專利名稱：一種trail重組卡介苗的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分泌腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的卡介苗穿梭表達(dá)載體 pMW61-Ag85B-TRAIL及其構(gòu)建方法，即一種TRAIL重組卡介苗的構(gòu)建及應(yīng)用，具體涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽片段和TRAIL基因片段的穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，得到的穿梭表達(dá)載體pMW6l-Ag85B-TRAIL用于構(gòu)建重組卡介苗rBCGTRAIL， rBCGTRAIL可應(yīng)用于治療淺表性膀胱腫瘤和預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)以及預(yù)防結(jié)核病發(fā)生。
背景技術(shù)：
卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)膀胱灌注已被公認(rèn)為是治療淺表性膀胱腫瘤及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)最有效的治療方法，其在減少腫瘤復(fù)發(fā)數(shù)目、降低復(fù)發(fā)頻率以及預(yù)防低分化膀胱腫瘤進(jìn)展三個(gè)方面，均優(yōu)于傳統(tǒng)的化療藥物。但隨著B(niǎo)CG在臨床的廣泛應(yīng)用，也出現(xiàn)了膀胱腫瘤患者對(duì)BCG灌注的免疫反應(yīng)性差及BCG副作用大等問(wèn)題。所以，改造BCG、 開(kāi)發(fā)新疫苗成為膀胱腫瘤免疫治療中的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外日益重視BCG作為新型活疫苗載體的作用，并利用基因工程技術(shù)改造BCG，以加強(qiáng)其免疫原性。基因重組卡介苗(rBCG)是將BCG作為工程菌，利用DNA重組技術(shù)將外源基因?qū)CG中，依靠BCG在宿主的復(fù)制，分泌表達(dá)外源抗原，以誘導(dǎo)對(duì)疾病的特異性體液和細(xì)胞免疫，提高BCG激發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。用于治療膀胱癌的rBCG可以分為兩種，一種是表達(dá)結(jié)核桿菌的抗原Ag85B的 rBCG,可以降低活BCG劑量，提高其免疫效果，降低副作用；由于一些細(xì)胞因子(IFN- γ、 mIL-2、mIL-18等)可以提高機(jī)體的細(xì)胞免疫，對(duì)腫瘤細(xì)胞可以進(jìn)行殺傷作用，但半衰期短、臨床用量大，費(fèi)用昂貴且副作用大，因此可利用BCG持久存在的特性，構(gòu)建可分泌細(xì)胞因子的rBCG;構(gòu)建rBCG除了選擇有效的外源基因外，選擇適當(dāng)?shù)拇┧筝d體也非常重要，構(gòu)建rBCG除了選擇有效的外源基因外，選擇適當(dāng)?shù)拇┧筝d體也非常重要，如何將外源基因?qū)隑CG并分泌表達(dá)是rBCG的關(guān)鍵所在，1987年Jacobs等首先構(gòu)建穿梭載體(shuttle vector)并將外源基因成功導(dǎo)入BCG菌體內(nèi)，方法是將分枝桿菌噬菌體DNA和大腸桿菌質(zhì)粒 DNA連接獲得重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到恥皮垢分枝桿菌(非致病性的快生長(zhǎng)類分枝桿菌)中， 獲得重組噬菌體。用重組噬菌體直接感染BCG從而將外源基因?qū)霕?gòu)建rBCG。這種穿梭載體既可作為質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，又可作為噬菌體在分枝桿菌中復(fù)制。但存在分子量大、 缺乏有用的單一酶切位點(diǎn)和抗性標(biāo)志及在BCG中表達(dá)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。1991年Mover構(gòu)建大腸桿菌一分枝桿菌的穿梭質(zhì)粒PMM61，添加了 aph基因(即karf抗性標(biāo)記)、多克隆位點(diǎn)、分枝桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子hsp60和轉(zhuǎn)錄終止子，pMV261在大腸桿菌和結(jié)核桿菌中均有正常表達(dá)，并且可隨大腸桿菌的擴(kuò)增而迅速擴(kuò)增，所以很容易獲得所需質(zhì)粒。具有拷貝數(shù)高、高效表達(dá)重組蛋白以及對(duì)BCG基因組的非破壞性等優(yōu)點(diǎn)。pMV261的構(gòu)建成功為外源基因在BCG 中表達(dá)提供了理想的載體。