專利名稱：一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)的生物材料技術(shù)，涉及一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
半月板位于膝關(guān)節(jié)股骨髁與脛骨平臺之間，其功能在于穩(wěn)定膝關(guān)節(jié)，傳遞膝關(guān)節(jié)負(fù)荷力，吸收振蕩，減少應(yīng)力，改善關(guān)節(jié)潤 滑，并有助于關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)。正是由于半月板起到了穩(wěn)定載荷作用，才保證了膝關(guān)節(jié)能夠長年負(fù)重運動而不致?lián)p傷。然而，由于膝半屈、重力擠壓、旋轉(zhuǎn)及剪切力量等原因，常造成半月板損傷，其發(fā)病率約占所有膝關(guān)節(jié)紊亂疾病的75%左右。半月板損傷后常引起股四頭肌萎縮，關(guān)節(jié)疼痛、彈力、絞鎖、活動受限，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)退變加速，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Arnoczky等依據(jù)半月板血液供應(yīng)情況，提出三區(qū)分類半月板外周的紅區(qū)，中央的白區(qū)，和兩者之間的紅白區(qū)。其中紅區(qū)及紅白區(qū)有血供，而白區(qū)僅靠關(guān)節(jié)腔滑液提供營養(yǎng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有的治療及修復(fù)技術(shù)，僅能對位于紅區(qū)的半月板進行修復(fù)，紅白區(qū)僅有部分愈合能力，而對白區(qū)完全沒有愈合能力。若不對撕裂部位尤其是白區(qū)(無血供區(qū))進行治療，會導(dǎo)致撕裂和損傷的擴大甚至半月板的退化、關(guān)節(jié)軟骨損傷。因此，如何有效修復(fù)半月板撕裂損傷，防止后期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，是諸多醫(yī)生及學(xué)者們一直在致力探尋的課題。目前，半月板損傷治療常用的外科手術(shù)，包括完全或者部分半月板切除術(shù)、撕裂后縫合術(shù)以及半月板置換術(shù)等。對于紅區(qū)及紅白區(qū)撕裂，臨床一般采用縫合法；而對于白區(qū)的損傷則采用切除術(shù)。這種手術(shù)能夠使患者迅速緩解痛苦，恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的功能。對半月板全部切除術(shù)后長期隨訪結(jié)果表明手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率明顯升高，少數(shù)病例出現(xiàn)韌帶松弛，而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，以至發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。為此，許多半月板支架或植入物被用來替代或者修復(fù)半月板切除術(shù)中被切除的組織。專利200780042802. 7,PCT/US2010/047852、US5984858、US4880429、US5735903、US5108438、US6042610、US5913900 等，提供了采用人工合成、自體、同種異體、異種材料等來替代全切除的半月板的支架及植入物的制備方法。這些材料能夠延緩膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，但半月板假體的柔軟性、蠕變性、相關(guān)的免疫排斥反應(yīng)及生理功能等，尚難達到人體半月板的要求，無法滿足臨床要求，尤其是對于白區(qū)損傷，一直缺乏有效的治療手段。發(fā)明專利200680031664. 8、US20090186062，提供了一種用于半月板撕裂的方法，包括一種膠原膜材料(ChondroGide)。該膠原膜材料由豬或牛的膠原膜制備而成，通過弓I導(dǎo)滑膜細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子等，從不同部位遷移修復(fù)半月板撕裂，達到修復(fù)撕裂組織的目的。這些技術(shù)經(jīng)組織學(xué)證實雖然有滑膜細(xì)胞的遷入，但未發(fā)現(xiàn)這種膠原膜在半月板紅區(qū)、紅白區(qū)及白區(qū)撕裂修復(fù)中具有明顯效果，其應(yīng)用于半月板撕裂具有一定的局限性。發(fā)明專利200580013082. 2公開了一種用于無血管半月板修復(fù)和再生的支架，該發(fā)明僅僅提供了一種用于血液及其成分、細(xì)胞、藥物從組織血管區(qū)到無血區(qū)的通道，其本身并不具有生物活性，材料本身在撕裂修復(fù)中，同時也增加了半月板本身的組成成分；此外，支架材料的降解會產(chǎn)生不同于機體的微環(huán)境，不利于半月板組織的重建。研究發(fā)現(xiàn)，理想的半月板損傷修復(fù)材料，應(yīng)具有良好的生物活性，能夠產(chǎn)生生物活性因子及基質(zhì)成分；細(xì)胞參與半月板重建過程中，能夠與周圍正常半月板組織形成胞間聯(lián)系；能夠在撕裂部位自我穩(wěn)定，并通過關(guān)節(jié)腔滑液進行營養(yǎng)吸收，可通過誘導(dǎo)其間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，加快半月板愈合及白區(qū)的修復(fù)。由于軟骨細(xì)胞可直接在關(guān)節(jié)鏡下從自體獲取，并且移植后不引起免疫排斥反應(yīng)，因而成為目前組織工程研究中應(yīng)用廣泛的一種細(xì)胞來源。由動物來源組織(皮膚、跟腱、鼠尾等)提取的膠原具有降解速度快，細(xì)胞黏附性好的特點，是一種天然的生物材料，最適合于半月板組織工程學(xué)重建。該類型膠原經(jīng)過重構(gòu)、交聯(lián)以及酶切處理后，不僅不會改變其天然的三螺旋結(jié)構(gòu)，而且可以降低其抗原性，并能增強其對抗膠原酶消化的能力。而具有天然來源的脫細(xì)胞基質(zhì)膜材料，能夠保持其特有的生物活性成分及活性因子，在降解過程中，可釋放促進機體組織再生及功能重建的細(xì)胞因子，提高損傷組織的愈合能力。

