專利名稱：一種抗腫瘤的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種抗腫瘤的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤的死亡率在我國高居第二位、僅次于心腦血管疾病，近年每年新增腫瘤患者 250萬人，北京市發(fā)病率年增2. 58%。由于環(huán)境、食物、水污染的加劇以及生活方式的改變， 人類普遍感受到腫瘤的威脅。除了常規(guī)的外科手術(shù)、化療、放療，人類正積極尋求其它低毒副作用的治療與輔助治療方法。原發(fā)性肝癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率在全球呈上升趨勢，每年新發(fā)病例約62萬例，死亡約60萬例[1]，位居全球腫瘤相關(guān)死亡的第3位。我國是原發(fā)性肝癌大國，發(fā)病率與死亡率均居世界之首，我國每年發(fā)病人數(shù)約34. 7萬例，占全球的55%，死亡人數(shù)約32. 3萬例，約占全球的M%，在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位居第二 ra。外科手術(shù)切除是治療原發(fā)性惡性腫瘤的首選手段，但由于原發(fā)性惡性腫瘤起病隱蔽、進(jìn)展迅速、早期診斷率低，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法得到有效的手術(shù)治療。放療因其屏蔽作用不能保證腫瘤周圍的正常組織不受損害而導(dǎo)致各種嚴(yán)重的并發(fā)癥?；熓侵委熤型砥趷盒阅[瘤的常用方法之一，可以起到姑息性治療作用，但目前臨床上使用的化療藥物都具有明顯的毒副作用、價(jià)格昂貴、易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)治療效果也不盡如人意。中藥或天然藥物抗腫瘤作用大多是通過多靶點(diǎn)、多效應(yīng)來阻斷腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用，同時(shí)中藥具有毒副作用低、價(jià)格低廉和耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)，因此中藥抗腫瘤的研究在國內(nèi)外倍受重視[3]。從中藥或天然藥物中探尋、分離提取抗癌作用強(qiáng)、毒副作用小、抑瘤譜廣、價(jià)格便宜的天然化合物，是研究新的抗腫瘤藥物的重要途徑。殼寡糖(chitoSan，CTS)是由2-10個(gè)2-氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接組成的寡糖，是甲殼素脫乙酰基后進(jìn)一步的降解產(chǎn)物，具有良好的生物相容性和生物可降解性， 水溶性好，易吸收，而且無毒副作用。殼寡糖有多種生物功能，已應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品等各個(gè)領(lǐng)域。在日本、美國等國家，將殼寡糖作為功能性食品成分廣泛地應(yīng)用于保健食品。近年來，國內(nèi)外研究證實(shí)殼寡糖及其衍生物具有抑制癌細(xì)胞及腫瘤生長等作用[4]，作為抗腫瘤藥，吸收率高、長期口服無毒副作用是其優(yōu)點(diǎn)，但抑瘤率較低是它最大的弱點(diǎn)。蟲丘蚓纖溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme, EFE)亦稱蚓激酶(lumbro kinase, LK)，是從蚯蚓提取的一種具有纖維蛋白溶解活性的蛋白水解酶，口服可以進(jìn)入血流，臨床上口服用于溶解血栓(蚓激酶膠囊、普恩福、博洛克)；無明顯毒副作用，也見于保健食品(龍舒泰精制地龍膠囊)。目前國內(nèi)外對殼寡糖、蚯蚓纖溶酶抗腫瘤的研究僅限于單藥的研究，雖然兩個(gè)單藥無毒副作用或無明顯毒副作用，但抗腫瘤的作用也相對較弱，在實(shí)驗(yàn)動物、在臨床應(yīng)用效果也不夠理想。能否在利用其安全性的同時(shí)、大幅度提高抗腫瘤效果，使之成為理想的抗腫瘤新藥。

發(fā)明內(nèi)容
