專利名稱：免疫組合物和方法
免疫組合物和方法
背景技術(shù)：
登革熱是繼瘧疾之后的第二重要的熱帶傳染病，世界上約有一半的人口生活在存在流行傳播風(fēng)險的區(qū)域。每年估計有5千萬至I億例登革熱(Dengue fever),導(dǎo)致500，000患者因出血性(hemorrhagic)登革熱而就醫(yī)，并導(dǎo)致約25，000人死亡。登革熱病毒傳染在超過100個熱帶國家流行并且出血性登革熱已經(jīng)在這些國家中的60個有記錄(Gubler，2002，TRENDS in Microbiology (微生物學(xué)趨勢)，10 :100-103 ;Monath，1994，Proc. Natl.Acad. Sci.(美國科學(xué)院院刊),91 :2395-2400)。登革熱由黃病毒屬(flavivirus genus)的四種病毒引起，所述病毒具有相似的血清型但是在抗原方面有所不同(Giibler等，1988,在Epidemiology of arthropod-borneviral disease(節(jié)肢動物傳播的疾病的流行病學(xué))中.Monath TPM,編輯，Boca Raton(FL) CRC Press :223-60 ；Kautner 等，1997，J. of Pediatrics (兒科學(xué)雜志)，131 :516-524 ；Rigau-Perez 等，1998，Lancet(柳葉刀)，352:971-977 ;Vaughn 等，1997，J. Infect. Dis.(傳染病雜志)，176 :322-30)。"登革熱病毒(dengue fever virus)"或"登革病毒(dengue virus)"是正義單鏈RNA病毒,其屬于黃病毒科(flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus genus)。RNA基因組包含5' I型末端(type I end)但是缺少3'聚腺苷酸(Poly-A)尾部?；蚪M的組織包含以下元件5'非編碼區(qū)(NCR)、編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(衣殼(C)、前膜(pre-membrane) /膜(prM/M)、包膜(E))的區(qū)域和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)的區(qū)域以及3' NCR。病毒基因組RNA結(jié)合衣殼蛋白從而形成核殼體。登革病毒基因組編碼連續(xù)編碼區(qū)，所述連續(xù)編碼區(qū)被翻譯為單個的多聚蛋白，所述單個的多聚蛋白經(jīng)歷翻譯后加工，這對黃病毒而言是典型的。登革病毒被保持在包括哺乳動物和伊蚊(Aedes mosquito)的循環(huán)內(nèi)。哺乳動物中的感染始于在被感染的伊蚊吸食血液期間登革病毒的注入，由此登革病毒主要沉積在血管外組織中。在蚊子盯咬后，病毒的潛伏期(incubation period)為約4天(3至14天)。哺乳動物受試者被接種后，被感染的第一類哺乳動物細(xì)胞是樹突細(xì)胞，樹突細(xì)胞然后遷移到淋巴神經(jīng)節(jié)(Wu等，2000，Nature Med.(自然醫(yī)學(xué))，7 :816-820)。除了樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞屬于登革病毒的首要目標(biāo)。在皮膚和淋巴神經(jīng)節(jié)中的初始復(fù)制后，在急性發(fā)熱期登革病毒出現(xiàn)在血液中，通常為3至5天。一種血清型登革(dengue)的感染可能產(chǎn)生從非特異性病毒綜合征(non-specific viral syndrome)到嚴(yán)重致死性出血疾病(severe fatal hemorrhagicdisease)的一系列臨床疾病。對登革熱的常規(guī)實驗室診斷是基于病毒的分離和/或?qū)Φ歉餆岵《揪哂刑禺愋缘目贵w的檢測。原發(fā)感染可能是無癥狀的或者可能導(dǎo)致登革熱。登革熱表征為兩個階段的發(fā)熱、頭痛、身體不同部分的疼痛、衰竭、發(fā)疹和淋巴結(jié)病(Kautner等，1997, J. ofPediatrics (兒科學(xué)雜志),131 :516-524 ；Rigau-Perez 等，1998, Lancet (柳葉刀)，352 :971-977)。病毒血癥期(viremic period)與發(fā)熱期相同(Vaughn 等，1997,J. Infect. Dis.(傳染病雜志)，176 :322-30)。登革熱的治愈在7至10天后完成，而延長的虛弱是正常的。頻繁發(fā)生白細(xì)胞和血小板數(shù)目的減少。、