發(fā)明內(nèi)容
針對修復(fù)半月板撕裂損傷臨床治療的現(xiàn)狀及存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種組織工程半月板撕裂修復(fù)的新生物材料及其制備方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一.本發(fā)明修復(fù)半月板撕裂的生物材料，由多層結(jié)構(gòu)組成，S卩，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層多孔膠原結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜，其在該材料中起“支架”作用，同時保留細(xì)胞基質(zhì)的活性成分，含有特殊的蛋白分子(如纖維粘連素、層粘連素、膠原、EGF、bFGF等)，可促進損傷愈合及細(xì)胞增殖、表型維持。外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片，可使細(xì)胞在移植后存活時間更長并具有半月板組織結(jié)構(gòu)功能特點。軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層，可通過細(xì)胞間及細(xì)胞與周圍半月板基質(zhì)間建立聯(lián)系；軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞膜片，方便臨床治療半月板撕裂過程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合。中間層的多孔膠原結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜，提供了細(xì)胞遷入及細(xì)胞因子復(fù)合的空間，有利于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，發(fā)揮在半月板損傷修復(fù)中軟骨細(xì)胞及周圍環(huán)境中干細(xì)胞的生物活性作用，促進損傷組織再生及功能重建。該生物材料，以內(nèi)層為“支架”，通過注模、流延或刮板等，與中間層的多孔膠原涂層復(fù)合，構(gòu)建具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜。通過細(xì)胞雙面接種以及旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，構(gòu)建具有誘導(dǎo)細(xì)胞遷入，實現(xiàn)半月板撕裂重建。由于具有附合雙層多孔結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞基質(zhì)膜，以及細(xì)胞因子和具有半月板組織特征的軟骨細(xì)胞膜片，可促進半月板撕裂部位尤其是白區(qū)的組織愈合及其組織再生。二.本發(fā)明之修復(fù)半月板撕裂生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜可選用動物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜等，如，脫細(xì)胞小腸粘膜下層、脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞腹膜等。此脫細(xì)胞基質(zhì)膜采用現(xiàn)有工藝方法即可制備。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜的制備配置濃度為3 15mg/mL、pH值為3 6的膠原溶液在脫細(xì)胞基質(zhì)膜致密面，通過注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，使其孔徑大小可控制在50 600 u m之間，更優(yōu)在200 400 y m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜。所述的膠原溶液，是用牛跟腱、皮膚、鼠尾等動物源性材料制備而成的。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片的制備細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液浸潤步驟二制備的膠原基質(zhì)膜后，按
IX IO4 2 X IoVcm2密度接種軟骨細(xì)胞于膠原涂層多孔表面，靜置0. 5 4小時，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2 4mL，液面下培養(yǎng)2 4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2 7天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L_谷氨酰胺10 500 y g/mL、維生素c(Vc)為50 100 ii g/mL、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-0 :)為5pg/mL 20ng/mL、堿性成纖維生長因子-2 (bFGF-2)為5 50ng/mL，血小板源性生長因子(PDGF-bb)為I 10ng/mL、胰島素樣生長因子(IGF-1) I 50ng/mL。