細(xì)胞因子TRAIL可有效地抑制膀胱癌細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，可導(dǎo)致腫瘤縮小甚至消失，但對(duì)絕大多數(shù)正常細(xì)胞不產(chǎn)生殺傷作用，這是目前臨床上使用大多數(shù)細(xì)胞因子“敵我不分”、具有強(qiáng)烈毒副作用所不能比擬的，因此TRAIL 是構(gòu)建rBCG最有效的外源基因之一，rBCG-TRAIL有望成為治療膀胱癌，降低臨床BCG劑量和副作用的有效生物劑。目前，并沒(méi)有有效的卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種TRAIL重組卡介苗的構(gòu)建，其中的分泌型卡介苗穿梭表達(dá)載體 pMV261-Ag85B-TRAIL,具有 SEQ ID NO 1 所示序列，是在 pMV261 的 EcoR I 和 Hind III間插入TRAIL，然后在BamHI和EcoR I間插入Ag85B。所述的分泌型卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL通過(guò)以下構(gòu)建方法實(shí)現(xiàn)(1) PCR擴(kuò)增Ag85B信號(hào)肽片段和RT-PCR獲取目的基因TRAIL，并對(duì)其篩選、鑒定；(2)利用DNA重組技術(shù)，將以上兩個(gè)片段插入質(zhì)粒PMM61的HSP60啟動(dòng)子下游， TRAILDNA與pMW61分別用EcoRI和Hind III進(jìn)行酶切連接，得重組質(zhì)粒pMW61_TRAIL， BCG基因組DNA的抽提，并且PCR擴(kuò)增信號(hào)肽基因BCG-85B-SS，將pMV261_TRAIL和 BCG-85B-SS分別用EcoRI和BamHI進(jìn)行酶切連接，得重組質(zhì)粒pMV261_Ag85B_TRAIL ；(3)分泌型BCG穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL轉(zhuǎn)化大腸桿菌、抽提和純化；(4)對(duì)pMV261-Ag85B-TRAIL進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序鑒定。TRAIL PCR 擴(kuò)增上游引物序列 5，-GACGAATTCTACATGTACTTCACCAACG-3，，F(xiàn) 5'端引入 EcoRI 識(shí)別序列 G' AATTC，下游引物序列 5，-CGCAAGCTTCTAGTTAATTAAAAAGGCTCC-3，， R 5'端引入Hind III識(shí)別序列A' AGCTT0本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的TRAIL重組卡介苗在制備預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤和預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)的重組卡介苗rBCGTRAIL中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防和治療結(jié)核病的重組卡介苗rBCGTRAIL中的應(yīng)用，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)將經(jīng)過(guò)pMM61-Ag85B_TRAIL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E. coli DH5 α或X_blue的克隆菌落進(jìn)行PCR、酶切、和測(cè)序鑒定；(2)將凍干BCG制劑用生理鹽水融化，加入2ml細(xì)菌溶液，紗布封口后輕輕搖勻，倒入三角燒瓶置于37°C，轉(zhuǎn)速為150rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)；BCG培養(yǎng)兩周左右，OD600值約為 0. 6時(shí)，進(jìn)行接種，分別移種于新培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)或者凍存；(3)制備感受態(tài)BCG =BCG在Middlebrook 7H9培養(yǎng)基37 °C搖床培養(yǎng)，待培養(yǎng)液 OD600值約0. 6時(shí)將BCG菌液加入離心管中，冰浴2hr將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預(yù)冷air，4°C離心8000rpmX15min，丟棄上清；用原始體積的1/10、預(yù)冷的濃度為10%甘油重懸菌體；重復(fù)上述操作共五次，棄上清，加入原始體積1/50的10%甘油重懸菌體即得到感受態(tài)細(xì)菌，放置室溫下備用；(4)構(gòu)建重組卡介苗rBCGTRAIL:在一微量離心管中溫和混勻200 μ L感受態(tài) BCG (約 lX109cfu/ml)和 10 μ L 穿梭表達(dá)質(zhì)粒 pMV261_Ag85B_TRAIL (約 2 μ g)；冰浴 IOmin 后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0. 