登革出血熱(dengue haemorrhagic fever, DHF)是登革病毒感染的潛在致死的并發(fā)癥。DHF表征為高燒和登革熱癥狀，并極度嗜睡和困倦。增加的血管滲透性和異常的內(nèi)穩(wěn)態(tài)可能導(dǎo)致血量的減少、低血壓，并且在嚴(yán)重的情況中，低血容量性休克(hypovolemicshock)和內(nèi)出血。兩種因素表現(xiàn)出在出血性登革熱的發(fā)生中起主要作用-具有高水平的病毒血癥的快速病毒復(fù)制(該疾病的嚴(yán)重性與病毒血癥的水平相關(guān)；Vaughn等，2000，J. Inf. Dis.(傳染病雜志)，181 :2-9)以及具有炎癥介質(zhì)的高水平釋放的主要的炎癥反應(yīng)(Rothman和Ennis, 1999，Virology (病毒學(xué)),257 :1_6)。不經(jīng)治療，出血性登革熱的致死率可以達(dá)到10%,但是在大多數(shù)具有治療經(jīng)驗(WHO技術(shù)指導(dǎo)，1986 Dengue hemorrhagicfever !diagnosis, treatment and control (登革出血熱診斷、治療和控制)，p. 1-2.世界衛(wèi)生組織，日內(nèi)瓦，瑞士)的中心致死率< I %。登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)通常是DHF的進(jìn)展并且經(jīng)常是致死的。DSS產(chǎn)生自導(dǎo)致血漿滲入到血管外空間的一般性血管炎(vasulitis)。DSS表征為快速和量少的(poor volume)脈搏、低血壓、四肢冰冷和坐立不安。登革病毒的四種血清型具有約60-80%的序列同源性。一種登革血清型的感染提 供持續(xù)的同源免疫性但是提供有限的異源免疫性。(Sabin，1952，Am. J. Trop. Med. Hyg.，I 30-50)。因此，隨后個體可能為不同血清型感染。理論上，產(chǎn)生自不同血清型登革熱的二次感染是DHF發(fā)展的危險因素。顯示DHF的大部分患者之前曾經(jīng)暴露于登革病毒的四種血清型中的至少一種。然而，DHF是多因素的-因素包括涉及的病毒株以及患者的年齡、免疫狀態(tài)和遺傳素質(zhì)。據(jù)信，同源的再次感染后，對該血清型具有特異性的抗體與表面蛋白結(jié)合并防止病毒結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞。然而，異源登革血清型的再次感染后，異源病毒將激活免疫系統(tǒng)以攻擊，好像它是第一血清型那樣。這些針對之前血清型的抗體結(jié)合病毒，但不使其失活。免疫應(yīng)答吸引眾多巨噬細(xì)胞，然后異源血清型將感染所述巨噬細(xì)胞。假說認(rèn)為當(dāng)個體隨后被不同登革血清型感染時，由在前的登革血清型感染產(chǎn)生的抗體可以產(chǎn)生嚴(yán)重性增強的癥狀。因此，需要針對所有登革的四種血清型來對個體進(jìn)行免疫。沒有針對登革熱的特殊治療。對登革熱的治療是針對癥狀的，臥床休息，通過解熱藥和鎮(zhèn)痛劑控制發(fā)熱和疼痛，以及充足的飲水。出血性登革熱的治療需要平衡液體損失，替換凝結(jié)因子以及輸注肝素。尤其易受登革病毒感染影響的一類人是兒童。在兒童中，登革病毒感染的影響更嚴(yán)重。雖然，多種兒科疫苗的應(yīng)用已經(jīng)減輕了多種兒科人群疾病的治療，但是這些疫苗被推薦的給藥產(chǎn)生增加的復(fù)雜性和密集的疫苗接種時間表。目前用于給藥登革疫苗的方案預(yù)期需要多種疫苗以保證實現(xiàn)針對所有血清型的保護(hù)。將此登革疫苗接種時間表增加到本已密集的兒童疫苗接種時間表中產(chǎn)生對推薦的兒科疫苗接種時間表順從的問題，尤其是在世界上難以獲得常規(guī)醫(yī)療可用性的那些地區(qū)。不幸地，這些相同的地區(qū)就是急迫需要登革熱治療的地區(qū)。因此，需要通過共同給藥來聯(lián)合多種疫苗以增強對推薦的疫苗接種時間表的順從。通過將多種疫苗接種結(jié)合為單一劑型，已經(jīng)成功地使疫苗接種頻率最小化。然而，在單一劑型中的不同試劑之中存在不相容的可能性。此外，多種疫苗的單次給藥還產(chǎn)生有效疫苗接種的問題。只要組合地給藥多價疫苗(或共同給藥多種疫苗)，該組合的每個個體抗原就會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答?？赡芤种泼庖呦到y(tǒng)充分響應(yīng)所有被給藥的抗原的能力，并且對一種或多種抗原不提供持續(xù)的保護(hù)性應(yīng)答。本發(fā)明通過提供能夠使流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹免疫接種與針對登革血清型I、
2、3和4的登革免疫接種同時進(jìn)行的方法和組合物來解決上述需要。發(fā)明詳述在一個實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對登革病毒的四種血清型和麻疹病毒的中和抗體的方法，所述方法包括向所述哺乳動物給藥登革疫苗組合物并且共同給藥麻疹疫苗組合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對登革病毒的四種血清型(four serotypes of dengue virus)、流行性腿腺炎病毒(mumps virus)、麻疫病毒(measles virus)和風(fēng)疫(rubella)的中和抗體的方法,所述方法包括向所述哺乳動物給藥登革疫苗組合物并且共同給藥MMR疫苗組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對登革熱的四種血清型、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹和VZV的中和抗體的方法，所述方法包括向所述哺乳動物給藥登革疫苗組合物并共同給藥MMRV疫苗組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對登革病毒的四種血清型、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒和風(fēng)疹以及白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原的中和抗體的方法，所述方法包括向所述哺乳動物給藥登革的四種血清型的疫苗登革病毒并且共同給藥MMR疫苗組合物，繼之以給藥包含白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原的組合物。