專利名稱：應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠及其制備方法
應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用于血管吻合術(shù)的粘合劑及其制備方法，具體涉及一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的水凝膠及其制備方法。背景技術(shù)：
近年來，隨著血管擴張性疾病和血管閉塞性疾病以及血管損傷等發(fā)病率的逐漸增加，對血管移植、血管縫合與修補的技術(shù)提出了更高的要求。小血管及微血管的吻合技術(shù)， 直接關(guān)系到血管遠端的組織器官能否存活，在血管外科及顯微外科等領(lǐng)域占有重要地位。 隨著顯微外科的不斷發(fā)展，對血管吻合技術(shù)的要求在不斷提高，不僅要有良好的即時通暢率，還要有更好的遠期通暢率和抗?fàn)坷瓘埩Φ?。目前臨床上常用的血管吻合方法有縫合法、套接法、黏合法、激光焊接法、光化學(xué)組織黏合法等，這些方法各有利弊，但從臨床應(yīng)用的經(jīng)濟性和實用性角度來看，應(yīng)用醫(yī)用黏合劑的黏合法最具應(yīng)用前景。
目前臨床上常用于血管黏合的醫(yī)用黏合劑主要有兩種纖維蛋白膠和氰基丙烯酸酯。目前醫(yī)用黏合劑的安全性已得到了歐盟、北美發(fā)達國家的認可，并在臨床中應(yīng)用。
理想的顯微血管吻合術(shù)應(yīng)該具備以下性質(zhì)安全、可靠、無毒 性；具有良好的生物相容性，不妨礙人體組織的自身愈合；在常溫下可以實現(xiàn)快速黏合；具有良好的黏合強度及持久性；對人體組織無刺激性；在有血液和組織液的條件下可以使用等。
應(yīng)用醫(yī)用黏合劑的黏合法可以滿足理想的顯微血管吻合術(shù)的大部分要求，但是由于顯微血管吻合口要嚴格對齊才能保證黏合劑不阻塞血管，因此黏合法操作要求較高。大多數(shù)臨床醫(yī)師在實驗研究和臨床應(yīng)用中通常聯(lián)合支架管、縫合法使用，這樣做大大增加了顯微血管吻合術(shù)操作復(fù)雜性。
2011 年 8 月的 Nature Medicine 期刊中一篇論文(Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels)提出應(yīng)用泊洛沙姆 407 凝膠結(jié)合醫(yī)用黏合劑使用，解決顯微血管吻合術(shù)黏合法的瓶頸。利用泊洛沙姆407的膠凝特點，替代支架管，實現(xiàn)快捷的顯微血管吻合口對接。該方法部分解決了應(yīng)用醫(yī)用黏合劑的黏合法的瓶頸，但論文中提到，單用泊洛沙姆407還不能實現(xiàn)顯微血管吻合術(shù)，必須合用白蛋白來提高其膠凝點溫度。異種白蛋白是人體異抗原，容易引起排斥反應(yīng)，而人源白蛋白成本較高，并且白蛋白在實行血管吻合術(shù)黏合法必需的加熱過程中易變性沉淀，增加再通后的血管栓塞風(fēng)險，因此該技術(shù)還存在不足。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有顯微血管吻合術(shù)中黏合法的不足之處，提供一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠及其制備方法，其聯(lián)合黏合法應(yīng)用，提高血管吻合質(zhì)量及速度，實現(xiàn)安全快捷的無創(chuàng)吻合。
泊洛沙姆(poloxamer),商品名為pluronic,是白色或微黃色半透明臘狀固體,具有高溫下膠凝的特點，但是單用泊洛沙姆還不能實現(xiàn)顯微血管吻合術(shù)。發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗，合成了接枝有肝素的泊洛沙姆新材料，該材料比泊洛沙姆有更高的膠凝的溫度，在 37°C以下呈液態(tài)，在40°C凝固成凝膠。以接枝有肝素的泊洛沙姆新材料為基礎(chǔ)，經(jīng)過反復(fù)實驗，發(fā)明人制備了一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠，解決了現(xiàn)有顯微血管吻合術(shù)中黏合法的不足之處，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。
一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的水凝膠，該水凝膠含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，該水凝膠中所述肝素-泊洛沙姆復(fù)合物濃度為10% (ff/V)-40% (W/V)。
上述的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物具有以下通式或基于以下通式的結(jié)構(gòu)組合
Y-X-Y 或 Y-g-X-g-Y 或 X-Y 或 x-g-γ 或 Y-X-g-X-Y
其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。
上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩0-氫-(0羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)。嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO (CH2CH2O) a (OCHCH3CH2)b (CH2CH2O)。，在共聚物中a和c為2 150，b為15 67。
上述的水凝膠中還含有O.1 % (ff/V) -5% (W/V)有機弱酸和/或氨基酸。
上述的有機弱酸包括檸檬酸、酒石酸、富馬酸、硼酸、醋酸。
上述的水凝膠中肝素-泊洛沙姆復(fù)合物濃度為15% (W/V) -30% (W/V)。
上述的水凝膠在37°C以下呈流動的高分子膠液狀，在37. 5°C _45°C之間凝固成固態(tài)凝膠。
