專利名稱：胰高血糖素樣肽-2類似物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2(Glucagon Like Peptide-2，GLP-2)類似物及其在制備用于預防和/或治療胃腸粘膜損傷相關病癥以及減輕化學療法和放射療法的胃腸道副作用的藥物中的用途。

背景技術：
GLP-2屬于胰高血糖素原衍生肽類(proglucagon-derived peptide，PGDP)，是胰高血糖素原(proglucagon，PG)被激素原轉化酶(prohormone convertase，PC)降解的產(chǎn)物之一，是由33個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量3900道爾頓，其氨基酸序列在哺乳動物中具有高度保守性[Drucker DJ.Glucagon-like peptide 2.JClin Endocrinol Metab，2001，861758-1774]。GLP-2由腸道L內(nèi)分泌細胞合成和釋放，并受攝食、神經(jīng)和內(nèi)分泌等因素調(diào)節(jié)，以進食含碳水化合物和脂肪的食物對L內(nèi)分泌細胞的分泌活動的刺激最為重要[Rocca AS.LaGreca J，Kalitsky J，Brubaker PL.Monounsaturated fatty acid diets improve glycemic tolerance through increased secretion of glucagon-like peptide-1.Endocrinology，2001，1421148-55]。正常成人餐后15分鐘內(nèi)和1小時后兩個時期，血循環(huán)中GLP-2的濃度升高最顯著。GLP-2在腸粘膜組織及血液循環(huán)中存在的主要形式是完整的GLP-2，即GLP-2(1-33)。GLP-2(1-33)在人體血循環(huán)中的生物半衰期約7分鐘，其代謝主要通過腎臟排泄和腸道刷狀緣上的二酰肽肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)水解其氨基末端前兩個殘基，形成無活性的GLP-2(2-33)。飼喂缺少DDP-4作用位點的GLP-2類似物的大鼠，其腸上皮生長情況明顯好于飼喂天然GLP-2的大鼠。雙側腎臟切除的大鼠血中GLP-2的清除率明顯低于未切除腎臟大鼠。然而，GLP-2(2-33)最近被證實是GLP-2受體(GLP-2R)的競爭性拮抗劑，能抑制GLP-2(1-33)和營養(yǎng)誘導的腸粘膜生長[Shin ED，Estall JL，Izzo A，Drucker DJ，Brubaker PL.Mucosal adaptation to enteral nutrients is dependent on the physiologic actions of glucagons-like peptide-2in mice.Gastroenterology，2005，1281340-53]。以上說明GLP-2的生物學活性受DDP-4水解，其降解產(chǎn)物拮抗和腎臟清除三者的調(diào)節(jié)。
GLP-2對腸道的作用包括特異性地刺激腸粘膜的生長，增強腸粘膜損傷后的再生；抑制腸粘膜上皮細胞和隱窩細胞的凋亡；增強腸上皮細胞基底側葡萄糖轉運蛋白-2(glucose transporter-2，GLUT2)的表達和對葡萄糖的轉運，促進腸消化和吸收功能；抑制胃腸動力和胃酸分泌；增強腸粘膜屏障功能；增加腸道血供。GLP-2對腸粘膜的作用基本上與年齡和性別無關，并且靜注、肌注、皮下注射或腹腔注射都有明顯效果[Burrin DG，Petersen Y，Stoll B，et al.Glucagon-like peptide 2a nutrient-responsive gut growth factor.J Nutr，2001，131709-712]。
GLP-2受體(GLP-2R)是B型胰高血糖素-胰泌素樣G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，其表達具有高度組織特異性。免疫組織化學和原位雜交技術已經(jīng)證實，GLP-2R在人類腸內(nèi)分泌細胞、鼠腸神經(jīng)元以及大鼠、小鼠、狨猴的上皮下肌纖維母細胞上表達[Yusta B，Huang L，Munroe D，et al.Enteroendocrine localization of GLP-2receptor expression in humans and rodents.Gastroenterology，119744-55；Bjerknes M，Cheng H.Modulation of specific intestinal epithelial progenitors by enteric neurons.Proc Natl Acad Sci.2001，9812497-502]。腸細胞上缺乏GLP-2R的表達，說明GLP-2R促進增生和細胞保護作用可能是間接的。
GLP-2在細胞內(nèi)的信號傳導是通過特異性GLP-2R介導的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路實現(xiàn)的。GLP-2激活腺苷酸環(huán)化酶，引起細胞內(nèi)cAMP增加，后者活化蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可能通過細胞內(nèi)Ca2+和/或三磷酸肌醇通路促進cAMP反應元件的基因轉錄。GLP-2可通過磷酸化型細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MEK)磷酸化體外培養(yǎng)的人腸黏膜上皮細胞Caco-2細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的兩個異構體ERK-1和ERK-2的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其活性增加，從而顯著促進Caco-2細胞增殖。該作用能分別被特異性的酪氨酸蛋白激酶抑制劑(Genistein)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)抑制劑(LY294002)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑(PD098059)阻斷。另一方面，GLP-2R信號激活可抑制放線菌酮誘導的BHK-GLP-2R細胞凋亡，這與其抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(caspase-3)酶活性，減少多聚ADP核糖聚合酶分裂相關。并且不論PKA抑制劑H289存在與否，GLP-2都能降低放線菌酮誘發(fā)的caspase-3的分裂。放線菌酮給藥后，在兩種激酶抑制劑即磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制劑LY294002和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑PD98054存在的條件下，GLP-2也能增加細胞存活率[Yusta B，Estall J，Drucker DJ.Glucagon-like peptide-2 recepter activation engages bad and glycogen synthase kinase-3 in a protei kinase A-dependent manner and prevents apoptosis following inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase.J Biol Chem，2002，27724896-24906；Walsh NA，Yusta B，DaCambra MP，et al.Glucagon-like peptide-2 recepter activation in the rat intestinal mucosa.Endocrinology，2003，1444385-4392]，說明GLP-2的胞內(nèi)信號傳導不完全依賴PI3-K和MAPK途徑。由此可見，GLP-2腸道作用機制所涉及的信號傳導通道很復雜既包括cAMP依賴的蛋白激酶途徑，也包括酪氨酸激酶途徑、PI3-K和MAPK途徑。GLP-2作用的確切分子機制目前尚未完全闡明。