在一個本發(fā)明的實施方案中，通過給藥四價疫苗病毒組合物來實現(xiàn)登革的四種血清型的疫苗登革病毒的給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過兩種二價疫苗登革病毒組合物的共同給藥來實現(xiàn)登革的四種血清型的疫苗登革病毒的給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過給藥包含Chimerivax DEN_1、2、3和4的四價疫苗病毒組合物來實現(xiàn)登革的四種血清型的疫苗登革病毒的給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過四價疫苗病毒組合物的給藥來實現(xiàn)登革的四種血清型的疫苗登革病毒的給藥，在所述四價疫苗病毒組合物中，血清型1、2、3和4的登革熱的疫苗病毒的量處于IO3至IO6 CCID50的范圍內(nèi)。單價；雙價等除了藥用賦形劑之外還包含來源于單個微生物株、設(shè)計用于誘導(dǎo)出針對特定病原體的中和抗體應(yīng)答的抗原時，一劑藥物(dose)、組合物或疫苗被稱為“單價的”，而當(dāng)其包含來源于多株、設(shè)計用于誘導(dǎo)出針對多種病原體的中和抗體的抗原時，一劑藥物、組合物或疫苗被稱為多價的。所用術(shù)語與常規(guī)術(shù)語一致。例如，當(dāng)其分別包含用于誘導(dǎo)出針對兩種、三種或四種病原體的中和抗體的抗原時，一劑藥物、組合物或疫苗被認(rèn)為是雙價、三價或四價的。多價組合物可以通過簡單地混合單價組合物來制備。這種多價組合物可以提前在制造時制備或者可以由最終用戶在向受試者給藥時組合。登革病毒的四種血清型的疫苗病毒的給藥可以通過單價或雙價疫苗登革病毒的共同給藥或四價疫苗登革病毒組合物的給藥來實現(xiàn)。當(dāng)用于本文時，"四價登革組合物"包含誘導(dǎo)針對所有登革的四種血清型的中和抗體的抗原。
疫苗登革組合物術(shù)語"疫苗登革組合物"指包含疫苗登革病毒和/或登革免疫蛋白的組合物。疫苗登革組合物可以包含一種或多種疫苗登革病毒、一種或多種登革免疫蛋白或一種或多種疫苗登革病毒和一種或多種登革免疫蛋白的組合。疫苗登革病毒在本發(fā)明的環(huán)境中，"疫苗登革病毒"是指能夠通過向有免疫力的哺乳動物給藥這種疫苗登革病毒來誘導(dǎo)針對一種或多種血清型的登革病毒的中和抗體的登革病毒。疫苗登革病毒的實例包括失活的登革病毒、減毒登革病毒和嵌合登革病毒。登革病毒的血清型包括血清型1、2、3和4。
失活的登革病毒如果病毒不能夠在允許野生型病毒復(fù)制的細(xì)胞中以任何顯著的程度復(fù)制，則它被認(rèn)為是"失活的"?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法使病毒失活，所述方法包括但不限于連續(xù)傳代、遺傳操作、化學(xué)處理或輻射(包括熱或電磁輻射，其典型地以X射線或紫外線輻射的形式)。失活的登革病毒描述于于2001年7月3日頒發(fā)的美國專利號6，254，873 中。減毒登革病毒"減毒病毒"是這樣的病毒，其在許可宿主細(xì)胞(permissivehost cell)中復(fù)制，但是其復(fù)制效率相對于相同細(xì)胞類型中的野生型病毒顯著降低。減毒病毒可以復(fù)制到一定小的范圍程度，其在哺乳動物中不誘發(fā)與野生型病毒相關(guān)的疾病狀態(tài)。減毒病毒的實例是本領(lǐng)域中已知的。減毒病毒可以由例如野生型病毒通過重組DNA技術(shù)、定點突變、遺傳操作、連續(xù)傳代、化學(xué)處理、化學(xué)誘變或電磁輻射制備。用于本發(fā)明的減毒病毒在大多數(shù)免疫接種的個體中可能產(chǎn)生適度強度的(即中等至輕微，或無)副作用，同時保持其在哺乳動物中誘導(dǎo)中和抗體的能力。雖然減毒病毒在典型的宿主細(xì)胞中以小于野生型病毒的程度復(fù)制，但是這種減毒病毒可以在能夠補足減毒病毒中遭破壞的功能的細(xì)胞(“生產(chǎn)細(xì)胞")中有效地制備。生產(chǎn)細(xì)胞可以是許可宿主細(xì)胞(permissive host cell)天然存在的變體或者可以通過其他方式如重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。在使用重組DNA技術(shù)制備經(jīng)改造的生產(chǎn)細(xì)胞中，通過插入補足減毒病毒中遭破壞的功能的外源核酸來對細(xì)胞進(jìn)行修飾。這種外源核酸可以被引入到細(xì)胞的基因組中或者可以保持在染色體外。在實施本發(fā)明的環(huán)境中使用的疫苗登革病毒可以是減毒登革病毒。減毒登革病毒可以來源于登革病毒血清型1、2、3或4。在一個實施方案中，減毒登革病毒是在許可細(xì)胞類型中具有比相同細(xì)胞類型中的野生型病毒低至少一個數(shù)量級的復(fù)制效率的減毒登革病毒。在其他實施方案中，將減毒登革病毒減毒以使其復(fù)制到相對于相同細(xì)胞類型中的野生型病毒的至少兩個數(shù)量級、三個數(shù)量級、四個數(shù)量級、五個數(shù)量級、六個數(shù)量級、七個數(shù)量級以上的程度。