的聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯大孔樹脂層析柱，收集流出液，超濾濃縮，按1∶2體積用冷酚提取，離心收集上層水相清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析48～72小時(shí)或用3～100KD超濾膜超濾5次(1∶4～10)除去苯酚，加乙醇至最終濃度為75％～80％(v/v)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上。離心后傾去上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空抽干殘存的有機(jī)溶劑，獲得多糖干粉，保存于-20℃以下。
用注射用水溶解多糖，所得溶液即為提取的多糖原液。原液經(jīng)除菌過濾后，取樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)及各項(xiàng)生化測定。除菌后的液體多糖應(yīng)保存在-20℃或以下，待下一步與蛋白偶聯(lián)。
采用本方法精制的莢膜多糖為白色粉末狀物質(zhì)，不含色素及脂類雜質(zhì)，各項(xiàng)鑒定指標(biāo)均符合現(xiàn)行世界衛(wèi)生組織《腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗制造及檢定規(guī)程》(No.23，1986)的要求，精制過程中苯酚的用量僅為世界衛(wèi)生組織推薦方法的1/4～1/10，極大地減輕了對環(huán)境的污染。
實(shí)施例二莢膜多糖的裂解及純化將5克A群(或C、Y、W135群)奈瑟氏腦膜炎球菌莢膜多糖(或b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，Hib)溶于10升1/10飽和度的乙酸鈉緩沖液中(pH5.5～6.0，用乙酸調(diào)節(jié)酸堿度，室溫)，室溫下攪拌，充分溶解8～12小時(shí)，至溶液澄清透明，補(bǔ)加60℃預(yù)熱的50mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.5～6.0)38.33升，不銹鋼反應(yīng)罐夾套內(nèi)循環(huán)水加熱，維持罐內(nèi)多糖溶液溫度在55-56℃，攪拌0.5小時(shí)，向罐內(nèi)加入30％的過氧化氫1670ml，裂解多糖，裂解過程中維持?jǐn)嚢杷俣?00轉(zhuǎn)/分鐘。
多糖裂解過程通過跟蹤多糖分子量的變化來監(jiān)控，分子量的測定用島津20AT HPLC TSK3000W液相色譜測定，每20分鐘取樣1次，檢測反應(yīng)罐內(nèi)多糖分子量的大小。當(dāng)多糖的分子大小主要分布在3～100KDa之間時(shí)，關(guān)閉自動(dòng)加熱裝置，放掉反應(yīng)罐夾套內(nèi)的循環(huán)水，向夾套內(nèi)通入-10℃乙二醇/水冷卻液，至罐內(nèi)液體溫度達(dá)到4℃后，將乙二醇/水冷卻液的溫度調(diào)整為2℃，由溫度自控系統(tǒng)依據(jù)罐內(nèi)液體的溫度控制夾套內(nèi)冷媒循環(huán)系統(tǒng)的開閉。
將反應(yīng)罐與裝有3KDa聚醚砜超濾膜的超濾系統(tǒng)連接，啟動(dòng)超濾系統(tǒng)，濃縮至罐內(nèi)液體量為5升。加入20升0.15mol/L無菌氯化鈉溶液(4℃)，啟動(dòng)超濾系統(tǒng)，繼續(xù)超濾至罐內(nèi)液體為5升，重復(fù)此過程5次。在整個(gè)超濾過程中，始終控制罐內(nèi)液體溫度在2～4℃。超濾結(jié)束后，將超濾后的多糖溶液放置在2～4℃，備用。
實(shí)施例三多糖與破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)及純化1.活化多糖取A群(或C群、Y群、W135群)腦膜炎球菌莢膜多糖(或Hib)多糖400mg(4mg/ml，100ml)，用0.5M NaOH調(diào)pH至10.8，加200mg溴化氰，用0.5MNaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(shí)(22℃)。然后用0.5M HCl調(diào)pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應(yīng)6分鐘；用0.5M NaOH調(diào)pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內(nèi)15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時(shí)。用預(yù)冷0.05MNaCl溶液透析48小時(shí)(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的聚醚砜超濾膜超濾)。用0.45μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與破傷風(fēng)類毒素(TT)偶聯(lián)(4～8℃冰水浴下操作)將破傷風(fēng)類毒素溶液的蛋白濃度調(diào)整為4mg/ml，分別取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調(diào)pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內(nèi)90分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至6.8，用預(yù)冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(shí)(4～8℃，或用截流分子量為100KD的聚醚砜濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質(zhì)。
3.多糖-蛋白結(jié)合物純化及檢定(4～8℃條件)將多糖-TT結(jié)合物溶液超濾濃縮為40ml，經(jīng)Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(3.5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為2.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集含多糖-蛋白偶聯(lián)物的洗脫峰，經(jīng)0.22μm無菌無熱原濾膜過濾后即為多糖-蛋白結(jié)合疫苗原液。
A群腦膜炎球菌莢膜多糖含量的測定按Bartlet，GR.J.，Journal of BiologicalChemistry 1959234，466-468頁刊載的方法，唾液酸含量的測定按Svennerholm，L.，Biochemica Biophysica Acta.195524，604-611頁刊載的方法；O-乙?；康臏y定采用Hesterin，S.Journal of Biological Chemistry，1949，180249頁刊載的方法。蛋白含量的測定采用Lowry，O.H.，et al.，Journal ofBiological Chemistry，1951，193265-275頁刊載的方法，內(nèi)毒素含量測定采用《中華人民共和國藥典》第三部附錄XIIE方法。
采用上述多糖、TT反應(yīng)比例制備的A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合物及Hib多糖-TT結(jié)合物中多糖與TT的重量比為0.2∶1～0.8∶1；C群腦膜炎球菌莢膜多糖與TT的重量比為0.6∶1～1.5∶1。Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖與TT的重量比為0.3∶1～1.0∶1；游離多糖含量小于20％。LAL(內(nèi)毒素)含量不超過5EU/μg多糖。