所述的軟骨細(xì)胞，可選擇軟骨細(xì)胞或可向軟骨細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。該間充質(zhì)干細(xì)胞可為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、臍帶、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞等的任何一種。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原基質(zhì)膜加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，該旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速10 25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；每2 3天換液一次，培養(yǎng)5 10天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 15天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 10 300 u g/mL,Vc 為 75 150 u g/mL,TGF- ^為 Ing 20ng/mL、bFGF-2 為 I 50ng/mL,血小板源性 roGF-bb 為 5pg 5ng/mL。前面步驟二所述制備多孔結(jié)構(gòu)膠原涂層的方法是對復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，或者二者結(jié)合的方式；物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)(4 15小時)或者重度脫水交聯(lián)(如乙醇、丙酮、異丙醇);化學(xué)交聯(lián)一采用異氰酸鹽類(HDI)、?；B氮類(DPPA)、醌類(NDGA)、碳化二亞胺(EDC)、環(huán)氧化合物(EC)及其低聚物、聚乙二醇等化學(xué)交聯(lián)劑，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料，由脫細(xì)胞基質(zhì)膜、具有細(xì)胞因子及軟骨細(xì)胞復(fù)合的多孔結(jié)構(gòu)膠原基質(zhì)膜以及表層軟骨細(xì)胞膜片構(gòu)成內(nèi)層為含有生物活性蛋白并能夠保存細(xì)胞基質(zhì)成分的脫細(xì)胞基質(zhì)膜；中間層為脫細(xì)胞基質(zhì)膜致密面復(fù)合膠原并交聯(lián)，形成具有一定孔隙率及孔徑的特異性多孔支架結(jié)構(gòu)，復(fù)合具有誘導(dǎo)關(guān)節(jié)腔間充質(zhì)細(xì)胞定向遷入并促進細(xì)胞基質(zhì)分泌的細(xì)胞因子，并接種軟骨細(xì)胞，形成細(xì)胞、因子、膠原復(fù)層結(jié)構(gòu)；采用細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，在材料雙面結(jié)構(gòu)外層誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞及其分泌基質(zhì)構(gòu)建的膜片，細(xì)胞密度更大，存活能力更強，組織結(jié)構(gòu)更好的生物材料，從而誘導(dǎo)該復(fù)合材料在半月板撕裂損傷修復(fù)過程中，實現(xiàn)損傷組織(特別是無血供區(qū)的組織)再生及功能重建。本發(fā)明之組織工程材料，為組織工程技術(shù)在半月板損傷功能重建中的應(yīng)用提供了新的方向。該發(fā)明的特點如下(I)采用脫細(xì)胞基質(zhì)膜作為該產(chǎn)品的“支架”，提供了膠原材料及細(xì)胞接種的材料。脫細(xì)胞基質(zhì)膜，其保留了細(xì)胞基質(zhì)活性成分，含有特殊的蛋白分子如纖維粘連素、層粘連素、膠原、EGF、bFGF等，可促進損傷愈合及細(xì)胞增殖、表型維持的重要影響因素，其良好的韌性，能夠方便臨床操作。(2)通過預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝等技術(shù)制備出具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜，提供了細(xì)胞遷入及細(xì)胞因子復(fù)合的空間，有利于誘導(dǎo)關(guān)節(jié)腔間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入，發(fā)揮在半月板損傷修復(fù)中細(xì)胞的生物活性作用。(3)雙層軟骨細(xì)胞的接種培養(yǎng)，方便臨床治療半月板撕裂過程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合。同時，提高采用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，促進了細(xì)胞因子在材料中的復(fù)合及細(xì)胞在支架材料中的增殖速率及其基質(zhì)分泌能力，細(xì)胞膜片在材料表面的形成，可明顯促進細(xì)胞間隙連接及組織形成，提高撕裂組織間建立聯(lián)系的能力，縮短重建時間，適用于半月板撕裂損傷特別是白區(qū)及紅白區(qū)損傷的治療和修復(fù)。


圖I、采用外科手術(shù)制備的兔半月板白區(qū)撕裂動物模型；圖2、本發(fā)明實施例制備之修復(fù)半月板撕裂用生物材料示意圖；圖3、本發(fā)明實施例制備之生物材料的有效性示意圖。圖中，I為半月板紅區(qū)；2為半月板撕裂區(qū)域；3為半月板白區(qū)；4為正常半月板組織；5為再生半月板組織；6為正常半月板組織；7為軟骨細(xì)胞；8為正常半月板組織與新生半月板融合部位(膠原纖維連接);9為新生半月板組織。