GLP-2腸保護作用的人體試驗目前還處于起步階段，局限于短腸綜合征患者的治療性研究。已經(jīng)明確GLP-2具有促營養(yǎng)吸收作用，但是否有減輕腸損傷、促進腸修復的作用還有待進一步臨床試驗證實。雖然治療過程中尚未發(fā)現(xiàn)GLP-2的不良作用，但考慮到GLP-2的生物學作用是在動物胰高血糖素誘導腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)的，并且為裸鼠皮下注射胰高血糖素的研究顯示，GLP-2顯著促進腸粘膜生長，因此GLP-2是否會刺激腸道腫瘤的生長尚難定論。就短腸綜合征的治療而言，GLP-2的有效性需要大規(guī)模人群隨機對照研究證實。GLP-2治療的最適劑量、給藥途徑、療程和應用時機等都需要更深入的研究。相信GLP-2特殊的腸保護作用在防治吸收不良、炎性腸病、應激性胃腸粘膜損傷等疾病方面具有重要的臨床應用價值。
GLP-2以具有以下33個氨基酸的肽的形式分泌His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-A rg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。GLP-2在體內(nèi)迅速地被酶DPPIV在氮端的2位丙氨酸(Ala)處切割形成GLP-2(3-33)而失活。除腎清除外，GLP-2(1-33)的這種快速酶降解機制導致該肽在人體血循環(huán)中的半衰期為約7分鐘。
Drucker等在US5,994,500中描述了GLP-2拮抗劑及其對胃腸組織生長的影響，其提出將所述拮抗劑配制成藥物用于治療增生或誘導發(fā)育不全。美國5,994,500通過突變例如替換和缺失來改變哺乳動物GLP-2的結構。
US6,184,208、US5,789,379和US6,184,201公開了GLP-2類似物及其醫(yī)藥用途。所述類似物全是通過人GLP-2的替換和或缺失得到的。
DaCambra等(Biochemistry2000，39，8888-8894)描述了GLP-2活性的結構決定簇。這樣的決定簇的實例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5據(jù)信對GLP-2受體結合和活化是至關重要的。
Drucker等在WO97/39031中公開了GLP-2類似物[Gly2]GLP-2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPPIV切割。顯示丙氨酸的取代提高所述肽的穩(wěn)定性和效能。該專利申請描述了如何使用GLP-2類似物對抗腸上皮粘膜炎癥和損傷相關的疾病。這些疾病包括大規(guī)模小腸切除、炎性腸病、化學療法誘發(fā)的粘膜炎以及缺血性損傷。
WO02/066511描述了體內(nèi)半衰期延長的GLP-2類似物及其作為治療胃腸病癥如炎性腸病的藥物的用途。
WO01/14779描述了h[Gly2]GLP-2用作抑制化學療法誘導的凋亡和促進細胞存活的預處理的藥物的用途。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以下通式(I)代表的GLP-2類似物，及其可藥用鹽及它們的衍生物，該衍生物包括經(jīng)長鏈脂肪酸和/或聚乙二醇和/或其他長效化修飾所產(chǎn)生的GLP-2類似物的衍生物，或GLP-2類似物的可藥用鹽的衍生物 R1-Z1-X1-X2-X3-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu -Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-X25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Z2)-R2(I)， 其中Z1、Z2、R1或R2為不存在，或為天然或非天然氨基酸，或為由天然和/或非天然氨基酸組成的具有2至33個氨基酸單位的肽序列，而且X1、X2、X3、X10、X11、X15、X16、X24或X25為天然或非天然氨基酸。
優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式(I)代表的GLP-2類似物中，X1是His或D-His。
優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X2是D-Ala或Gly。
優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X10為Nle或Met。
優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X15為Glu或Asp。
優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的通式I代表的GLP-2類似物中，X3是Glu或Asp，并且X3以α羧基或者β羧基與Gly形成肽鍵。
具體而言，本發(fā)明更優(yōu)選具有下列序列的GLP-2類似物 D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-A la-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-A la-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-A la-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala -Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
根據(jù)本發(fā)明的記載，本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明所述的GLP-2類似物的制備方法，其特征在于該GLP-2類似物采用固態(tài)合成法制備并用反相液相色譜法純化。
本發(fā)明進一步涉及一種包括治療有效劑量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物藥物組合物，其包括藥學上可接受的載體和/或者癌癥化學療法藥物。
所述組合物的劑型優(yōu)選為注射劑或者緩釋劑。