實(shí)施例四、氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內(nèi)，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖-TT結(jié)合疫苗。
實(shí)施例五磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、W群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內(nèi)，充分混合后，加入磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖-TT結(jié)合疫苗。
實(shí)施例六A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、W群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一無菌容器內(nèi)，加入氯化鈉溶液，充分混合后，4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～20μg的結(jié)合疫苗。
實(shí)施例七A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗動(dòng)物免疫試驗(yàn)按上述實(shí)施例三、四、五方法制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-TT、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯(lián)免疫法(ELISA用酶標(biāo)板以各群或型莢膜多糖-HAS結(jié)合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結(jié)果見表1。結(jié)合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。結(jié)合疫苗免后產(chǎn)生的抗體效價(jià)顯著高于多糖疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)。多糖疫苗1、2次免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)無顯著性差異。
實(shí)施例八A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗(一)B群腦膜炎球菌外膜蛋白的提取B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)的提取方法按照孫銀燕、胡緒敬報(bào)道的方法[見中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1998，18(6)423-427]，蛋白含量的測定采用Lowry法。
(二)多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白的偶聯(lián)1.活化多糖取按實(shí)施例二制備的A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LNaOH調(diào)pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(shí)(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應(yīng)6分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內(nèi)15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時(shí)。用預(yù)冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(shí)(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯(lián)(4～8℃冰水浴下操作)將B群腦膜炎球菌外膜蛋白溶液的蛋白濃度調(diào)整為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調(diào)pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內(nèi)90分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至6.8，用預(yù)冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(shí)(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質(zhì)。
(三)多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物純化(4～8℃條件)將多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物溶液超濾濃縮為40ml，經(jīng)SephacrylS-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSKToyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經(jīng)0.2μm濾膜過濾后即為多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗原液。
(四)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內(nèi)，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-結(jié)合疫苗。
(五)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
(六)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入等體積的磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
實(shí)施例九A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合疫苗動(dòng)物免疫試驗(yàn)按實(shí)施例八制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，每毫升含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)10只，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫時(shí)設(shè)生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯(lián)免疫法(ELISA用酶標(biāo)板以各群或型莢膜多糖-HAS結(jié)合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結(jié)果見表2。結(jié)合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。