具體實施例方式實例I、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法本實施例之半月板撕裂的生物材料，由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟進行步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備脫細(xì)胞人羊膜基質(zhì)的制備方法可參考文獻宋永周，崔慧先，王振顯，等.羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其生物相容性[J].中國組織工程研究與、臨床康復(fù)，2008，12 (Ol) :51 55。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備無菌操作下取胎膜，鈍性分離去除絨毛膜組織，保留羊膜層。生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后置于l%TritonX-100溶液中，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩24小時，PBS漂洗后于0. 25%胰蛋白酶+0. 02%EDTA中37°C振蕩4小時，PBS充分漂洗，純水漂洗，冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。取部分制備好的羊膜進行小時E染色檢測。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為8mg/mL、pH值為3的膠原溶液所述的膠原溶液，用牛跟腱制備而成；將復(fù)水的脫細(xì)胞基質(zhì)材料(致密面向上)平整地平鋪固定于大小合適的醫(yī)用不銹鋼模具上，蓋上上蓋，脫細(xì)胞基質(zhì)材料與上蓋間有一定的空隙，形成可注入膠原溶液的毫米級薄層空腔，用注射器向空腔中注入上述膠原溶液，待膠原溶液充滿空腔后，將模具迅速放入可抽真空的容器中，抽真空脫氣。脫氣完全后，取出模具至于-80°C環(huán)境下，預(yù)冷3小時，卸去模具上蓋。然后用真空冷凍干燥機于_22°C條件下凍干24小時，再升溫至_2°C凍干16小時，最后升溫至20°C凍干10小時至材料完全干燥，控制使其孔徑300 600 ii m之間。該材料致密面多孔結(jié)構(gòu)成型,結(jié)合脫細(xì)胞基質(zhì)材料自身所具有的疏松面結(jié)構(gòu)，雙面多孔結(jié)構(gòu)得以實現(xiàn)。為了增加材料的強度及降解時間，該步驟對復(fù)合后材料采用化學(xué)交聯(lián)的方法以EDC為交聯(lián)劑，40%的酒精/NHS溶液為媒介，4°C條件下交聯(lián)處理24小時。然后用PBS緩沖液、生理鹽水、純水逐次清洗后，材料再次預(yù)凍，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種制備按2X IOVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置4小時，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液3mL，液面下培養(yǎng)2天，待細(xì)胞在多孔膠原膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)3天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L_谷氨酰胺10 u g/mL、維Vc為50 y g/ml,、TGF- |3 j 為 5pg/mL、bFGF-2 為 5ng/mL、roGF-bb 為 Ing/mL、IGF-I 為 Ing/mL。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；每2天換液一次，培養(yǎng)7天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL、Vc 為 75 y g/mL, TGF-為 5ng/mL、bFGF_2為 10ng/mL, PDGF-bb 為 5pg/mL。該材料完成制備后植入兔關(guān)節(jié)半月板撕裂模型，縫合創(chuàng)口。12周取材標(biāo)本結(jié)果顯 示損傷缺損部位有較多類半月板組織形成，撕裂區(qū)域組織出現(xiàn)融合封閉，色澤與周圍正常的半月板組織相似。動物生理活動正常。實例2、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法
本實施例之生物材料，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用脫細(xì)胞豬小腸黏膜下層，其制備方法參考上述實施例I。步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為3mg/mL、pH值為6的膠原溶液所述的膠原溶液，用牛皮制備而成；在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，使其孔徑大小控制在200 400 y m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜；該步驟對復(fù)合后材料采用物理+化學(xué)交聯(lián)的方法，即紫外交聯(lián)4小時后采用異氰 酸鹽類化學(xué)交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層制備按IXlOVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置4小時，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2mL，液面下培養(yǎng)4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)7天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺IOOii g/mL、Vc為50 y g/mL.TGF-^ !