本發(fā)明還涉及該藥物組合物在制備用于預防和/或治療胃腸粘膜損傷相關病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征癥、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、胃腸粘膜損傷導致的骨質疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學治療劑引起的胃腸粘膜損傷或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導的病癥。
本發(fā)明進一步涉及所述GLP-2類似物在制備用于預防和/或治療胃腸粘膜損傷相關病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、胃腸粘膜損傷導致的骨質疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、或者毒劑或者化學治療劑引起的胃腸粘膜損傷或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導的病癥。
由此可見，本發(fā)明涉及的是一種新的GLP-2類似物。與公知的GLP-2相比，本發(fā)明所述的GLP-2類似物的序列中一個或多個位置的氨基酸被替換，這樣使得本發(fā)明所述的GLP-2類似物具有體內(nèi)生物活性的改善和或化學穩(wěn)定性改善的特點。具體而言，優(yōu)選地，本發(fā)明所述的GLP-2類似物包含GLP-2序列1位、2位、3位、10位、11位、15位、16位、24位或25位中的一個或多個位置上的替換和/或替換組合。本發(fā)明提供具有改善的化學穩(wěn)定性和或生物活性的GLP-2類似物。
因此，本發(fā)明提供通式I代表的GLP-2類似物或其可藥用鹽或它們的衍生物 R1-Z1-X1-X2-X3-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu -Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-X25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Z2)-R2(通式I)，其中Z1、Z2，R1或R2為不存在，或為天然或非天然氨基酸，或為由天然或非天然氨基酸組成的3至20個氨基酸單位的肽序列，而且X1、X2、X3、X10、X11、X15、X16、X24或X25為天然或非天然氨基酸。
本發(fā)明所述的GLP-2類似物還具有提高的化學穩(wěn)定性，例如針對酸水解、氧化和脫酰胺作用的穩(wěn)定性。X3位的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物對酸水解的穩(wěn)定性，X10位的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物的氧化穩(wěn)定性。X11、X16和或X24位中一個或多個位置的替換可提高本發(fā)明所述的GLP-2類似物針對脫酰胺作用的穩(wěn)定性。因此，相對于Gly2-GLP-2，本發(fā)明所述的GLP-2類似物可顯示出針對酸性溶液中降解，針對脫酰胺作用和/或針對氧化降解的穩(wěn)定性的增強。X15位的替換可提高用化學合成法制備本發(fā)明所述的GLP-2類似物的產(chǎn)率。
GLP-2類似物經(jīng)長鏈脂肪酸和/或聚乙二醇或其他長效化修飾可延長其在生物體內(nèi)的半衰期。聚乙二醇修飾能有效地掩飾類似物母體，減少類似物被體內(nèi)免疫系統(tǒng)和體內(nèi)蛋白酶的辯識，從而降低了類似物的免疫原性和被體內(nèi)蛋白酶水解的幾率，從而延長GLP-2類似物在體內(nèi)循環(huán)的時間。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含與載體混合的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物的組合物。在優(yōu)選實施方案中，所述組合物為可藥用組合物，所述載體為藥學上可接受的或者藥用載體。本發(fā)明所述的GLP-2肽類似物可是本發(fā)明所述的GLP-2類似物的可藥用酸加成鹽。
在另一方面中，本發(fā)明涉及用于治療的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽。
在另一方面中，本發(fā)明涉及GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物用于制備治療和/或預防胃腸相關病癥的藥物中的用途，比如治療患有腸功能受損、骨質疏松癥或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導的病癥的新生兒。例如，所述胃和腸相關病癥選自消化道潰瘍、胃炎、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、腹瀉相關的腸易激綜合征、小腸損傷或短腸綜合征。
可用本發(fā)明所述的GLP-2類似物治療或可使用GLP-2類似物進行預防或治療的其它病癥包括放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎以及由于毒劑或其它化學診斷治療劑引起的小腸損傷。這可能需要與化學療法或放射療法的藥物同時或在后施用GLP-2類似物，以降低化學療法或放射療法的副作用例如腹瀉、腹部痛性痙攣或嘔吐，以及降低由化學療法或放射療法引起的腸上皮結構和功能損傷。
本發(fā)明還涉及一種治療藥盒，其包含癌癥化學療法藥物、本發(fā)明所述的GLP-2類似物以及使用說明書。
特別是，在治療藥盒中，其包含作為治療劑的癌癥化學療法藥物、本發(fā)明所述的GLP-2類似物以及使用說明書，并且每一種所述的藥物或者類似物均任選的與可藥用載體組合。所述治療劑可以分開包裝以分別使用，或可以在同一組合物中提供。
因此，本發(fā)明還涉及包含與可藥用載體組合的癌癥化學療法藥物和本發(fā)明GLP-2類似物的藥物組合物。
胃腸粘膜瘤形成風險提高的患者可能期望選擇化合物以降低副作用或消除副作用的風險。例如，選擇用于治療患有結腸瘤形成，或預防有發(fā)生結腸瘤形成風險的患者發(fā)生結腸瘤形成藥物時，選擇對小腸的選擇性高于結腸的藥物比非選擇性藥物或對結腸的選擇性高于小腸的藥物可能更合適。
在其他方面中，本發(fā)明還涉及GLP-2類似物在用于制備治療和/或預防營養(yǎng)不良的藥物中的用途。
在另一方面中，本發(fā)明涉及通過使用治療有效量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物在用于治療患者胃腸相關病癥的藥物中的用途。
在另一方面中，本發(fā)明涉及治療或預防有此需要的患者中化學療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括使用用治療有效量的本發(fā)明所述的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物。
在另一方面中，本發(fā)明提供治療和或預防有此需要的患者中營養(yǎng)不良的方法，所述方法包括使用治療有效量的本發(fā)明定義的GLP-2類似物或其鹽或它們的衍生物。