上述的應(yīng)用于血管吻合術(shù)的水凝膠的制備方法，將肝素-泊洛沙姆復(fù)合物分散于注射用水中，肝素-泊洛沙姆復(fù)合物與注射·用水的物質(zhì)的量比為1: 2. 5-10，完全溶解形成水凝膠。
形成水凝膠前，在加入所述泊洛沙姆的同時還加入濃度為O.1 % (ff/V) -2 % (W/V) 的氨基酸、有機弱酸、抗凝劑、促血管生長的細胞因子中的一種或幾種。
上述水凝膠灌裝于無菌注射器或者安瓿中，密封。
上述水凝膠也可冷凍干燥成凍干粉，灌裝于無菌西林瓶中，密封。臨用時加入IOml 注射用水，輕微振搖，形成水凝膠。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有顯微血管吻合術(shù)中黏合法的不足，具有以下優(yōu)點(I)利用含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用，避免了其他吻合方法所造成的吻合口狹窄問題，并替代可溶性血管內(nèi)支架，使血管吻合的質(zhì)量大大提高。(2)利用含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用，替代縫合法吻合，增加了吻合口的密閉性能，不存在滲漏現(xiàn)象。(3)利用含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠，避免使用成本較高的人源白蛋白或高度純化的異種白蛋白，無排斥反應(yīng)風(fēng)險，性價比高。(4)含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠，因保持了肝素的抗凝血作用，因此降低了顯微血管吻合術(shù)過程血管栓塞的風(fēng)險，并保證血管再通后不會引起栓塞，保持吻合部的的血流暢通。
具體實施方式
以下從具體實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例一、Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠的制備
肝素-泊洛沙姆復(fù)合物復(fù)合物有多種結(jié)構(gòu)組合，本實施例選用泊洛沙姆407和低分子肝素鈉為原料，先合成Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，然后制備肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠。
Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的合成稱取泊洛沙姆407(相對分子量M = 12000,其中a = c = 101, b = 56) 12g,于一圓底燒瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的 4-二甲基氨基吡啶及O. 55ml三乙胺，并溶解于200ml 二氧六環(huán)中，攪拌反應(yīng)過夜，得末端為羧基的泊洛沙姆，以其為反應(yīng)物，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，加入IOg的低分子肝素鈉，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，所得產(chǎn)物通過冷凍干燥得到固體粉末，即為Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物。
Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠A的制備稱取Ig上述合成的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，輻射滅菌后分散于5ml注射用水中，加入O. 025g檸檬酸，15-20°C水浴中完全溶解，溶液灌裝于一次性無菌注射器中，密封。
Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠B的制備稱取O. 5g上述合成的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，輻射滅菌后分散于5ml注射用水中，加入O. 25富馬酸，15-20°C水浴中完全溶解，溶液灌裝于一次性無菌注射器中，密封。
實施例二、Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠的制備
本實施例選用泊洛沙姆188和依諾肝素為原料，先合成Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，然后制備肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠。
Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的合成泊洛沙姆188 (M = 8350，a = C = 80, b = 27) 2mmol與3ml己內(nèi)酯在Sn-Oct為催化劑、Ar氣保護下真空狀態(tài)進行聚合,攪拌24h 后停止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物以IOml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復(fù)兩次以純化所得產(chǎn)物。將產(chǎn)物在4mmol 丁二酐(SA)、2mmol 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、O. 55ml三乙胺(TEA)，30ml 二氧六環(huán)為溶劑下攪拌反應(yīng)24小時，以IOml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復(fù)兩次以純化所得產(chǎn)物。利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺 (EDC)/N-羥基于二酰亞胺( NHS)方法，所得產(chǎn)物與依諾肝素反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，最后透析袋內(nèi)溶液通過冷凍干燥得到固體粉末，即依諾肝素-聚己內(nèi)酯-泊洛沙姆-聚己內(nèi)酯-依諾肝素。
Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠的制備稱取O. 75g上述合成的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，輻射滅菌后分散于5ml注射用水中，加入O. 15g甘氨酸，15-20°C水浴中完全溶解，冷凍干燥成凍干粉，灌裝于無菌西林瓶中，密封。臨用時加入5ml注射用水，輕微振搖，形成Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠。
實施例三、X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠的制備
本實施例選用泊洛沙姆338和替地肝素為原料，合成X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，然后制備肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠。
X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的合成泊洛沙姆338(M = 15000, a = c = 141, b = 44) 15g，在IOOml 二氯甲烷為溶劑，O. 6ml三乙胺做催化劑作用下與2mmol的CKi1-O-^ j)~N02室溫下反應(yīng)4h，然后，加入2. 5mmol乙二胺，繼續(xù)反應(yīng)12h，反應(yīng)的產(chǎn)物為末端氨基，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS) 方法，將其與IOg依諾肝素的羧基反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，冷凍干燥，即得形成新材料為替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆。
X-g-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠的制備稱取1. 5g上述合成的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，輻射滅菌后分散于5ml注射用水中，加入O. 005g精氨酸，15-20°C水浴中完全溶解，溶液灌裝于一次性無菌安瓿中，密封。
實施例四、體外抗凝血實驗
本實施例以上述三個實施例得到的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠為對象，利用復(fù)鈣化時間試驗觀察肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠體外抗凝血能力。
復(fù)鈣化時間試驗上述三個實施例得到的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠各取 O. 2mL，分別加入同樣規(guī)格的試管內(nèi)，再分別加入O. 2mL血漿、O. 025mol/L CaCl2溶液O. 2mL, 于37°C恒溫，記錄當(dāng)試管內(nèi)出現(xiàn)第一條絲纖狀物的時間。以同劑量的低分子肝素鈉、生理鹽水分別為陽性對照和空白對照組。
實驗結(jié)果對照組生理鹽水的復(fù)鈣化時間為128s，實施例1-3得到的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠復(fù)鈣時間比空白對照組生理鹽水的復(fù)鈣化時間均超過250s，統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性，說明肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠具有較好的抗凝血效果。
實施例五、體外膠凝溫度測定
本實施例以實施例一得到的Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠A為對象，測定膠凝溫度。
取5ml Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠A在4°C下放置過夜，進行隨溫度變化黏度值的測定，每個濃度的溶液測定三次，求其平均值。以5ml O. 20g/ml的泊洛沙姆 407作為對照組。
實驗結(jié)果表明，Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠A的膠凝溫度為39°C，而泊洛沙姆407的膠凝溫度為26°C。因此，肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠具備在37°C以下呈流動的液體狀態(tài)狀，在39°C以上迅速凝固成固態(tài)凝膠的特性，滿足血管吻合術(shù)的技術(shù)參數(shù)要求。
實施例六、黏合法進行動物血管吻合實驗
本實施例考察肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑在血管吻合術(shù)中的應(yīng)用性能。
實驗方法取2只新西蘭大白兔，采用氯胺酮(60 100mg/kg)和地西泮(6 10mg/kg)肌肉注射麻醉后，以頸部過伸位固定于手術(shù)臺上。用脫毛劑脫毛，新潔爾滅酊消毒，鋪無菌巾單；取頸部正中線切口，長約6cm，剪開頸闊肌及頸前肌群，于氣管旁溝內(nèi)游離出長約5cm的右側(cè)頸總動脈。在頸總動脈的上、下兩端用微型無創(chuàng)動脈夾阻斷血流，中間橫斷血管，用生理鹽水沖洗兩斷端，吸取殘余的生理鹽水后將實施例一制備的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠B灌注到橫斷血管得兩斷端，應(yīng)用精確溫度定點加熱器將兩斷端加熱至 40°C，橫斷血管斷端內(nèi)的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠形成固體，將兩斷端準(zhǔn)確對合，在連接處涂氰基丙烯酸酯醫(yī)用黏合劑，黏合劑固化后，降低吻合口部的溫度至37°C，先松開遠心端動脈夾，使反流血沖過吻合口，確保吻合口通暢；再去除近心端動脈夾，完成膠粘吻合。