在一個實施方案中，疫苗登革病毒是減毒登革病毒，其在37°C或39°C在Huh_7、VERO和/或C6/36肝細(xì)胞中的生長產(chǎn)生最大效價，所述最大效價比利用野生型親株在相同培養(yǎng)條件下并且當(dāng)使用用于確定效價的給定方法測量時獲得的最大效價小至少10倍。用于實施本發(fā)明的減毒疫苗登革病毒的實例包括VDV-l、VDV-2以及在例如申請W002/66621、W00057904, W00057908, W00057909, W00057910, W002/0950075 和 W002/102828 中描述的毒株。" VDV"或"Vero登革疫苗"是指這樣的減毒登革病毒，其能夠在Vero細(xì)胞中復(fù)制并且能夠在哺乳動物中誘發(fā)特異性體液應(yīng)答，包括誘導(dǎo)中和抗體。"VDV-1"是來源于野生型DEN-I 16007株的病毒，其經(jīng)歷了通過PDK細(xì)胞的11次傳代(DEN-1 16007/PDK11)并且隨后在Vero細(xì)胞中在32°C被擴增，將其RNA純化并轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中。VDV-1株與DEN-116007/PDK13疫苗株(通過TOK-原代犬腎-細(xì)胞傳代13次)相比具有14個額外的突變。DEN-116007/PDK13株(也被稱為"LAV1")已經(jīng)描述于以Mahidol大學(xué)名義的專利申請EP1159968 中并且已經(jīng)提交給了 National Microorganisms Cultures Collection (國家微生物保藏中心)(CNCM)，編號為1-2480。制備和表征VDV-I株的方法已經(jīng)描述于以Sanofi-Pasteur和疾病控制和防治中心(Center for Disease Control and Prevention)
名義的以編號PCT/IB 2006/001313提交的國際專利申請中。" VDV-2"是這樣的毒株，其獲得自野生株DEN-216681并且已經(jīng)通過PDK細(xì)胞經(jīng)歷了 50次傳代(DEN-2 16681/PDK50)，進(jìn)行平板純化，抽提和純化其RNA，然后轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中。VDV-2株隨后通過平板純化和在Vero細(xì)胞中的擴增獲得。VDV-2株相比DEN-216681/PDK53疫苗株(通過PDK細(xì)胞傳代53次)具有10個額外的突變，其包括4個沉默突變。DEN-216681/PDK53株(也被稱為"LAV2 ")已經(jīng)描述于以Mahidol大學(xué)名義的專利申請EP1159968中，并且已經(jīng)提交給了國家微生物保藏中心(CNCM)，編號為1-2481。制備和表征VDV-2株的方法已經(jīng)描述于以Sanofi-Pasteur和疾病控制和防治中心(Center forDisease Control and Prevention)名義的以編號PCT/IB 2006/001513提交的國際專利申請中。VDV I和2株通過在Vero細(xì)胞中的擴增制備。收集制備的病毒并通過過濾從細(xì)胞碎片中凈化。通過用酶處理來消化DNA。通過超濾除去雜質(zhì)。可以通過濃縮方法增加感染效價。在加入穩(wěn)定劑后，在使用前將毒株以凍干或冷凍形式存儲，然后當(dāng)需要時使其重建(reconstitution)。嵌合登革病毒本發(fā)明的疫苗登革病毒也可以是嵌合登革病毒。嵌合登革病毒是非登革病毒，其基因組被修飾成編碼登革病毒的包膜蛋白以致嵌合登革病毒對細(xì)胞的感染導(dǎo)致登革病毒的包膜蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)。用于制備嵌合登革病毒的非登革病毒可以來源于野生型或失活的非登革病毒。用于外源核酸在哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移和表達(dá)以及用于制備登革嵌合病毒的非登革病毒的實例在本領(lǐng)域中是已知的?？梢杂糜跇?gòu)建嵌合登革病毒的非登革病毒的示例性實例包括黃病毒、痘病毒(poxvirus)、腺病毒和腺相關(guān)病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，非登革病毒是野生型或減毒黃病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，非登革病毒是減毒黃熱病毒，其中這種減毒熱病毒的病毒基因組已經(jīng)被修飾為編碼登革病毒血清型的prM和E基因。嵌合登革病毒導(dǎo)致登革包膜蛋白在感染的細(xì)胞中的表達(dá)，并誘發(fā)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答包括抗體中和作為該登革包膜蛋白來源的登革血清型，可以因此用于本發(fā)明的環(huán)境中?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的嵌合病毒的實例包括描述于專利申請WO 98/37911中的登革登革/YF嵌合病毒，以及登革/登革熱嵌合體，如描述于專利申請W09640933和W00160847中的那些。