抗腫瘤治療周期長、影響因素多，特別是中晚期患者機(jī)體已經(jīng)衰弱，因此抗腫瘤藥的安全性和抗腫瘤效果是兩個(gè)并重的指標(biāo)。從中藥或天然藥物分離提取抗腫瘤有效成分， 選擇低毒副作用的有效成分，試驗(yàn)它們不同的配方組合以求大幅度提高抗腫瘤效果，是開拓抗腫瘤新藥的有效途徑。本發(fā)明采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和小鼠肝癌H22移植瘤為模型，進(jìn)一步研究殼寡糖-蚯蚓纖溶酶不同配比組合物的抑瘤效果、抑瘤機(jī)理以及對動物的毒副作用，旨在保持無毒副作用-無明顯毒副作用的基礎(chǔ)上， 顯著提高新的藥物組合物的抗腫瘤效果。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的有效成分包括殼寡糖和蚯蚓纖溶酶(又稱蚓激酶)；其中，殼寡糖和蚯蚓纖溶酶的用量比為IOOg 10萬 100 萬uku，優(yōu)選為IOOg 10萬 70萬uku，進(jìn)一步優(yōu)選IOOg 10萬 30萬uku，最優(yōu)選 IOOg 20萬 30萬uku。本發(fā)明所采用的原料可為殼寡糖或蚯蚓纖溶酶不同程度提取、 提純的粗制品、精制品及其衍生物或其它含殼寡糖、含蚯蚓纖溶酶的復(fù)方或者混合物。采用的殼寡糖聚合度為2 10。本發(fā)明所述的殼寡糖和蚯蚓纖溶酶可直接混合制成散劑或加入藥學(xué)可接受的輔料制成口服制劑。所述的口服制劑為膠囊劑、片劑、顆粒劑或丸劑；膠囊劑優(yōu)選腸溶膠囊，顆粒劑優(yōu)選腸溶顆粒劑、片劑優(yōu)選腸溶片劑。該藥物組合物的服用劑量為成人日服殼寡糖300 4500mg和蚯蚓纖溶酶600 3000ukuo本發(fā)明所述的抗腫瘤的藥物組合物可在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物或輔助抗腫瘤的保健食品中應(yīng)用。特別是在制備治療或預(yù)防乳腺癌、胃癌、肺癌、直腸癌、食道癌、肝癌、 胰腺癌的藥物或輔助抗腫瘤的保健食品中應(yīng)用。本發(fā)明所使用的殼寡糖具體可通過以下方法制備得到酶解法制備的食品級殼寡糖的水溶液，超過濾，合并濾過液，冷凍干燥，得聚合度2-10的殼寡糖白色粉末。所使用的蚯蚓纖溶酶可通過以下方法制備得到新鮮赤子愛勝蚓為原料，勻漿、 NaCl溶液抽提，用活化的大孔陰離子交換樹脂交換、洗滌、洗脫，洗脫液超過濾、洗滌、濃縮， 冷凍干燥，即得。本發(fā)明通過以下4個(gè)方面探討其抗癌功效1.體外試驗(yàn)①取對數(shù)生長期人肝癌SMMC-7721的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度3 X IO4個(gè)/ml接種96 孔板、每孔200 μ 1，培養(yǎng)Mh.后加入不同濃度的單藥或藥物組合物繼續(xù)培養(yǎng)Mh.、48h.、 72h.，吸棄上清、MTT法測定癌細(xì)胞增殖抑制率。②單細(xì)胞懸液接種細(xì)胞瓶，生長貼壁后加入不同濃度單藥或藥物組合物繼續(xù)培養(yǎng) 48h.，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；同時(shí)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，測定細(xì)胞凋亡率。2.體內(nèi)試驗(yàn)給昆明種小鼠皮下注射定量荷瘤鼠腹水細(xì)胞，制備鼠肝癌H22移植瘤模型。分別用單藥或者不同配方的藥物組合物給藥20天，停藥24h后處死動物①剝離瘤塊計(jì)算抑瘤率；②取出肝、腎，固定、切片、HE染色，作組織病理學(xué)觀察；③眼眶采血、生化檢測肝腎功能；④剝離脾臟稱重、計(jì)算脾指數(shù)。3.抗腫瘤機(jī)制的探討不同濃度的單藥或藥物組合物加入人肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)孔、繼續(xù)培養(yǎng)48h， 提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR測定細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的變化。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。鼠肝癌H22移植瘤的荷瘤鼠，經(jīng)不同濃度的單藥或藥物組合物灌胃治療20天后， 處死動物、剝離瘤塊，固定、切片，用免疫組化的方法檢測腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)。4.在晚期腫瘤患者的初步臨床應(yīng)用經(jīng)過反復(fù)的動物試驗(yàn)和多名健康志愿者口服試驗(yàn)、確證本發(fā)明藥物組合物的安全性后，應(yīng)31名晚期腫瘤患者和家屬的要求，自愿服用本發(fā)明藥物組合物，觀察其療效和安全性。與現(xiàn)有技術(shù)比較本發(fā)明的有益效果1.通過對實(shí)驗(yàn)動物的觀察和動物肝腎的組織病理觀察、肝腎功能生化檢測以及脾指數(shù)計(jì)算證實(shí)，本發(fā)明藥物組合物無明顯毒副作用。本發(fā)明的藥物組合物用于晚期腫瘤患者，長者連續(xù)18個(gè)月，同樣未出現(xiàn)明顯毒副作用。2.本發(fā)明的藥物組合物與兩個(gè)單藥體外、體內(nèi)的抗腫瘤效果相比十分顯著地提高癌細(xì)胞增殖抑制率；十分顯著地提高抑瘤率；十分顯著地提高腫瘤細(xì)胞凋亡率；十分顯著地下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)和下調(diào)Bcl_2蛋白的表達(dá)。