采用本領域技術人員公知的固相合成技術合成本發(fā)明所述的GLP-2類似物肽，其基本原理是先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂(固相載體)相連，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈。重復(縮合→洗滌→去保護→洗滌→下一輪縮合)操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中縮合和去保護反應步驟的中間控制采取的是茚三酮檢測的方法，即當樹脂肽鏈上有游離的氨基時，經(jīng)茚三酮試劑檢測會顯藍色，沒有游離氨基時不顯色(茚三酮試劑本身為黃色)。因此在進行縮合反應完畢后，通過茚三酮檢測，如果顯黃色(茚三酮試劑本身的顏色)，則說明本步偶合完畢可以進行下一個氨基酸的偶合前的脫保護操作，如果顯藍色，則證明肽鏈上還有些游離氨基，需進一步的重復偶合或改變現(xiàn)有的縮合劑直至樹脂肽經(jīng)茚三酮檢測為黃色。
本發(fā)明中涉及的GLP-2類似物的激動活性的檢測原理是GLP-2R是與Gs蛋白偶聯(lián)的受體，當受體與激動劑結合會導致細胞內(nèi)cAMP濃度升高。本實驗在HEK293細胞中共轉染GLP-2R和cAMP反應元件調(diào)控的熒光素酶報告基因質粒，當化合物與受體結合并激活受體時，熒光素酶表達就會增加。通過對熒光素酶活性的檢測即可獲知化合物對GLP-2R的激活狀況。

具體實施例方式 為了更詳細地說明本發(fā)明，給出下列實施例。但本發(fā)明的保護范圍并非限定于此，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的技術方案結合現(xiàn)有技術的方法，替換相關的氨基酸完成本發(fā)明，得到通式I限定出來的衍生物。
實施例1陽性化合物Teduglutide的固相合成 陽性化合物Teduglutide的序列為 H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH (1)固相合成樹脂的干燥及溶脹 稱量真空干燥24小時的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂(0.5mmol/g)40g(20mmol)置于2L鼓泡瓶中，加入400mLDMF溶脹樹脂30分鐘，抽掉DMF溶液； (2)Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂脫除Fmoc保護基 向裝有Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂的鼓泡瓶中加入200mL 20％哌啶/DMF溶液，反應5分鐘后抽出，再加入200mL 20％哌啶/DMF溶液室溫反應20分鐘。反應結束后用DMF 200mL洗滌樹脂四次。
(3)Teduglutide的固相合成 ①縮合Fmoc-Thr(tBu)-OH 稱量50mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH，加入125mL 0.4M HOBt/DMF溶解，再加入150mL 0.4M DIC/DCM室溫下攪拌反應10分鐘；將上述溶液加入到樹脂中，室溫下通入N2反應4小時。反應結束后抽掉反應液，依次用DMF，IPA和DMF洗滌樹脂。
②肽鏈的延長 按照Teduglutide中氨基酸從羧基端(C-端)到氨基端(N-端)的順序(H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH)，氨基酸和縮合試劑的用量和Fmoc-Thr(tBu)-OH相同，保護氨基酸分別是Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，重復縮合和脫保護兩步反應，合成His(Trt)-Asp-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(T rt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-As n(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang樹脂。
③Teduglutide樹脂肽的后處理 將②所得到的樹脂肽依次用DMF，IPA和DMF洗滌樹脂，用無水乙醚洗滌兩次后真空干燥，得樹脂肽。
(4)Teduglutide粗品肽的制備 取干燥后的樹脂肽，加入新鮮配制的10mL/g樹脂肽的TFA乙二硫醇(EDT)∶TIS∶水＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5(體積比)的裂解液，室溫下反應4小時。反應結束后過濾，用TFA洗滌樹脂二次，收集并合并濾液，旋轉蒸發(fā)至原體積的1/3，加入大量冰無水乙醚析出Teduglutide，離心后真空干燥得白色粗品。
(5)Teduglutide的反相液相色譜制備 取粗品肽5g溶于一定量的水中，經(jīng)0.45μm膜過濾后用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行分離，流動相為A 0.1％TFA/H2O，B 0.1％TFA/乙腈。其中，色譜柱為Denali C-18柱(粒徑8.3μm，5×30cm)，柱溫45度，檢測波長220nm，流速120mL/分鐘。收集產(chǎn)物峰，減壓濃縮除去大部分乙腈后凍干得Teduglutide成品1.0g，純度98.5％，收率20.0％。
實施例2化合物1的固相合成 化合物1的序列為 D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Gly，X3是ASP，X10是Met，X11是Asn，X15是Asp，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例3化合物2的固相合成 化合物2的序列為 D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Gly，X3是Glu，X10是Met，X11是Asn，X15是Asp，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例4化合物3的固相合成 化合物3的序列為 H-D-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-A la-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Ala，X3是Asp，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例5化合物4的固相合成 化合物4的序列為 H-D-His-Ala-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leμ-Glu-Asn-Leu-Ala-A la-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Ala，X3是Glu，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例6化合物5的固相合成 化合物5的序列為 H-D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Ala，X3是Asp，X10是Nle，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例7化合物6的固相合成 化合物6的序列為 H-D-His-D-Ala-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是D-Ala，X3是Glu，X10是Nle，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例8化合物7的固相合成 