為 Ing/mL、bFGF-2 為 50ng/mL、PDGF-bb 為 Ing/mL、IGF-I 為 Ing/mL。步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；每2天換液一次，培養(yǎng)7天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)15天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL,Vc 為 50 y g/mL,TGF- ^ :為 10ng/mL、bFGF_2為 25ng/mL, PDGF-bb 為 Ing/mL。完成材料制備后，采用手術(shù)法植入制備的兔半月板紅白區(qū)(低血供區(qū))撕裂部位。縫合創(chuàng)口后12周取材觀察修復(fù)效果。手術(shù)后動物無死亡發(fā)生，3-4周兔步態(tài)恢復(fù)正常。12周時動物生理活動正常，行動自如。取材標(biāo)本顯示，在半月板撕裂部位有新生組織形成，其質(zhì)地、色澤與周圍正常半月板組織相似，可見缺損處愈合良好；損傷部位相對應(yīng)的股骨及脛骨關(guān)節(jié)面光滑，該材料實現(xiàn)了半月板撕裂的組織再生及功能重建。實例3、一種修復(fù)兔半月板撕裂的生物材料及其制備方法本實施例之生物材料，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。中間層與內(nèi)層之間，通過注模、流延或刮板復(fù)合，中間層與外層之間，通過軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜復(fù)合。該修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，依下述步驟完成步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用人源性的脫細(xì)胞羊膜；制備方法同實施例I ;步驟二 具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜制備配置濃度為15mg/mL、pH值為3的膠原溶液，此膠原溶液，用鼠尾制備而成；在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，其孔徑大小可控制在50 300 ii m之間，制備并獲得具有附合多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜；該步驟對復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)8小時，采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。
步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片制備分離培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞，獲取5代以內(nèi)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，備用。細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種制備按I X IOfVcm2密度接種于復(fù)合膠原涂層多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜表面，靜置0. 5小時，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液3mL，液面下培養(yǎng)2天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2天。后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺IOOii g/mL、Vc為75ii g/mL、TGF- ^ !為 Ing/mL、bF0000000000000GF-2 為 50ng/mL，PDGF-bb 為 10ng/mL、IGF-I 為50ng/mLo步驟四、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)將接種軟骨細(xì)胞的膠原材料加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液；開始旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；每3天換液一次，培養(yǎng)5天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5天，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備。所述維持培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸 10ml/L、L-谷氨酰胺 100 u g/mL,Vc 為 75 y g/mL,TGF- ^ :為 10ng/mL、bFGF_2為 Ing/mL, PDGF-bb 為 5ng/mL。本實施例選用的軟骨細(xì)胞，為可向軟骨細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其誘導(dǎo)培養(yǎng)方法可參考Hyun Jung Yoo et al. Gene Expression Profile during Chondrogenesisin Human Bone Marrow der ived Mesenchymal Stem Cells us ing a cDNA Microarray.J Korean Med Sci. 2011;26(7) :851-858.。