實(shí)施例十A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗(動(dòng)物試驗(yàn)用)(一)多糖與鼠IgG的偶聯(lián)1.活化多糖取A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/L NaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(shí)(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應(yīng)6分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內(nèi)15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時(shí)。用預(yù)冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(shí)(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與鼠IgG偶聯(lián)(4～8℃冰水浴下操作)將鼠IgG的蛋白濃度調(diào)整為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調(diào)pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內(nèi)90分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至6.8，用預(yù)冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(shí)(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質(zhì)。
(二)多糖-蛋白結(jié)合物純化(4～8℃條件)將多糖-蛋白結(jié)合物溶液超濾濃縮為40ml，經(jīng)Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經(jīng)0.2μm濾膜過濾后即為多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內(nèi)，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗。
(四)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖鼠IgG結(jié)合物原液-分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
(五)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入等體積的磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
實(shí)施例十一A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗動(dòng)物試驗(yàn)(一)多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗動(dòng)物免疫試驗(yàn)按實(shí)施例十制備的A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各20μg。加三倍體積的鋁稀釋劑或生理鹽水稀釋后，即為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用疫苗，分別于0、14天免疫SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)10只，免疫劑量為0.5ml(含每種多糖2.5μg)。分別于0、14、28天采集血液，分離血清，測定抗體滴度前將血清放置于-20℃。免疫動(dòng)物的同時(shí)設(shè)生理鹽水對照組及同劑量多糖疫苗對照組，以酶聯(lián)免疫法(ELISA用酶標(biāo)板以各群或型莢膜多糖-HAS結(jié)合物包被)測定血清IgG抗體滴度。結(jié)果見表3。結(jié)合疫苗第1次免后2周小鼠血清抗體滴度顯著高于免前(p＜0.01)；第2次免后2周的抗體滴度顯著高于第1次免后2周的抗體滴度(p＜0.05)。
(二)多糖-鼠IgG結(jié)合物急性毒性試驗(yàn)多糖-鼠IgG結(jié)合物類似于小鼠感染后恢復(fù)期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復(fù)合物，抗原-抗體復(fù)合物有可能對機(jī)體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗(yàn)以相當(dāng)于人擬用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結(jié)合物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其安全性。由于C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖的主要成分均為唾液酸，本試驗(yàn)僅以含唾液酸量最高的C群腦膜炎球菌莢膜多糖進(jìn)行試驗(yàn)。
1、A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物急性毒性試驗(yàn)A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物類似于小鼠感染A群腦膜炎球菌恢復(fù)期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復(fù)合物，抗原-抗體復(fù)合物有可能對機(jī)體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗(yàn)以相當(dāng)于人用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結(jié)合物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其安全性。
試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克。
試驗(yàn)分組試驗(yàn)組1，A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組2，氫氧化鋁吸附A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組3，A群腦膜炎球菌莢膜多糖；對照組，生理鹽水。
試驗(yàn)方法分別于0、14天肌肉注射A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計(jì)算，試驗(yàn)組1)、氫氧化鋁吸附A群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組2)、A群腦膜炎球菌莢膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數(shù)小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學(xué)情況。
試驗(yàn)結(jié)果各組試驗(yàn)動(dòng)物在兩次給藥后均未見異常，試驗(yàn)期間未發(fā)生死亡，各試驗(yàn)組動(dòng)物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動(dòng)物剖檢時(shí)，各組試驗(yàn)動(dòng)物主要臟器未見異常，各給藥組動(dòng)物臟器重量和臟器系數(shù)與對照組沒有顯著性差異。肝、脾、腎顯微切片鏡檢無異常改變。證明該試驗(yàn)劑量的多糖-鼠IgG結(jié)合物對小鼠是安全的。
2、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物急性毒性試驗(yàn)C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物類似于小鼠感染C群腦膜炎球菌恢復(fù)期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復(fù)合物，抗原-抗體復(fù)合物有可能對機(jī)體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗(yàn)以相當(dāng)于人擬用劑量500～1000倍的多糖-鼠IgG結(jié)合物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其安全性。