3.本發(fā)明的藥物組合物中兩個(gè)單藥的相互作用性質(zhì)為協(xié)同作用。因此，本發(fā)明藥物組合物用于制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物或輔助抗腫瘤的保健食品，具有十分良好的應(yīng)用前景與顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1-1.單藥殼寡糖抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的量效曲線圖1-2.單藥蚯蚓纖溶酶抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的量效曲線圖1-3.藥物組合物殼寡糖-蚯蚓纖溶酶聯(lián)合抑制SMMC-7721細(xì)胞的時(shí)效曲線圖中，1.lmg/ml 殼寡糖，2. 2mg/ml 殼寡糖，3. 2. 5uku/ml 蚯蚓纖溶酶，4. lmg/ml 殼寡糖+2. 5uku/ml蚯蚓纖溶酶，5. 2mg/ml殼寡糖+2. 5uku/ml蚯蚓纖溶酶，6. 5uku/ml蚯蚓纖溶酶，7. lmg/ml殼寡糖+5uku/ml蚯蚓纖溶酶，8. 2mg/ml殼寡糖+5uku/ml蚯蚓纖溶酶圖2-1.生理鹽水對照組肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化圖中，生理鹽水對照組細(xì)胞大小均一，呈上皮型貼壁生長，外形為梭形或多角形， 輪廓清晰，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，折光性好，生長旺盛。圖2-2. lmg/ml殼寡糖引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化圖中，lmg/ml殼寡糖處理4 后，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，細(xì)胞密度略有降低，其余較對照組沒有明顯變化。圖2-3. 3uku/ml蚯蚓纖溶酶引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化圖中，3uku/ml蚯蚓纖溶酶處理4 后，細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，細(xì)胞密度略有降低。圖2-4. 5uku/ml蚯蚓纖溶酶引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化
圖中，5uku/ml蚯蚓纖溶酶處理4 后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、逐漸變圓，細(xì)胞密度降低， 細(xì)胞間接觸變松，折光性及貼壁能力變?nèi)?。圖2-5. lmg/ml殼寡糖luku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合作用引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化圖中，lmg/ml殼寡糖_3uku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合作用4 后，細(xì)胞明顯皺縮，細(xì)胞體積變小，密度明顯降低。圖2-6. lmg/ml殼寡糖_5uku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合作用引起肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的變化圖中，lmg/ml殼寡糖_5uku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合作用4 后，細(xì)胞皺縮嚴(yán)重、體積明顯縮小，失去正常多角形的形態(tài)，細(xì)胞間排列疏松，折光性及貼壁能力變?nèi)?。圖3-1.生理鹽水對照組對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響生理鹽水對照組細(xì)胞凋亡率(2. 36% )；
Quad %Gated %
UL0.92UR7.18
LL89.57
LR2.36圖3-2. 3uku/ml蚯蚓纖溶酶對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響3uku/ml蚯蚓纖溶酶處理48h后細(xì)胞凋亡率(15. 22% )
Quad % Gated %
UL5.51UR31.77
LL50.20