完成材料制備后，采用手術(shù)法植入制備的兔半月板白區(qū)(無血供區(qū))撕裂部位。在觀察期內(nèi)，新西蘭大白兔未出現(xiàn)術(shù)后感染，術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)無紅腫。術(shù)后2周步態(tài)基本恢復(fù)正常。實驗組6周可見缺損處愈合良好，為白色新生組織所替代，質(zhì)地較堅硬，相應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑；12周可見缺損處已被半月板樣組織所替代，質(zhì)地、彈性和光澤度與周圍正常半月板幾乎無明顯差別，對應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑，無明顯的摩擦征象。圖I為驗證本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料的有效性，采用外科手術(shù)制備的兔半月板白區(qū)撕裂動物模型。圖中I為半月板紅區(qū)；2為半月板撕裂區(qū)域；3為半月板白區(qū)。在進行動物有效性驗證實驗中，將用本發(fā)明制備的修復(fù)半月板撕裂用生物材料，植入半月板撕裂區(qū)。圖2為采用本發(fā)明方法制備的修復(fù)半月板撕裂用生物材料，植入兔半月板撕裂區(qū)域后12周取材結(jié)果。圖中4為正常半月板組織；5為再生半月板組織。大體照結(jié)果顯示在兔半月板撕裂損傷部位有新生組織形成，撕裂縫隙基本消失，兩側(cè)半月板組織融合，表面平整度良好。該結(jié)果顯示采用本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料具有良好的組織損傷再生及功能恢復(fù)能力，可實現(xiàn)半月 板撕裂的再生修復(fù)；圖3為采用本發(fā)明方法制備的生物材料有效性驗證12周取材組織學(xué)檢測圖片，圖中6為正常半月板組織；7為軟骨細(xì)胞；8為正常半月板組織與新生半月板融合部位(膠原纖維連接);9為新生半月板組織?？梢钥闯?，實驗組撕裂部位有較多類似半月板組織形成，膠原纖維排列不規(guī)則，可見大量軟骨細(xì)胞，愈合組織與正常組織之間以膠原纖維相連，新生組織與正常組織融合，色澤與周圍正常半月板組織相似但有分界。該組織學(xué)檢測結(jié)果表明采用本發(fā)明制備的用于修復(fù)半月板撕裂的生物材料能夠在體內(nèi)環(huán)境下，對半月板撕裂損傷進行有效的修復(fù)及組織再生。下面是采用本發(fā)明之修復(fù)半月板撕裂的生物材料進行動物有效性試驗的簡況選取約2. 5-3kg重新西蘭白兔，麻醉后雙側(cè)膝關(guān)節(jié)部位剪毛，活動兔膝關(guān)節(jié)捫及兔膝關(guān)節(jié)后方股骨與與脛骨成角的頂點，據(jù)此捫及關(guān)節(jié)間歇，在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)緣沿關(guān)節(jié)間歇向前約3mm標(biāo)記進針位置。常規(guī)消毒鋪巾，用小針刀垂直刺入關(guān)節(jié)間隙皮膚上的標(biāo)記點，刺入深度約4mm，刺入過程中初入時有比較韌的阻力感，隨后阻力感降低消失。針刀刃在與半月板長軸垂直的方向上下劃動切割外側(cè)半月板體部，刀刃上下劃動抵至脛骨與股骨骨質(zhì)完全橫斷白區(qū)半月板。植入所制備的兔半月板撕裂修復(fù)生物材料，縫合，另一只兔膝半月板造白區(qū)撕裂，縫合后為空白對照；手術(shù)后動物不作固定，籠中飼養(yǎng)自由活動。12周后取材進行大體觀察移植半月板撕裂部位有新生組織生成，裂口被線狀白色纖維瘢痕完全連接愈合，局部微凹陷，有光澤其顏色、質(zhì)地、平整度均與自體半月板組織趨于一致，與周圍正常半月板幾乎無明顯差別，對應(yīng)股骨和脛骨關(guān)節(jié)面光滑，無明顯的摩擦征象。
權(quán)利要求
1.一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料，其特征在于由多層結(jié)構(gòu)組成，即，依次由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成；中間層與內(nèi)層通過注模、流延或刮板工藝方法復(fù)合，外層通過軟骨細(xì)胞接種膠原基質(zhì)膜制備復(fù)合結(jié)構(gòu)，完成生物材料制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于，依下述步驟完成 步驟一、脫細(xì)胞基質(zhì)膜的制備該脫細(xì)胞基質(zhì)膜選用動物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜，以傳統(tǒng)工藝制備而成； 步驟二、具有多孔結(jié)構(gòu)的膠原基質(zhì)膜的制備配置濃度為3 15mg/mL、pH值為3 6的膠原溶液，在脫細(xì)胞基質(zhì)材料致密面通過注模、流延或刮板制備多孔膠原涂層；通過預(yù)凍溫度設(shè)定、冷凍速度和凍干工藝來調(diào)節(jié)膠原層孔徑大小，控制其孔徑大小在50 600 y m之間； 步驟三、軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片的制備 細(xì)胞層軟骨細(xì)胞接種用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液浸潤步驟二制備的膠原基質(zhì)膜后，按I X IO4 2 X IOVcm2密度接種軟骨細(xì)胞于膠原涂層多孔表面，靜置0. 