2CM的電擊轉(zhuǎn)化杯中，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)參數(shù)Voltage: 1250V, Capacitance :25 μ F，Resistance :600 Ω ；質(zhì)粒 pMV261-Ag85B_TRAIL，pMV261 及單純BCG的作用時(shí)間分別為11. 6，13，12毫秒；電轉(zhuǎn)完成后，迅速加Middlebrook7H9培養(yǎng)基 800 μ L入電轉(zhuǎn)化杯中混勻，再轉(zhuǎn)入離心管37°C 200rpm/minX3h培養(yǎng)；取100 μ L涂布在含30mg/L卡那霉素的MiddlebrOOk7H10固體培養(yǎng)基的離心試管內(nèi)斜面上，37°C繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)現(xiàn)克??；3 4周后挑選陽(yáng)性克隆，先進(jìn)行抗酸染色初步鑒定，明確后在含20ml液體培養(yǎng)基的離心試管里搖床培養(yǎng)生長(zhǎng)重組卡介苗rBCGTRAIL。此處感受態(tài)BCG在轉(zhuǎn)化時(shí)各做一陽(yáng)性對(duì)照pBCG(BCG中只含有空白質(zhì)粒pMM61)及陰性對(duì)照(BCG)；(5)重組卡介苗的培養(yǎng)重組卡介苗rBCGTRAIL在試管中搖床培養(yǎng)三周左右， 0D600值約為0. 6時(shí)，接種于三角燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，rBCG的接種、大量培養(yǎng)及凍存步驟同 BCG，不同的是液體及固體培養(yǎng)基里均含有50mg/L卡那霉素；(6)重組卡介苗rBCGTRAIL鑒定與功能檢測(cè)進(jìn)行抗酸染色初步確定rBCGTRAIL 為抗酸桿菌；抽提rBCGTRAIL質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到TRAIL的基因片段；WesternBlot 檢測(cè)到rBCGTRAIL培養(yǎng)上清中和菌體中有TRAIL蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)到rBCGTRAIL 培養(yǎng)上清中有高含量的TRAIL。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下可見(jiàn)一條特異的片段，和TRAIL 780bp相吻合；酶切鑒定2kb DNAMaker ；以EcoR I和Hind III雙酶切為4600bp，780bp兩條，條帶同預(yù)期結(jié)果。重組卡介苗rBCGTRAIL包含Ag85B信號(hào)肽和TRAIL基因片段。本發(fā)明構(gòu)建卡介苗穿梭表達(dá)載體的目的是確保在rBCG中合成的細(xì)胞因子能夠分泌到細(xì)胞外表達(dá)。為此，利用結(jié)核分支桿菌主要分泌蛋白Ag85B的特點(diǎn)，將其信號(hào)肽基因片斷克隆至hsp60啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，使其與TRAIL連接，起到將TRAIL經(jīng)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)并分泌到胞外的作用。酶切及DNA測(cè)序結(jié)果表明，外源基因已包含了 Ag85B的信號(hào)肽序列， 并有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，且序列結(jié)果完全正確，證明該信號(hào)肽基因確已加在 PMV261多克隆位點(diǎn)上。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)所克隆的信號(hào)肽Ag85B片段和TRAIL片段與文獻(xiàn)結(jié)果完全一致，pMV261-Ag85B-TRAIL的連接方向正確，閱讀框與預(yù)期完全一致，說(shuō)明卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建完全符合本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)要求。我們應(yīng)用基因工程技術(shù)，在質(zhì)粒PMW61中先后克隆TRAIL基因和BCG_Ag85B信號(hào)肽基因，構(gòu)建了新一代卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL，克服了最為關(guān)鍵的技術(shù)難題，進(jìn)一步通過(guò)電穿孔技術(shù)把載體導(dǎo)入BCG中，使BCG分泌表達(dá)TRAIL，從而達(dá)到構(gòu)建重組卡介苗的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是⑴重組卡介苗rBCGIL-TRAIL具有TRAIL和BCG的雙重功能，可以更好地發(fā)揮兩者的協(xié)同增效作用；(2)由于rBCGIL-TRAIL能夠分泌TRAIL，在達(dá)到同樣甚至增加免疫效果的條件下用量可低于BCG，從而降低了毒副作用；( rBCGIL-TRAIL能夠直接在局部高效分泌TRAIL，這既可協(xié)同rBCGIL-TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞，又避免了使用外源細(xì)胞因子所帶來(lái)的高額費(fèi)用。