在一個實施方案中，嵌合YF/登革病毒包含減毒的黃熱病毒株YF17D (Theiler M和 Smith H.H. (1937) J. Exp. Med.(實驗醫(yī)學(xué)雜志)，65，p. 767-786)(病毒 YF17D/DEN-1、YF17D/DEN-2、YF17D/DEN-3、YF17D/DEN-4)的基因組構(gòu)架(backbone)?？梢允褂玫?YF17D株的實例包括 YF17D204( YF-Vax ，Sanofi-Pasteur, Swifwater, PA,美國；Stamaril ，Sanofi-Pasteur, Marcy I ' Etoile,法國；ARILVAX , Chiron, Speke, Liverpool,英國；FLAV1MUN ，Berna Biotech, Bern,瑞士 ；YF17D_204 法國(X15067，X15062)；YF17D-204，234 美國(Rice 等，1985，Science (科學(xué)),229 :726-733)，或此外相關(guān)的毒株YF17DD (Genbank 登錄號 U17066)、YF17D_213 (Genbank 登錄號 U17067)以及由 Galler 等描述的毒株YF17DD (1998，Vaccines (疫苗)，16 (9/10) 1024-1028)?？梢杂糜谌说娜魏纹渌麥p毒黃熱病毒株可以用于構(gòu)建本發(fā)明環(huán)境中的嵌合體。適用于實施本發(fā)明的嵌合登革病毒的一個實例是"Chimerivax 登革"或"CYD"，其是一種包含YF病毒基因組骨架的嵌合黃熱(YF)病毒，其中編碼前膜(prM)和包膜(E)蛋白的序列已經(jīng)被編碼登革病毒的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列替代。可以基本根據(jù)Chambers等(1999) J Virology (病毒學(xué)雜志)73 (4) =3095-3101的教導(dǎo)完成嵌合Chimerivax病毒的構(gòu)建。包含血清型I登革熱株(DEN-I)的prM和E序列的嵌合登革病毒 被稱為"CYD-I或CYDDEN1"。包含DEN-2株的prM和E序列的嵌合YF被稱為"CYD-2或CYD DEN2 "。包含DEN-3株的prM和E序列的嵌合YF病毒被稱為"CYD-3或CYD DEN3 "。含DEN-4株的prM和E序列的嵌合登革病毒被稱為"CYD-4或CYD DEN4 "。這些登革Chimerivax 病毒的制備已經(jīng)詳細(xì)描述于國際專利申請WO 98/37911和WO 03/101397中，為準(zhǔn)確描述它們的制備方法可以參考所述專利申請。實施例中描述的嵌合體通過使用來自毒株 DEN 1PU0359(TYP1140)、DEN2 PU0218、DEN3 PaH881/88 和 DEN 4 1228(TVP980)的 prM和E序列來制備。備選地，其他登革熱病毒株可以被用作核酸源以有助于可用于實施本發(fā)明的嵌合病毒的構(gòu)建。血清型I登革病毒的疫苗登革病毒的實例可以例如是疫苗株VDVl或Chimerivax DEN-I (包含DEN-I 16007/PDK13株的prM和E基因的YF17D/DEN-1嵌合病毒)。血清型2登革病毒的疫苗病毒的實例是疫苗株VDV2或Chimerivax DEN-2 (包含DEN-2 16681/PDK53株的prM和E基因的YF17D/DEN-2嵌合病毒)。血清型3登革病毒的疫苗病毒的實例是Chimerivax DEN-3 (YF17D/DEN-3嵌合病毒)。血清型4登革病毒的疫苗病毒的實例是Chimerivax DEN-4(YF 17D/DEN-4嵌合病毒)。技術(shù)人員可以參考上述公布的國際專利申請以獲得對提及的毒株的詳述、用于獲得它們以及構(gòu)建這些嵌合病毒的方法。登革免疫蛋白登革疫苗組合物也可以包含登革免疫蛋白。登革免疫蛋白是當(dāng)被給藥于具有免疫力的哺乳動物時誘導(dǎo)針對登革血清型1、2、3和/或4的血清中和抗體的登革結(jié)構(gòu)蛋白或其衍生物。登革免疫蛋白包括登革結(jié)構(gòu)蛋白的天然、衍生化或變性形式，包括其化學(xué)綴合物、免疫學(xué)片段和融合蛋白。登革病毒的基因組序列和組織在本領(lǐng)域中得到充分表征，這有助于此類蛋白的重組制備。參見例如Sughrue等(1997) J. General Virology (普通病毒學(xué)雜志)78 (8):1861-1866。登革病毒粒由三種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成基因組相關(guān)的衣殼蛋白、在病毒成熟期間通過由糖基化前體蛋白(PrM)的內(nèi)部切割產(chǎn)生的膜相關(guān)蛋白(M)以及定位于膜的血細(xì)胞凝集包膜蛋白(E)。據(jù)信，E是血清型特異性的主要抗原決定簇(Markoff，J. (1989) J Virol.(病毒學(xué)雜志)63(8) :3345-3352)。然而，prM基因的產(chǎn)物(糖基化的M蛋白及其片段)也具有能夠引發(fā)特異性免疫應(yīng)答的抗原能力(Vasquez等(2002) Vaccine 20 :1823-1830)。登革包膜蛋白的重組表達(dá)是本領(lǐng)域中已知的。見例如Zhao等(1987) J Virol.(病毒學(xué)雜志)61 4019-4022。備選地，登革結(jié)構(gòu)蛋白可以分離自登革病毒?；虻歉锊《靖腥镜募?xì)胞。登革結(jié)構(gòu)蛋白可以被給藥于哺乳動物以引發(fā)特異性免疫應(yīng)答從而誘導(dǎo)針對登革的四種血清型的血清中和抗體。這種結(jié)構(gòu)蛋白可以天然的、衍生化的或變性的形式給藥。可以使用常規(guī)變性方法來實現(xiàn)登革結(jié)構(gòu)蛋白的變性，所述方法如熱或化學(xué)變性劑化學(xué)品如甲醛或￠-丙內(nèi)酯。備選地，這種登革表面蛋白的亞基可以用于引發(fā)只對一種或多種血清型的登革的免疫應(yīng)答。登革結(jié)構(gòu)蛋白的免疫活性表位描述于文獻(xiàn)中。本發(fā)明的登革疫苗組合物包括針對登革血清型的單價亞基疫苗并且包括能夠引發(fā)針對多種登革血清型的免疫應(yīng)答的多價登革亞基疫苗。