LR15.22圖3-3. lmg/ml殼寡糖對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響lmg/ml殼寡糖處理48h.后細(xì)胞凋亡率(7. 46% )
Quad % Gated %
UL5.18UR9.19
LL78.17
LR7.46圖3-4. lmg/ml殼寡糖-;3uku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響lmg/ml殼寡糖luku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合處理細(xì)胞48h，凋亡率46% )0藥物組合物組凋亡率與單藥組、與對照組差異均十分顯著(P < 0. 01)。
6Quad % Gated % UL3.18UR 17.19LL 56.17LR 23.46
圖4-1.生理鹽水對照組移植瘤
圖4-2.殼寡糖組(150mg/kg · d)移植瘤，抑瘤率17. 13%。
圖4-3.蚯蚓纖溶酶組(lOOOuku/kg · d)移植瘤，抑瘤率18. 65%。
圖4-4.殼寡糖(150mg/kg · d)聯(lián)合蚯蚓纖溶酶(1000uku/kg · d)組移植瘤，抑瘤率 49. 07%。由圖4-1、4-2、4-3、4-4可見各組藥物對小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。
圖5-1.生理鹽水組肝臟切片(X200)
圖5-2.殼寡糖組(150mg/kg · d)肝臟切片(X200)
圖5-3.蚯蚓纖溶酶組(lOOOuku/kg · d)肝臟切片(X200)
圖5-4.殼寡糖(150mg/kg · d)聯(lián)合蚯蚓纖溶酶(1000uku/kg · d)組肝臟切片(X200)
圖6-1.生理鹽水組小鼠腎臟切片(X200)
圖6-2.殼寡糖組(150mg/kg · d)小鼠腎臟切片(X200)
圖6-3.蚯蚓纖溶酶組(lOOOuku/kg · d)腎臟切片(X200)
圖6-4.殼寡糖(150mg/kg · d)聯(lián)合蚯蚓纖溶酶(lOOOuku/kg · d)組腎臟切片(X200)
圖7-1.人肝癌細(xì)胞Bcl-2 mRNA的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
圖7-2.人肝癌細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的半定量分析
圖7-1和7-2顯示各組藥物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞Bcl_2 mRNA表達(dá)的下調(diào)。
其中，M. Maker、l.空白對照、2. 0. 5mg/ml殼寡糖組、3. lmg/ml殼寡糖組、4. 3uku/
ml蚯蚓纖溶酶組、5. 0. 5mg/ml殼寡糖+!3uku/ml蚯蚓纖溶酶組、6. lmg/ml殼寡糖+!3uku/ml 蚯蚓纖溶酶組。圖8-1.模型組移植瘤Bcl-2蛋白表達(dá)(X200)圖中，模型組腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)(Bcl-2蛋白染成黃色-棕黃色)圖8-2.蚯蚓纖溶酶組(lOOOuku/kg · d)Bcl-2 蛋白表達(dá)(X200)圖8-3.殼寡糖組(150mg/kg · d)Bcl-2 蛋白表達(dá)(X200)圖8-4.殼寡糖(150mg/kg · d)_蚯蚓纖溶酶(1000uku/kg · d)組Bcl-2蛋白表達(dá) (X200)
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)例1單藥和藥物組合物的制備1.殼寡糖的制備殼寡糖，酶解法生產(chǎn)、食品級，梭子蟹殼為原料，購自濰坊海之源生物制品公司。將食品級殼寡糖溶于蒸餾水成10%溶液，IOOrnl溶液置于MSC400杯式超濾器(上海摩速科學(xué)器材)、超濾膜切割分子量2KD，加壓、攪拌過濾；補(bǔ)加少量蒸餾水繼續(xù)加壓、攪拌過濾，合并濾過液、冷凍干燥，即得。成品為白色粉末，分子量低于2000D，收得率55%左右。取適量樣品HPLC分析M，Waters糖柱，流動相為乙腈水=50 50 (含3%。氨水)，流速為ImL/ min0以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)測樣品聚合度為2-9。2.蚯蚓纖溶酶的制備以新鮮赤子愛勝蚓為原料，采用離子交換法直接從蚯蚓勻漿提取[專利號ZL 2009 10(^6780. 6 —種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)方法]。步驟為①新鮮或冷凍赤子愛勝蚓，在0. 14mol/L NaCl溶液中勻漿并攪拌提取2小時(shí)，隨即4000g離心或過濾除去沉淀，得蚯蚓粗提液。