試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克，隨機(jī)分組。
試驗(yàn)分組試驗(yàn)組1，C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組2，氫氧化鋁吸附C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組3，C群腦膜炎球菌莢膜多糖；對照組，生理鹽水。
試驗(yàn)方法分別于0、14天肌肉注射C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計(jì)算，試驗(yàn)組1)、氫氧化鋁吸附C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組2)、C群腦膜炎球菌莢膜多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數(shù)小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學(xué)情況。
試驗(yàn)結(jié)果各組試驗(yàn)動(dòng)物在兩次給藥后均未見異常，試驗(yàn)期間未發(fā)生死亡，各試驗(yàn)組動(dòng)物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動(dòng)物剖檢時(shí)，各組試驗(yàn)動(dòng)物主要臟器未見異常，各給藥組動(dòng)物臟器重量和臟器系數(shù)與對照組沒有顯著性差異。第2次給藥后7、28天處死的動(dòng)物C群腦膜炎球菌莢膜多糖試驗(yàn)組肝、腎顯微切片鏡檢異常，出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、變性，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小球未見異常；其他試驗(yàn)組顯微鏡下無異常。證明該試驗(yàn)劑量的C群腦膜炎球菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合物對小鼠是安全的。
3、Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物急性毒性試驗(yàn)Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物類似于小鼠感染Hib恢復(fù)期形成的多糖-鼠IgG抗原-抗體復(fù)合物，抗原-抗體復(fù)合物有可能對機(jī)體的肝臟、脾臟、腎臟等造成一定程度的免疫損傷，本試驗(yàn)以相當(dāng)于人擬用劑量500～1000倍的和Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其安全性。
試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級BALB/C小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，每組20只，雌雄各半，體重18-22克，隨機(jī)分組。
試驗(yàn)分組試驗(yàn)組1，Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組2，氫氧化鋁吸附Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物；試驗(yàn)組3，Hib多糖；對照組，生理鹽水。
試驗(yàn)方法分別于0、14天肌肉注射Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(按多糖計(jì)算，試驗(yàn)組1)、氫氧化鋁吸附Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組2)、Hib多糖2.5mg/kg/0.2ml(試驗(yàn)組3)，對照組同期注射生理鹽水0.2ml/只。第2次給藥后7天、28天每組各處死半數(shù)小鼠，摘取肝、脾、腎，秤重，觀察病變，將臟器用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡檢觀察病理學(xué)情況。
試驗(yàn)結(jié)果各組試驗(yàn)動(dòng)物在兩次給藥后均未見異常，試驗(yàn)期間未發(fā)生死亡，各試驗(yàn)組動(dòng)物體重與對照組相比無顯著性差異。處死動(dòng)物剖檢時(shí)，各組試驗(yàn)動(dòng)物主要臟器未見異常，各給藥組動(dòng)物臟器重量和臟器系數(shù)與對照組沒有顯著性差異。第2次給藥后7、28天處死的動(dòng)物Hib多糖試驗(yàn)組肝、腎顯微切片鏡檢異常，出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、變性，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小球未見異常；其他試驗(yàn)組顯微鏡下無異常。證明該試驗(yàn)劑量的Hib多糖-鼠IgG結(jié)合物對小鼠是安全的。
實(shí)施例十二A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合疫苗(一)多糖-人IgG的偶聯(lián)1.活化多糖取A群(或C、Y、W135)腦膜炎球菌(或Hib)多糖400mg(4mg/ml)，用0.5mol/LM NaOH調(diào)pH至10.8，加入200mg溴化氰，用0.5mol/LNaOH維持pH在10.8±0.5左右1小時(shí)(22℃)。然后用0.5mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加入1450mg己二酰肼(ADH)，反應(yīng)6分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，維持pH在8.5±0.5的范圍內(nèi)15分鐘；4～8℃輕輕攪拌12小時(shí)。用預(yù)冷0.05mol/L NaCl溶液透析48小時(shí)(4～8℃)，在此期間換液5次(或用3KD的超濾膜超濾)。用0.2μm濾膜過濾活化多糖-AH衍生物。
2.活化多糖與人IgG偶聯(lián)(4～8℃冰水浴下操作)將人IgG(靜脈注射用人血清免疫球蛋白，武漢生物制品研究所)的蛋白濃度稀釋為4mg/ml，取100ml加入到已活化的多糖-AH衍生物溶液中，充分混勻后，用0.5mol/L HCl調(diào)pH至5.7。加碳二亞胺(EDAC)4000mg，滴加鹽酸維持溶液的pH在5.7±0.2范圍內(nèi)90分鐘；用0.5mol/L NaOH調(diào)pH至6.8，用預(yù)冷0.2mol/L NaCl溶液透析12小時(shí)(4～8℃，或用截流分子量為100KD的濾膜超濾)，除去碳二亞胺(EDAC)及低分子物質(zhì)。
(二)多糖-人IgG結(jié)合物純化(4～8℃條件)將多糖-人IgG結(jié)合物溶液超濾濃縮為40ml，經(jīng)Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4FF、TSK Toyopearl-65等)層析柱(柱長5×100cm)純化，以0.2mol/L NaCl流洗，流速為1.5ml/分鐘，以206nm/280nm波長的在線式紫外檢測器檢測流出液的吸光值變化，收集V0附近的洗脫峰，經(jīng)0.2μm濾膜過濾后即為多糖-人IgG結(jié)合疫苗原液。
(三)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液分別稀釋至250μg/ml(按多糖計(jì)算)，將以上5種稀釋后的疫苗液各取等量放于一容器內(nèi)，充分混合后，加入不同量的生理鹽水，即可制成含各型多糖10～50μg/ml的疫苗，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～25μg的多糖-結(jié)合疫苗。