此類登革結(jié)構(gòu)蛋白，其衍生物及亞基也可以與載體分子綴合以提供可用于在有免疫力的哺乳動物中產(chǎn)生中和抗體并且可用于實施本發(fā)明的綴合登革抗原。這種綴合可以通過以下方法實現(xiàn)化學(xué)綴合技術(shù)或包含登革結(jié)構(gòu)蛋白或其免疫活性亞基及載體蛋白的融合蛋白的重組表達(dá)?？捎糜谥苽淇捎糜趯嵤┍景l(fā)明的綴合物的載體分子的實例包括白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid)、破傷風(fēng)毒素的C片段、白喉毒素的突變體，包括 CRM 197、CRM 176、CRM228、CRM 45、CRM9、CRM 45、CRM 102、CRM 103 和CRM 107,肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(pneumococcal pneumolysin)、0MPC、熱休克蛋白、百日咳蛋白、肺炎球菌表面蛋白PspA或艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B。流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹疫苗組合物包含流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹病毒的疫苗組合物在本領(lǐng)域中一般被稱為"MMR"疫苗。在本發(fā)明的實施中，MMR疫苗可以通過同時給藥單價流行性腮腺炎、單價麻疹和單價風(fēng)疹疫苗組合物來實現(xiàn)。備選地，MMR疫苗可以通過包含減毒或失活的流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹病毒的三價組合物來實現(xiàn)。此外，MMR疫苗通過失活的或減毒的水痘帶狀皰疫病毒(varicella zoster virus, VZV)進(jìn)行補充，該疫苗被稱為MMRV疫苗。用于預(yù)防麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV的單價和多價疫苗組合物可以單獨地或組合地用于實施本發(fā)明。用于預(yù)防麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV的疫苗組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？捎糜谥苽渎檎钜呙缃M合物的麻疹株的實例包括Enders-Edmonston> Edmonston-Zagreb和Schwarz麻疫株。單價麻疫疫苗組合物也被稱為"麻疹疫苗"?？捎糜谥苽湟呙缌餍行匀傺捉M合物的流行性腮腺炎病毒株的實例包括Jeryl Lynn,Urabe AM 9,RIT 4385和Rubini株?？捎糜谥苽湟呙顼L(fēng)疹組合物的風(fēng)疹病毒株的實例包括Wistar RA 27/3和Wistar RA 27/3M株。已經(jīng)批準(zhǔn)單價流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹疫苗可用于人類并且可商購?？捎糜谥苽湟呙鏥ZV組合物的VZV株的實例包括Oka/Merck和Oka株。可用于實施本發(fā)明的市售單價流行性腮腺炎疫苗的實例是Mumpsvax 疫苗(Merck & Co, Whitehouse Station, NJ, USA)?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的市售單價麻疫疫苗的實例是Atteillivax 疫苗(Merck & Co,Whitehouse Station,NJ,USA)?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的市售單價風(fēng)疫疫苗的實例是Meruvax II疫苗(Merck & Co, Whitehouse Station,NJ, USA)。市售單價減毒VZV疫苗的實例包括Varivax 和Zostavax 疫苗(Merck & Co,Whitehouse Station, NJ, USA)和 Okavax(Sanofi Pasteur SA,Lyon FR)。備選地，流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹疫苗組合物可以提供在三價疫苗組合物中?？梢允褂蒙鲜隽餍行匀傺?、麻疹和風(fēng)疹病毒的疫苗株來制備三價MMR疫苗。用于針對流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹的疫苗接種的三價MMR組合物已經(jīng)被管理當(dāng)局批準(zhǔn)為可安全且有效的供人類使用并且可商購。