專利名稱：b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流感嗜血桿菌疫苗，尤其涉及b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感嗜血桿菌根據(jù)莢膜的性質(zhì)分為a，b，c，d，e, f型及不可分型，其中b型流感嗜血桿菌的侵襲力最強(qiáng)。由b型流感嗜血桿菌(Hib)引起的化膿性腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、會(huì)厭炎等疾病，已成為全球一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。而研制成功的Hib多糖疫苗及Hib結(jié)合疫苗，可有效預(yù)防由b型流感嗜血桿菌引起的感染。對(duì)于5對(duì)以下兒童，尤其是2周歲以下的嬰幼兒，Hib多糖疫苗的保護(hù)效果不佳。
優(yōu)良方法。蛋白載體具有T細(xì)胞依賴的特性，在莢膜多糖特異性抗原上加上蛋白載體可將非T細(xì)胞依賴性的多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，激發(fā)機(jī)體的T輔助細(xì)胞產(chǎn)生的一系列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。對(duì)于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟的嬰幼兒，尤其是2周歲以下的嬰幼兒而言，結(jié)合疫苗大大增強(qiáng)了其免疫效果?，F(xiàn)有技術(shù)廣泛采用溴化氰活化，己二酰肼衍生，并在碳二亞胺存在下，與蛋白載體例如破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行結(jié)合制備Hib結(jié)合疫苗，獲得多糖蛋白結(jié)合物。多糖蛋白結(jié)合物溶液是一個(gè)十分復(fù)雜的混合物體系，結(jié)合物中殘留未結(jié)合的多糖和載體蛋白質(zhì)等。在對(duì)多糖蛋白結(jié)合物進(jìn)行純化的過程中，多采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液作為流動(dòng)相。但是，采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液作為流動(dòng)相，多糖蛋白結(jié)合物回收率低。而且多糖蛋白結(jié)合物的純化采用O. 2mol/L的氯化鈉溶液，不利于后續(xù)工序包括分裝后產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，用于提高多糖蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性。本發(fā)明另一目的是提供b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的劑型。本發(fā)明再一目的是提供疫苗在制備預(yù)防由b型流感嗜血桿菌感染導(dǎo)致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎、會(huì)厭炎感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，包括如下組分和含量b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風(fēng)類毒素40-100 μ g/ml;pH 7.2-7. 5。所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其制備方法包括以下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌多糖；2)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物混合液；3)純化以TRIS-HCl緩沖液作為流動(dòng)相，用層析法純化步驟2)中的混合液，得到b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液。其中，所述TRIS-HCl緩沖液，濃度為20-100mmol/L，pH值為7. 2-7. 5，優(yōu)選所述TRIS-HCl 緩沖液濃度為 20-50mmol/L。具體地，步驟如下I)發(fā)酵培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌采用b型流感嗜血桿菌生產(chǎn)用菌株，菌株復(fù)壯、培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵液通過甲醛殺菌后收獲培養(yǎng)物；2)制備b型流感嗜血桿菌多糖收集的培養(yǎng)物經(jīng)過離心去除菌體,加入沉淀劑沉淀上清液中的多糖，經(jīng)過研磨、乙醇沉淀去除核酸，并經(jīng)過冷酚溶液抽提去除雜蛋白，并通過超濾方法去除殘留小分子物質(zhì)，通過乙醇沉淀制備精制多糖；3)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物精制多糖經(jīng)過溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亞胺作用下與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合； 4)以TRIS-HCl緩沖液作為流動(dòng)相，用層析法純化制備b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液。本發(fā)明所述疫苗還包括賦形劑，所述賦形劑為TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉或TRIS-HCl緩沖液和乳糖。其中，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為8-12mmol/L、氯化鈉7. 5-9. 5mg/ml、乳糖20_30mg/ml。本發(fā)明還提供含有上述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制劑，包括液體劑和凍干制劑。本發(fā)明所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的液體劑的組分為b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物、TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉組成，其中，各組分的濃度為b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風(fēng)類毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 緩沖液8_12mmol/L ；氯化鈉7. 5-9. 5mg/ml。上述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗液體劑的制備方法，包括如下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗；2)半成品配制及分裝步驟I)中加入TRIS-HCl緩沖液，氯化鈉溶液稀釋，余量為注射用水，進(jìn)行分裝。本發(fā)明所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的凍干制劑的組分為b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物、TRIS-HCl緩沖液和乳糖，其中，各組分的濃度為b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 μ g/ml ；破傷風(fēng)類毒素40-100 μ g/ml ；TRIS-HCl 緩沖液8_12mmol/L ；乳糖20_30mg/ml。上述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的凍干劑型的制備方法，包括如下步驟I)制備b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗；2)半成品配制及分裝步驟I)中加入TRIS-HCl緩沖液，氯化鈉溶液稀釋，余量為注射用水，進(jìn)行分裝；