圖1為卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B_TRAIL構(gòu)建示意圖。
圖2為甲醛變性凝膠電泳圖。圖3為TRAIL基因PCR擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果。圖4為Ag85B信號(hào)肽基因PCR擴(kuò)增后的電泳鑒定結(jié)果。圖5為PCR產(chǎn)物行1 %瓊脂糖凝膠電泳。圖6為酶切鑒定。圖7為穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL用BCG85B的正向引物測(cè)序。
圖8為穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL用BCG85B的反向引物測(cè)序。圖9為穿梭表達(dá)載體pMW61-Ag85B-TRAIL用TRAIL的正向引物測(cè)序。圖10為穿梭表達(dá)載體pMW61-Ag85B-TRAIL用TRAIL的反向引物測(cè)序。圖11為重組卡介苗的抗酸染色結(jié)果。圖12為重組卡介苗質(zhì)粒DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖13為重組卡介苗分泌蛋白Wfestern Blotting結(jié)果。圖14為BTT739荷瘤小鼠不同治療組的腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)。圖15為不同治療組腫瘤生存期的比較。圖16為治療后組織學(xué)檢查(HE染色400 X)。圖17為治療后組織學(xué)檢查(HE染色)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1本發(fā)明構(gòu)建卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B_TRAIL的流程圖參見(jiàn)圖1。一、實(shí)驗(yàn)方法1.獲取目的基因小鼠TRAIL基因1. 1組織中總RNA的抽提1.1.1 總 RNA 抽提(1)取-80°C冰箱中保存的小鼠脾臟，每50-100mg小鼠脾臟組織加Iml TRIZ0L， 用勻漿器勻漿；于室溫靜置5min ； (2)按每Iml TRIZOL試劑加入0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，充分震蕩15sec，室溫靜置2-;3min，4°C，12000rpm,離心15min ； (3)將上層水相吸入新管，按每 Iml TRIZOL試劑加入0. 5ml異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin, 4°C，12000rpm,離心IOmin,傾去上清；(4)用75%乙醇清洗RNA沉淀，每ImlTRIZOL加入Iml 75%乙醇，震蕩，4°C，7500rpm， 離心5min，靜置晾干；(5)加入RNase-free water溶解，保存于_70°C。1. 1. 2 總 RNA 的鑒定1. 1. 2. 1分光光度儀檢測(cè)從-70°C冰箱中取出75%乙醇溶解的RNA標(biāo)本，4°C 離心(13000rpmX5min)，棄上清，用槍頭吸干，加DEPC水100 μ 1溶解、混勻(可用離心機(jī) 13000rpm 甩數(shù)秒)。吸取 DEPC 水溶解的 RNA 2 μ 1，加 98 μ 1 DEPC 水，測(cè)定 0D260, 0D280, 其比值大于1.8，證明沒(méi)有蛋白質(zhì)殘余。1. 1. 2. 2甲醛變性凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量將電泳槽、電泳板、梳子用3 % H2A 泡15min(取30% H2A 35ml，加蒸餾水350ml)，DEPC水沖淋一次，用透明膠封好電泳板邊緣；用事先已處理過(guò)的燒瓶、量筒、電泳板配置甲醛變性凝膠；準(zhǔn)備RNA電泳緩沖液 (1XM0PS) 250ml。吸 4μ1 RNA 力Π 4 μ 1 DEPC 水稀釋，65°C 水浴變性 5min (或 70°C，3min) 后馬上置冰上，加8 μ 1 RNA上樣緩沖液，在1 XMOPS電泳緩沖液中點(diǎn)樣、電泳至滿意為止。 紫外燈下觀察、拍照?？梢?jiàn)^S、18S、5S三條明帶(參見(jiàn)圖2)。1. 2RT合成小鼠脾臟總cDNA建立40 μ 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，見(jiàn)表1-1。加樣后在離心機(jī)上甩IOmin左右，置42°C 水浴反應(yīng)lh，70°C加熱15min以終止反應(yīng)。然后置冰上，或_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 6