市售三價MMR疫苗組合物的實例包栝M-M-R II疫苗(購自Merck & Co, Whitehouse Station, NJ USA)、Triviraten Berna (也被稱為 Berna-MMR)疫苗(購自 Berna Biotech,Basel, Switzerland)、Priorix 疫苗(購自 Glaxo SmithKlineBiologies, Rixensart, Belgium)以及Trimovax 疫苗(購自 Sanofi Pasteur SA, Lyon,France)。備選地，麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV疫苗用于四價疫苗組合物?？梢允褂蒙鲜雎檎?、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV的疫苗株來制備三價MMRV疫苗。用于針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV的疫苗接種的四價MMR組合物已被批準(zhǔn)可用于人類并且是可商購的。四價MMR疫苗組合物的實例是可商購的如ProQuad(Merck and Company,Whitehouse Station NJ USA)和 Priorix Tetra (購自 Glaxo SmithKline Biologies,Rixensart, Belgium)。誘導(dǎo)中和抗體在本發(fā)明的環(huán)境中，"疫苗組合物"是指包含免疫有效量的抗原的組合物，所述免疫有效量的抗原足以在有免疫力的哺乳動物中引起包括針對病原體的中和抗體的特異性免疫應(yīng)答?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的疫苗組合物的實例是(單獨地以及共同地)疫苗登革組合物、疫苗登革病毒、疫苗登革免疫蛋白、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗組合物、VZV疫苗組合物、風(fēng)疹疫苗組合物、MMR疫苗和MMRV疫苗。根據(jù)上下文，當(dāng)本發(fā)明的某些程序或方面可施用于各類組合物的一個或多個實例時，該術(shù)語被共同地或單獨地使用。對針對登革血清型、流行性腮腺炎、麻疹風(fēng)疹和/或VZV的血清中和抗體的檢測在科學(xué)文獻(xiàn)中是已知的。這種登革血清中和測定的實例描述于以下實施例I中。備選地，有用于鑒定針對登革、流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹的血清中和抗體的可商購的試劑盒。當(dāng)如此確定的中和抗體的效價不低于I : 10(統(tǒng)一 1/稀釋)時，認(rèn)為血清樣品存在針對疫苗組合物的中和抗體。在備選實施方案中，當(dāng)連續(xù)稀釋因子為16、32、64、128、256、512、1024、2048、4096或更大時，來自接受了登革疫苗組合物給藥的哺乳動物的血清樣品顯示存在針對登革結(jié)構(gòu)蛋白的血清中和抗體。哺乳動物術(shù)語哺乳動物包括哺乳動物家族的個體，包括牛、狗、馬、靈長類動物、人類、豬、兔、貓。已經(jīng)證明，登革病毒能夠感染除人以外還包括嚙齒類動物和有袋類動物在內(nèi)的哺乳動物。見例如 Dengue infection in neotropical forest mammals (新熱帶森林哺乳動物中的登革感染)，deThoissy 等(2009) Vector Borne Zoonotic Disease (載體攜帶的動物傳染病)9(2) :157-70。適于給予本發(fā)明的組合物和方法的哺乳動物的實例包括從未暴露于登革、麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV病毒的(即免疫上首次的)哺乳動物或之前已經(jīng)暴露于一種或多種登革病毒血清型和/或麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和/或VZV的哺乳動物(包括已經(jīng)顯示與登革、流行性腮腺炎、麻疹、VZV或風(fēng)疹病毒感染相關(guān)的一種或多種疾病狀態(tài)的癥狀的哺乳動物)(即非首次的)兩者。有免疫力的哺乳動物是這樣的哺乳動物，當(dāng)所述哺乳動物暴露于疫苗組合物時，具有能夠引發(fā)血清中和抗體產(chǎn)生的功能免疫系統(tǒng)。持久如果當(dāng)在疫苗接種后的時間點采樣時，哺乳動物的血清維持針對被接種的疫苗組合物所來源的病原體的血清中和抗體的存在，則針對疫苗組合物的免疫應(yīng)答被認(rèn)為是"持久的"。在本發(fā)明的環(huán)境中，當(dāng)在哺乳動物中本發(fā)明的疫苗組合物針對被給藥的抗原顯示I : 4、1 : 8、1 16、1 32 以 上的效價達(dá) 90 天、120 天、150 天、180 天、210 天、240 天、270天、300天、330天、一年、兩年、5年或更長時，則證明了持久的免疫應(yīng)答。免疫術(shù)語"接種"指給藥疫苗組合物。術(shù)語"免疫"是指在有免疫力的哺乳動物中對接種疫苗組合物的生物學(xué)應(yīng)答，其導(dǎo)致針對所述抗原所來源的病原體的中和抗體的持久存在。對用單一疫苗組合物接種的應(yīng)答可以導(dǎo)致產(chǎn)生針對單一病原體、所述病原體的變體或不同病原體(被稱為交叉反應(yīng)性)的血清中和抗體。本發(fā)明的疫苗組合物可以顯示交叉反應(yīng)性以致針對多種病原體或相同病原體的不同變體來免疫有免疫力的哺乳動物。