(四)氫氧化鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液-分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入氫氧化鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的氫氧化鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
(五)磷酸鋁佐劑吸附A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合疫苗的制備將A群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、C群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-人IgG結(jié)合物原液分別稀釋至200μg/ml(按多糖計(jì)算)，取相同體積的以上5種稀釋后的疫苗液放于一滅菌后的容器內(nèi)，充分混合后，加入磷酸鋁佐劑，充分混勻后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分裝，即為每劑含A群、C群、Y群、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖各5～10μg的磷酸鋁吸附多糖結(jié)合疫苗。
表1、A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-TT結(jié)合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗(yàn)動(dòng)物10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續(xù)2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。
表2、A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-B群腦膜炎球菌外膜蛋白聯(lián)合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗(yàn)動(dòng)物均為SPF BALB/C小鼠10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續(xù)2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。
表3A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖-鼠IgG結(jié)合疫苗免疫BALB/C小鼠的血清抗體滴度*

*每組試驗(yàn)動(dòng)物10只，血清的起始稀釋度為1∶100，連續(xù)2倍稀釋，最高稀釋度為1∶102400。
免前血清、生理鹽水對照組血清的稀釋方法同其他試驗(yàn)組，1∶100陰性的，血清抗體滴度按1計(jì)算。
權(quán)利要求
1.一種多價(jià)細(xì)菌多糖-蛋白質(zhì)結(jié)合物聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，含有有效量的A群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，C群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，Y群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，W135群流行性腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，它們之間的重量比例在1∶0.5～2.5之間。
2.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，重量比例是按多糖計(jì)算的，每一單位給藥劑量的制劑中含有A群，C群，Y群和W135群腦膜炎球菌莢膜多糖以及b型嗜血流感桿菌莢膜多糖的量在5-25μg之間。
3.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，其中的蛋白載體選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、人血清免疫球蛋白或B群流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其中的多糖選自未經(jīng)降解的莢膜多糖或經(jīng)化學(xué)方法裂解的分子量在3-100KDa之間的多糖。
5.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，莢膜多糖-蛋白結(jié)合物的多糖和蛋白是通過共價(jià)鍵結(jié)合的，其中多糖與蛋白的加入量是等量或有0.5～5倍量的差別。
6.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還含有氫氧化鋁或磷酸鋁作為鋁佐劑，加入量為0.1～1.5mg鋁佐劑/劑。
7.權(quán)力要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，還含有可提高人體免疫反應(yīng)的人細(xì)胞因子、單磷脂A或胞壁酰二肽或其衍生物。
8.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑，其特征在于，是注射劑，用于皮下或肌肉注射。
9.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑在制備用于預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染的疫苗中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑的制備方法，其特征在于，包括多糖原料的制備，載體蛋白原料的制備，多糖-蛋白結(jié)合物的制備，多糖-蛋白結(jié)合物按比例混合的步驟其中多糖原料的制備是用A、C、Y、W135群腦膜炎球菌菌種、b型嗜血流感桿菌菌種經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)出A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖，這些多糖的純化方法采用大孔合成樹脂精制細(xì)菌莢膜多糖的方法，該方法是，用聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸酯大孔合成樹脂吸附粗制多糖溶液中的色素、蛋白質(zhì)及核酸類污染物，再以蛋白變性劑苯酚除去多糖溶液中殘留的不能被大孔樹脂吸附的微量蛋白，其中苯酚的用量為目前世界衛(wèi)生組織推薦工藝的1/4至1/10。
11.權(quán)利要求1的聯(lián)合疫苗制劑可以不含b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合物，用于預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多價(jià)細(xì)菌莢膜多糖－蛋白質(zhì)結(jié)合物聯(lián)合疫苗制劑，特別是一種含A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎球菌莢膜多糖－蛋白質(zhì)結(jié)合物和b型嗜血流感桿菌莢膜多糖－蛋白質(zhì)結(jié)合物的聯(lián)合疫苗。
文檔編號A61K39/02GK1709505SQ20051008304
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者孔健, 蔣先敏, 肖麗君 申請人:北京綠竹生物制藥有限公司