表I-I逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(40 μ 1體系)
權(quán)利要求
1.一種TRAIL重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于，其中的分泌型卡介苗穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL具有SEQ ID NO :1所示的序列，所述載體是在pMM61的EcoR I和 Hind III間插入TRAIL，然后在BamHI和EcoR I間插入Ag85B，分泌型卡介苗穿梭表達(dá)載體 pMV261-Ag85B-TRAIL的構(gòu)建方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)PCR擴(kuò)增Ag85B信號(hào)肽片段和RT-PCR獲取目的基因TRAIL，并對(duì)其篩選、鑒定；(2)利用DNA重組技術(shù)，將以上兩個(gè)片段插入質(zhì)粒pMM61的HSP60啟動(dòng)子下游， TRAILDNA與pMW61分別用EcoRI和Hind III進(jìn)行酶切連接，得重組質(zhì)粒pMW61_TRAIL， BCG基因組DNA的抽提，并且PCR擴(kuò)增信號(hào)肽基因BCG-85B-SS，將pMV261_TRAIL和 BCG-85B-SS分別用EcoRI和BamHI進(jìn)行酶切連接，得重組質(zhì)粒pMV261_Ag85B_TRAIL ；(3)分泌型BCG穿梭表達(dá)載體pMM61-Ag85B-TRAIL轉(zhuǎn)化大腸桿菌、抽提和純化；(4)對(duì)pMV261-Ag85B-TRAIL進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序鑒定；其中 TRAIL PCR 擴(kuò)增上游引物序列為 5，-GACGAATTCTACATGTACTTCACCAACG-3，，F(xiàn) 5' 端引入 EcoR I 識(shí)別序列 G' AATTC，下游引物序列為 5，-CGCAAGCTTCTAGTTAATTAAAAAGGCTC C-3’，R 5'端引入 Hind III 識(shí)別序列 A' AGCTT0
2.根據(jù)權(quán)利要求1方法構(gòu)建的一種TRAIL重組卡介苗在制備預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤及預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)的重組卡介苗rBCGTRAIL中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1方法構(gòu)建的一種TRAIL重組卡介苗在制備預(yù)防和治療結(jié)核病的重組卡介苗rBCGTRAIL中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種TRAIL重組卡介苗的構(gòu)建，涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號(hào)肽片段和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因片段的穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，得到的穿梭表達(dá)載體pMV261-Ag85B-TRAIL用于構(gòu)建重組卡介苗rBCGTRAIL，可在制備治療淺表性膀胱腫瘤和預(yù)防其術(shù)后復(fù)發(fā)以及預(yù)防結(jié)核病發(fā)生的TRAIL重組卡介苗中應(yīng)用。本發(fā)明的重組卡介苗具有TRAIL和BCG的雙重功能，可更好地發(fā)揮兩者的協(xié)同增效作用；由于rBCGIL-TRAIL能夠分泌TRAIL，在達(dá)到同樣甚至增加免疫效果的條件下用量可低于BCG，從而降低了毒副作用；rBCGIL-TRAIL能夠直接在局部高效分泌TRAIL，既可協(xié)同rBCGIL-TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞，又避免了使用外源細(xì)胞因子所帶來(lái)的高額費(fèi)用。
文檔編號(hào)A61P31/06GK102327604SQ201110241850
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者周卸來(lái), 沈周俊, 章國(guó)衛(wèi), 金曉東, 陳善聞 申請(qǐng)人:沈周俊