3)凍干-50'40 V預(yù)凍3_4h，然后在真空度5 15Pa下，溫度緩慢升溫至-20°C ±2°C，溫度維持5 7h，再階梯式升溫至30°C，溫度維持6 8h，凍干結(jié)束。所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗可預(yù)防由b型流感嗜血桿菌感染導(dǎo)致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎、會(huì)厭炎等感染性疾病。本發(fā)明有益效果在多糖蛋白結(jié)合物進(jìn)行純化的過程中采用緩沖液體系TRIS-HCl緩沖液體系，不僅能夠顯著地提高多糖蛋白結(jié)合物純化過程的回收率，而且可增加后續(xù)工序產(chǎn)品的穩(wěn)定性，維持產(chǎn)品的pH值在中性范圍內(nèi)，避免因?yàn)閜H值的變化導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量的潛在變化。 概念的闡釋多糖含量b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的抗原為b型流感嗜血桿菌的莢膜多糖，抗原含量以多糖的含量進(jìn)行表征，無論是在原液制備還是在半成品配制過程中。多糖蛋白結(jié)合物混合液指在進(jìn)行多糖與蛋白結(jié)合試驗(yàn)后尚未經(jīng)過柱層析進(jìn)行分離，包含有多糖與蛋白結(jié)合物大分子及未結(jié)合的多糖、蛋白小分子物質(zhì)。多糖回收率本專利中多糖回收率指的是在進(jìn)行多糖與蛋白結(jié)合后回收的符合《中華人民共和國(guó)藥典》三部(2010年版)“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”規(guī)程規(guī)定的原液質(zhì)量的Hib結(jié)合物原液中多糖質(zhì)量與多糖投料量的比值。高分子結(jié)合物多糖蛋白結(jié)合物的混合物已經(jīng)過柱層析純化收集的大分子物質(zhì)。高分子結(jié)合物含量是在經(jīng)過柱層析純化后收集的大分子物質(zhì)中，按照《中華人民共和國(guó)藥典》三部(2010年版)中高分子結(jié)合物含量測(cè)定方法測(cè)得的以百分?jǐn)?shù)表示的大分子含量。Kd < O. 2的回收率指采用排阻色譜進(jìn)行測(cè)定結(jié)合物分子的分配系數(shù)時(shí)，以Kd< O. 2峰面積與總峰面積的比值。效力試驗(yàn)用以表征Hib結(jié)合疫苗在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的水平。按照《中華人民共和國(guó)藥典》三部(2010年版)中效力試驗(yàn)方法檢測(cè).以高于陰性對(duì)照組小鼠血清的Cutoff值的百分比表示。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液的制備I)采用《中華人民共和國(guó)藥典》三部(2010年版)中“b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗”規(guī)程規(guī)定的菌種培養(yǎng)、發(fā)酵及精制多糖制備工藝步驟，制備b型流感嗜血桿菌精制多糖。采用b型流感嗜血桿菌生產(chǎn)用菌株(MH200201，北京民海生物科技有限公司自主分離)，菌株復(fù)壯、培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵液通過甲醛殺菌后收獲培養(yǎng)物；2)收集的培養(yǎng)物經(jīng)過離心去除菌體，加入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀上清液中的多糖，離心收集多糖，經(jīng)過研磨、乙醇沉淀去除核酸，并經(jīng)過冷酚溶液抽提去除雜蛋白，并通過超濾方法去除殘留小分子物質(zhì)，通過乙醇沉淀制備精制多糖；3)精制多糖經(jīng)過溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亞胺作用下與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，多糖與破傷風(fēng)類毒素的質(zhì)量比為1: 1，制得b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物混合液；參考楊耀、黃鎮(zhèn)等人發(fā)表的《b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的研制》(中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2002，Vol. 15, No. 3)；4)混合液分別用 O. 02mol/L 的 TRIS-HC1 緩沖液、pH7. 2-7. 5,0. 2mol/L 的氯化鈉溶液作為流動(dòng)相，按不高于層析柱體積10%的上樣量上樣，兩種介質(zhì)的上樣量相同。收集V。附近的洗脫液，除菌過濾。表I同一批結(jié)合物不同純化介質(zhì)的檢定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，包括如下組分和含量 b型流感嗜血桿菌多糖 20-30 u g/ml ； 破傷風(fēng)類毒素40-100 u g/ml ；pH 值 7. 2-7. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，其制備方法包括以下步驟 1)制備b型流感嗜血桿菌多糖； 2)制備b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物混合液； 3)純化以TRIS-HCl緩沖液作為流動(dòng)相，用層析法純化步驟2)中的混合液，得到b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液，濃度為 20-100mmol/L，pH 值為1. 2-7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為20_50mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，還包括賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其特征在于，所述賦形劑為TRIS-HCl緩沖液和氯化鈉； 或TRIS-HCl緩沖液和乳糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl緩沖液濃度為8_12mmol/L、氯化鈉濃度為 7. 5-9. 5mg/ml、乳糖濃度為 20-30mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其特征在于，所述結(jié)合疫苗進(jìn)一步制備得到百白破b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗在制備用于預(yù)防由b型流感嗜血桿菌感染導(dǎo)致的腦膜炎、肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、關(guān)節(jié)炎、會(huì)厭炎感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗及其應(yīng)用。所述b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗包括b型流感嗜血桿菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物，pH 7.2-7.5。本發(fā)明在b型流感嗜血桿菌多糖蛋白結(jié)合物進(jìn)行純化的過程中采用TRIS-HCl緩沖液體系，不僅能夠顯著地提高多糖蛋白結(jié)合物純化過程的回收率，而且可增加后續(xù)工序產(chǎn)品的穩(wěn)定性，維持產(chǎn)品的pH值在中性范圍內(nèi)，避免因?yàn)閜H值的變化導(dǎo)致產(chǎn)品的質(zhì)量的潛在變化。
文檔編號(hào)A61K39/102GK103007264SQ20121054627
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者孫曉東, 劉建凱 申請(qǐng)人:北京民海生物科技有限公司