5 4小時，加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液2 4mL，液面下培養(yǎng)2 4天，待細(xì)胞在多孔膠原基質(zhì)膜內(nèi)膠原纖維束貼附后，去除培養(yǎng)基；隨后，將接種軟骨細(xì)胞的膠原基質(zhì)膜加入旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，該旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，完成半月板損傷修復(fù)材料的制備 細(xì)胞膜片制備待完成細(xì)胞層接種后，翻轉(zhuǎn)膠原基質(zhì)膜，置于細(xì)胞培養(yǎng)用孔板。采用同樣方法將軟骨細(xì)胞接種脫細(xì)胞基質(zhì)材料疏松面表層，液面下培養(yǎng)2 7天；后期旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)參照步驟四完成制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟I所述的動物源性脫細(xì)胞基質(zhì)膜或人源性的脫細(xì)胞羊膜，是脫細(xì)胞小腸粘膜下層、脫細(xì)胞心包膜、脫細(xì)胞腹膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述調(diào)節(jié)膠原層孔徑，控制孔徑大小更優(yōu)在200 400 y m之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述的膠原溶液，是用牛跟腱、皮膚、鼠尾的動物源性材料制備而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟二所述制備多孔膠原涂層的方法是對復(fù)合后材料采用物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，或者二者結(jié)合的方式； 所述物理交聯(lián)一采用紫外光照射交聯(lián)(4 15小時)或者重度脫水交聯(lián)(如乙醇、丙酮、異丙醇); 所述化學(xué)交聯(lián)一采用異氰酸鹽類(HDI)、酰基疊氮類(DPPA)、醌類(NDGA)、碳化二亞胺(EDC)、環(huán)氧化合物(EC)及其低聚物、聚乙二醇等化學(xué)交聯(lián)劑，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交聯(lián)劑；交聯(lián)材料采用PBS緩沖液、生理鹽水、純水清洗后，凍干，環(huán)氧乙烷滅菌后備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉lmmol/L、L-谷氨酰胺10-500 y g/mL、維生素c (Vc)為50 100 V- g/mL、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF- P J為5pg/mL 20ng/mL、堿性成纖維生長因子-2(bFGF-2)為5 50ng/mL,血小板源性生長因子(PDGF-bb)為I 10ng/mL、胰島素樣生長因子(IGF-I) I 50ng/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述的軟骨細(xì)胞，是軟骨細(xì)胞或可向軟骨細(xì)胞分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，其旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速為10-25轉(zhuǎn)/分；每2天排空在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的氣泡；每2-3天換液一次，培養(yǎng)5 10天后，更換維持培養(yǎng)液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 15天； 步驟三所述旋轉(zhuǎn)細(xì)胞維持培養(yǎng)液為軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液，其組成為在商用低糖型DMEM培養(yǎng)液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、L-谷氨酰胺10 300 u g/mL、Vc為75 150 u g/mL、TGF-^ 為 Ing 20ng/mL、bFGF-2 為 I 50ng/mL，血小板源性 PDGF-bb為 5pg 5ng/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述修復(fù)半月板撕裂的生物材料的制備方法，其特征在于步驟三所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、臍帶、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞的任何一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種修復(fù)半月板撕裂的生物材料及其制備方法。該材料由內(nèi)層的脫細(xì)胞基質(zhì)膜、中間層的多孔結(jié)構(gòu)膠原基質(zhì)膜、外層的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞層及細(xì)胞膜片構(gòu)成。該修復(fù)材料，具有一定的彈性、韌性和良好的生物活性，軟骨細(xì)胞可以自行分泌細(xì)胞因子，并可通過關(guān)節(jié)腔滑液直接獲得營養(yǎng)成分，加快半月板撕裂過程中與撕裂兩端組織細(xì)胞間通訊連接的建立，促進材料中細(xì)胞與自體組織細(xì)胞遷入融合，縮短組織再生及功能重建時間，為臨床修復(fù)半月板撕裂(包括血供區(qū))損傷中特別是無血區(qū)及低血區(qū)的組織再生及功能重建提供了一種理想的新材料和材料的制備方法。
文檔編號A61L27/24GK102716515SQ20121022472
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者田智泉 申請人:陜西博鴻生物科技有限公司