②無離子水調(diào)節(jié)蚯蚓粗提液的電導(dǎo)率 l-5ml/Ω，已活化的大孔陰離子交換樹脂裝柱、上樣、進(jìn)行動態(tài)離子交換，用電導(dǎo)率l-5ml/ Ω NaCL液洗滌。③用0. 5 4. 5mol/L pH 5-6的NaCl溶液梯度洗脫、收集纖溶酶洗脫峰。④洗脫液通過超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥，即得。⑤產(chǎn)品質(zhì)量符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WSl-(X-052)-2001Z 按干品計(jì)算效價(jià)不低于12000單位/mg(即12uku/mg)，比活力不低于 20000單位/mg蛋白質(zhì)(即20uku/mg ptrotein)。纖維蛋白平板法[9]實(shí)測纖溶酶效價(jià) 25uku/mg。試驗(yàn)例2不同單藥和藥物組合物對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長的抑制作用1.人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞株購自上海細(xì)胞所。將SMMC-7721細(xì)胞接種于含適量的培養(yǎng)液(RPIM-1640加10%熱滅活的小牛血清)的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37°〇、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。胰酶消化法傳代細(xì)胞，每2 3天傳代1 次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13. 0對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用X2檢驗(yàn)，以P < 0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Weeb系數(shù)[5]來判定聯(lián)合應(yīng)用藥物的相互作用關(guān)系預(yù)估效應(yīng)C = AXB，其中 A、B分別指兩個(gè)單藥作用的細(xì)胞實(shí)際存活率。當(dāng)兩藥聯(lián)合作用的細(xì)胞實(shí)際存活率< C時(shí)， 聯(lián)合用藥表現(xiàn)為協(xié)同作用；當(dāng)C <聯(lián)合用藥組細(xì)胞實(shí)際存活率< A和B時(shí)，聯(lián)合用藥表現(xiàn)為相加作用。3.人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(1)單藥對人肝癌細(xì)胞的增殖抑制試驗(yàn)(MTT法)取對數(shù)生長期人肝癌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液、3X IO4個(gè)/ml，接種于96孔板內(nèi)、200 μ 1/孔，其中3個(gè)孔留作空白對照，在37°C、5% CO2培養(yǎng)Mh。取出96 孔板，加入不同濃度梯度的蚯蚓纖溶酶或殼寡糖200 μ 1，使每孔蚯蚓纖溶酶終末濃度分別為 0. 625uku/ml、l. 25uku/ml、2. 5uku/ml、5uku/ml、10uku/ml，每孔殼寡糖終末濃度分別為 0. 125mg/ml、0. 25mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、4mg/ml，陰性對照組每孔加入 200 μ 1 普通培養(yǎng)液，空白孔加200μ1普通培養(yǎng)液不加細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)Mh、48h、72h，棄上清，每孔加入5mg/ml MTT 20 μ 1，繼續(xù)溫育4h，吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ 1，振蕩lOmin，用自動酶標(biāo)讀數(shù)儀，在波長570nm 處測定各孔吸光值(A)，取4個(gè)復(fù)孔的平均值。以藥物濃度為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線，并計(jì)算藥物作用Mh、48h、72h的增殖抑制率。抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白孔平均A值)/ (陰性對照組平均A值-空白孔平均A值)]X 100%。試驗(yàn)結(jié)果表明1、殼寡糖對SMMC-7721細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，但是作用較弱。(見圖1_1)2.蚯蚓纖溶酶對SMMC-7721細(xì)胞增殖有一定的抑制作用(P < 0. 