化合物7的序列為 H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leμ-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Gly，X3是Asp，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例9化合物8的固相合成 化合物8的序列為 His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leμ-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Ar g-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是His，X2是Gly，X3是Glu，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例10化合物9的固相合成 化合物9的序列為 H-D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-A la-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是D-His，X2是Gly，X3是Glu，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。
制備方法同實施例1。
實施例11化合物10的固相合成 化合物10的序列為 H-His-Gly-Asp*(Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Al a-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH，即在通式(I)中，X1是His，X2是Gly，X3是Asp，X10是Met，X11是Asn，X15是Glu，X16是Asn，X24是Asn，X25是Trp。其中X3處Asp*Fmoc-Asp-OtBu。
制備方法同實施例1。
實施例12對GLP-2受體(GLP-2R)的激動活性檢測 GLP-2R是與Gs蛋白偶聯(lián)的受體，當受體與激動劑結合會導致細胞內(nèi)cAMP濃度升高。本實施例在HEK293細胞中共轉染GLP-2R和cAMP反應元件調(diào)控的熒光素酶報告基因質粒，當GLP-2類似物與受體結合并激活該受體時，熒光素酶表達就會增加。通過對熒光素酶活性的檢測即可獲得GLP-2類似物對GLP-2R的激活狀況。待測各GLP-2類似物的相關信息如下表1所示 表1進行GLP-2R激動活性檢測的各GLP-2類似物的分子量、質量及終濃度

用電轉方法將GLP-2R和pCRE-Luc表達質粒導入HEK293細胞，轉染后的細胞以4萬個/孔/100μl的密度種入96孔板，在37oC孵育24小時。加入一定濃度梯度的本發(fā)明所述GLP-2類似物(每個濃度為3復孔)或陽性對照GLP-2，在37oC孵育5小時。溶劑DMSO為陰性對照。每孔取出50μl培養(yǎng)基，加入50μl熒光素酶底物，振蕩10分鐘。取出80μl反應液加入到白色的96孔板中，在Invision酶標儀上檢測。所述GLP-2類似物的EC50值、95％可信限和最大反應率如下表2所示。
表2各GLP-2類似物EC50、95％可信限和最大反應率 其中，化合物1、2均顯示了較好的GLP受體激動活性。
序列表
<110>連云港恒邦醫(yī)藥科技有限公司
<120>胰高血糖素樣肽-2類似物及其制備方法和用途
<130>890031CG
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>GLP-2類似物陽性化合物Teduglutide
<400>1
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 510 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>2
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物1
<400>2
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>3
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物2
<400>3
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>4
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物3
<400>4
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>5
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物4
<400>5
His Ala Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>6
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物5
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物5
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物5
<400>6
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>7
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物6
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物6
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物6
<400>7
His Ala Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>8
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>GLP-2類似物化合物7
<400>8
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>9
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>
<222>
<223>GLP-2類似物化合物8
<400>9
His Gly Glu Gly Ser Phe SerAsp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>10
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物9
<400>10
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>11
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>兩者之間以β羧基形成肽鍵
<222>(3)..(4)
<223>GLP-2類似物化合物10
<400>11