吻合口爆破壓測定完成黏合吻合術(shù)后，在距吻合口兩端各2 3cm處剪取頸動脈，用肝素鹽水沖洗管腔，一端連接于平針頭并用絲線固定，另一端以止血鉗夾閉。平針頭通過三通管和輸血導(dǎo)管分別與血壓表和壓力注射器相連接，用生理鹽水持續(xù)灌注膠粘吻合的頸動脈段，當(dāng)壓力注射器中的液體同時被推注到血管和連接壓力表的連接管內(nèi)時，壓力表上的讀數(shù)即反映血管吻合口所承受的壓力。觀察吻合口處漏水情況和血壓表的壓力變化。記錄吻合口漏水或破裂時的壓力，即為吻合口爆破壓。、
實驗結(jié)果黏合法進行兔血管吻合實驗，出血量少，血流恢復(fù)快，無滲漏，操作簡便，兔頸總動脈吻合口爆破壓為440mmHg，與縫合法同類實驗文獻報道一致，表明本發(fā)明的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物水凝膠在血管黏合吻合術(shù)法中具有較好的實用性。
在上述實施例中，僅對本發(fā)明進行了示范性描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本專利申請后可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對本發(fā)明進行各種修改。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于該水凝膠含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物，該水凝膠中所述肝素-泊洛沙姆復(fù)合物濃度為10% (ff/V)-40% (W/V)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物具有以下通式或基于以下通式的結(jié)構(gòu)組合Y-X-Y 或 Y-g-X-g-Y 或 X-Y 或 X-g-Y 或 Y-X-g-X-Y 其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，g卩a-氫-Co羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)。嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO (CH2CH2O)a (OCHCH3CH2)b (CH2CH2O)c，在共聚物中 a 和 c 為 2 150，b 為 15 67。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述水凝膠中還含有0.1%(ff/V)-5%(W/V)有機弱酸和/或氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水凝膠，其特征在于所述有機弱酸包括檸檬酸、酒石酸、富馬酸、硼酸、醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠，其特征在于所述的水凝膠中肝素-泊洛沙姆復(fù)合物濃度為15% (ff/V)-30% (W/V)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠，其特征在于所述的水凝膠在37°C以下呈流動的高分子膠液狀，在37. 5°C _45°C之間凝固成固態(tài)凝膠。
8.一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的水凝膠的制備方法，其特征在于將肝素-泊洛沙姆復(fù)合物分散于注射用水中，肝素-泊洛沙姆復(fù)合物與注射用水的物質(zhì)的量比為1: 2. 5-10，完全溶解形成水凝膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的肝素-泊洛沙姆復(fù)合物具有以下通式或基于以下通式的結(jié)構(gòu)組合Y-X-Y 或 Y-g-X-g-Y 或 X-Y 或 X-g-Y 或 Y-X-g-X-Y 其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即a-氫羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)。嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO (CH2CH2O)a (OCHCH3CH2)b (CH2CH2O)c，在共聚物中 a 和 c 為 2 150，b 為 15 67。
全文摘要
本發(fā)明公開一種應(yīng)用于血管吻合術(shù)的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠及其制備方法。該水凝膠中肝素-泊洛沙姆復(fù)合物濃度為10％(W/V)-40％(W/V)，水凝膠預(yù)先封裝于無菌注射器或安瓿中，或水凝膠冷凍干燥形成凍干粉灌注于西林瓶中，臨用前加入注射用水溶解，形成水凝膠。本發(fā)明的含有肝素-泊洛沙姆復(fù)合物的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用于顯微血管吻合術(shù)，不需要可溶性血管內(nèi)支架或縫線輔助，增加了吻合口的密閉性能，不存在滲漏現(xiàn)象，并降低了血管吻合術(shù)過程的創(chuàng)傷性和血管栓塞的風(fēng)險。
文檔編號A61L24/08GK102989036SQ20111028078
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月10日
發(fā)明者魯翠濤, 趙應(yīng)征, 趙子逸 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司