05)，作用比殼寡糖強(qiáng)，具有時(shí)間、劑量依賴性。(見圖1-2)(2)藥物組合物對人肝癌細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT法)根據(jù)上一項(xiàng)單藥抑制試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得出各組的IC5tl值，選擇合適的殼寡糖、蚯蚓纖溶酶濃度配比組成聯(lián)合用藥的組合物，重復(fù)MTT法，繪制細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算殼寡糖、蚯蚓纖溶酶以及殼寡糖聯(lián)合蚯蚓纖溶酶作用Mh、48h、72h的細(xì)胞增殖抑制率。本試驗(yàn)選擇的藥物組合物配比為lmg/ml殼寡糖、2mg/ml殼寡糖分別與2. 5uku/ ml蚯蚓纖溶酶、5uku/ml蚯蚓纖溶酶聯(lián)合作用。(見圖1_3)試驗(yàn)結(jié)果表明1.殼寡糖聯(lián)合蚯蚓纖溶酶的四種藥物組合物、不同時(shí)段對癌細(xì)胞的增殖抑制率均顯著提高，與對應(yīng)濃度的兩個(gè)單藥組相比，差異都十分顯著(P < 0.01)。 (見圖1-3)2. lmg/ml殼寡糖聯(lián)合2. 5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纖溶酶，作用24h、48h和72h，各組的細(xì)胞的存活率均高于預(yù)計(jì)值C、低于相應(yīng)單藥組A和B的實(shí)際存活率，兩種組合物中兩個(gè)單藥的相互作用性質(zhì)為相加作用。(見表1、圖1-3)3. 2mg/ml殼寡糖聯(lián)合2. 5uku/ml或5uku/ml蚯蚓纖溶酶，作用24h、48h和72h，各組細(xì)胞的存活率均低于預(yù)計(jì)值C，更低于相應(yīng)單藥組A和B的實(shí)際存活率，兩種組合物中兩個(gè)單藥的相互作用性質(zhì)為協(xié)同作用。(見表1，圖1-3)表1.藥物組合物作用于SMMC-7721細(xì)胞的存活率和C值(％ )
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的有效成分包括殼寡糖和蚯蚓纖溶酶；其中，殼寡糖和蚯蚓纖溶酶的用量比為IOOg 10萬 100萬uku。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于藥物組合物中殼寡糖和蚯蚓纖溶酶的用量比為IOOg 10萬 70萬uku。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于藥物組合物中殼寡糖和蚯蚓纖溶酶的用量比為IOOg 10萬 30萬uku。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的殼寡糖聚合度為2 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于殼寡糖和蚯蚓纖溶酶直接混合制成散劑或加入藥學(xué)可接受的輔料制成口服制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的口服制劑為膠囊劑、片劑、顆粒劑或丸劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的膠囊劑為腸溶膠囊，顆粒劑為腸溶顆粒劑，片劑為腸溶片劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的服用劑量為成人日服殼寡糖300 4500mg和蚯蚓纖溶酶600 3000uku。
9.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的藥物組合物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物或輔助抗腫瘤的保健食品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的藥物組合物在制備治療或預(yù)防乳腺癌、胃癌、肺癌、直腸癌、食道癌、肝癌、胰腺癌的藥物或輔助抗腫瘤的保健食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用，該藥物組合物的有效成分包括殼寡糖和蚯蚓纖溶酶；其中，殼寡糖和蚯蚓纖溶酶的用量比為100g∶10萬～100萬uku。本藥物組合物中兩個(gè)單藥的相互作用關(guān)系為協(xié)同增效作用。
文檔編號A61K31/722GK102225198SQ201110178160
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者張曉曉, 張治國, 連桂芳 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)