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>12
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物11
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物11
<400>12
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>13
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物12
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物12
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物12
<220>
<221>Ala是L-3-(2-萘基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物12
<400>13
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile GlnAla Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>14
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物13
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物13
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物13
<220>
<221>Ala是L-3-(1-萘基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物13
<400>14
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>15
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物14
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物14
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物14
<220>
<221>Ala是L-3-(2’-喹喏基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物14
<400>15
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile GlnAla Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>16
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物15
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物15
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物15
<220>
<221>Ala是L-3-(3’-喹喏基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物15
<400>16
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>17
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物16
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物16
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物16
<220>
<221>Trp是D-Trp
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物16
<400>17
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>18
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Trp是D-Trp
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物17
<400>18
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>19
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(1-萘基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物18
<400>19
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>20
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(2-萘基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物19
<400>20
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Gln Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>21
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(1’-喹喏基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物20
<400>21
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>22
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(2’-喹喏基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物21
<400>22
His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>23
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Trp是D-Trp
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物22
<400>23
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Gln Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>24
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(2-萘基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物23
<400>24
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>25
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>Ala是L-3-(3’-喹喏基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物24
<400>25
His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210>26
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>His是D-His
<222>(1)..(1)
<223>GLP-2類似物化合物25
<220>
<221>Ala是D-Ala
<222>(2)..(2)
<223>GLP-2類似物化合物25
<220>
<221>Xaa是Nle
<222>(10)..(10)
<223>GLP-2類似物化合物25
<220>
<221>Ala是L-3-(3’-吡啶基)-Ala
<222>(25)..(25)
<223>GLP-2類似物化合物25
<400>26
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Xaa Asn Thr Ile Leu Glu Asn
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Ala Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
權利要求
1.一種以下通式(I)代表的胰高血糖素樣肽-2類似物，及其可藥用鹽及它們的衍生物，該衍生物包括經(jīng)長鏈脂肪酸和/或聚乙二醇和/或其他長效化修飾所產(chǎn)生的胰高血糖素樣肽-2類似物的衍生物，或胰高血糖素樣肽-2類似物的可藥用鹽的衍生物
R1-Z1-X1-X2-X3-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-X10-X11-Thr-Ile-Leu-X15-X16-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-X25-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-(Z2)-R2(I)，
其中Z1、Z2、R1或R2為不存在，或為天然或非天然氨基酸，或為由天然和/或非天然氨基酸組成的具有2至33個氨基酸單位的肽序列，而且X1、X2、X3、X10、X11、X15、X16、X24或X25為天然或非天然氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其中X1是His或D-His。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其中X2是D-Ala或Gly。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其中X10是Nle或Met。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其中X15是Glu或Asp。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的胰高血糖素樣肽2類似物，其中X3是Glu或Asp，并且X3以α羧基或者β羧基與Gly形成肽鍵。
7.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列
D-His-D-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Nle-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
8.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
9.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列
His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Glu-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
10.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列
D-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
11.根據(jù)權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物，其具有下列序列
D-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp。
12.一種權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物的制備方法，其特征在于該胰高血糖素樣肽-2類似物采用固相合成法制備并用反相液相色譜法純化。
13.一種包括治療有效劑量的權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物的藥物組合物，其包括藥學上可接受的載體和/或癌癥化學療法藥物。
14.根據(jù)權利要求13所述的藥物組合物，其劑型為注射劑或者緩釋劑。
15.一種如權利要求13或14所述的藥物組合物在制備用于預防和/或治療胃腸粘膜損傷相關病癥的藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、胃腸粘膜損傷導致的骨質疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學治療劑引起的胃腸粘膜損傷，或二肽基肽酶-IV介導的病癥。
16.一種如權利要求1所述的胰高血糖素樣肽2類似物在制備用于預防和/或治療胃腸粘膜損傷相關病癥藥物中的用途，其中胃腸粘膜損傷相關病癥選自消化道潰瘍、吸收不良綜合征、短腸綜合征、回盲瓣綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎、潰瘍性結腸炎、胃腸粘膜損傷導致的骨質疏松癥和/或營養(yǎng)不良癥、化學療法或放射療法的胃腸道副作用，優(yōu)選腹瀉、腹部痛性痙攣、嘔吐，放射性胃腸炎、傳染性胃腸炎或感染后胃腸炎、毒劑或者化學治療劑引起的胃腸粘膜損傷，或二肽基肽酶-IV介導的病癥。
17.一種治療藥盒，其包含癌癥化學療法藥物、權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2類似物以及使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)類似物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明進一步涉及一種含有GLP-2類似物及其可藥用鹽的藥物組合物。本發(fā)明提供的GLP-2類似物或含有GLP-2類似物及其可藥用鹽的藥物組合物能在預防或治療與粘膜損傷有關的胃腸道相關病癥以及減輕化學療法和放射療法的胃腸道副作用中廣泛應用。
文檔編號A61P35/00GK101824087SQ20091012636
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權日2009年3月5日
發(fā)明者王亞里, 孫長安, 王瑞軍, 姜濤 申請人:連云港恒邦醫(yī)藥科技有限公司