如果哺乳動物持久地維持針對病原體的血清中和抗體，并且保持可誘導(dǎo)的免疫記憶(所述可誘導(dǎo)的免疫記憶允許所述哺乳動物產(chǎn)生足夠的針對所述病原體的中和抗體從而在用所述病原體再次挑戰(zhàn)時最小化或避免在所述哺乳動物中的與所述病原體相關(guān)的疾病狀態(tài)的癥狀)，則認(rèn)為哺乳動物相對于特定病原體被"免疫"。疫苗登革病毒劑量包含在單位劑型中的疫苗病毒組合物的量通常以病毒空斑形成單位(PFU)或感染50%組織培養(yǎng)物的劑量或感染50%細(xì)胞培養(yǎng)物的劑量(CCID5tl)表示。例如，對于單價或四價組合物，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含10至IO6CCID5tl，尤其IO3至IO5CCID5tl的血清型1、2、3或4的疫苗登革病毒。因此，在根據(jù)本發(fā)明的組合物或應(yīng)用中，血清型1、2、3和4的疫苗登革病毒的劑量優(yōu)選各自落入10至IO6CCID50的范圍內(nèi)，如10、102、103、IO4UO5或IO6CCID50,尤其在IO3至IO5CCID5tl的范圍內(nèi)。疫苗病毒可以以相同或不同劑量使用，所述劑量可以相對于所用疫苗病毒的性質(zhì)和所獲得的免疫應(yīng)答的強度來調(diào)節(jié)。備選地，包含在單位劑型中的疫苗病毒組合物可以被描述為在給定制劑中的病毒顆粒的量或濃度。病毒顆粒的量或濃度可以使用常規(guī)分光光度法或免疫測定方法來確定。使用給定的確定PFU的測定方法，技術(shù)人員可以容易地建立這種測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線從而容易地將PFU劑量轉(zhuǎn)化為基于病毒顆粒量或濃度的劑型。根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的方法的特別的實施方案，減毒疫苗登革病毒在單價和四價組合物或疫苗中的量為IO3至IO5 CCID500根據(jù)特別的實施方案，單價疫苗包含IO4 CCID5tl的VDVl或VDV2，優(yōu)選VDV2。根據(jù)特別的實施方案，四價疫苗包含IO5 CCID50的Chimerivax DEN-1、2、3和4(CYDDEN-1、2、3，4)。根據(jù)一個有利的實施方案，四價疫苗包含IO5 CCID50的Chimerivax DEN_1、2 和 3 以及 IO3 CCID5tl 的 Chimerivax DEN-4。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在0. 5ml的單位劑量體積中給予包含5± Ilogltl CCID5tl編碼登革血清型I、2、3和4的prM和E基因的減毒Chimerivax病毒的四價登革疫苗組合物。單位劑型的配制本發(fā)明的疫苗組合物還可以包含一種或多種藥用載體(vehicle)。術(shù)語“載體”指通常用于藥物和疫苗的制劑以增強活性試劑的穩(wěn)定性、無菌性和遞送能力的化合物。合適的載體以及它們的制備描述于例如Remington' s Pharmaceutical Sciences (Remington藥物科學(xué))，第 16 版，A.Osol,編輯，Mack Publishing Co. , Easton, PA(1980)和Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 19 版,A. R. Gennaro,編輯,Mack PublishingCo. , Easton, PA (1995)中。當(dāng)疫苗組合物被配制為溶液或混懸液時，免疫活性試劑被提供在藥用載體中，優(yōu)選水性載體?？梢允褂枚喾N水性載體，例如水、緩沖的水、0. 8%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等?？梢酝ㄟ^常規(guī)、已知的技術(shù)對這些組合物進(jìn)行殺菌，所述技術(shù)包括經(jīng)由0. 2微米孔濾膜的無菌過濾?？梢詫⑺玫乃芤好芊庖怨┦褂?。備選地，可以將水溶液凍干，在給藥前，利用無菌水溶液使凍干的制劑重建。根據(jù)近似生理條件的需要，疫苗組合物可以任選地包含藥用輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸脫水山梨糖酯(sorption monolaurate)、三乙醇胺油酸酯、人血清清蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L-精氨酸鹽酸鹽、蔗糖、無水D-海藻糖、山梨糖醇、三(羥甲基)氨基甲烷和/或尿素。此外，疫苗組合物可以任選包含藥用添加劑，所述藥用添加劑包括例如稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。本發(fā)明的疫苗組合物的單位劑量制劑可以包含在產(chǎn)品試劑盒中，所述產(chǎn)品試劑盒包含凍干形式的疫苗病毒和用于使凍干產(chǎn)物重建的溶液。本發(fā)明的重組病毒可以通過常規(guī)程序凍干和重建。這種用于使凍干的疫苗組合物重建的溶液可以是包含緩沖劑、有機或無機鹽以及增溶劑的水溶劑。佐劑疫苗組合物可以任選地包含一種或多種佐劑以增強疫苗組合物在哺乳動物中的免疫原性。合適的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠或磷酸鋁或明礬，但是也可以是鈣、鎂、鐵或鋅的鹽，或者可以是?；野彼峄蝓；?、陽離子或陰離子衍生化的糖類，或聚磷腈的不溶的混懸劑。備選地，佐劑可以是水包油乳劑佐劑(EP 0399843B)，以及水包油乳劑和其他活性試劑的組合(W0 95/17210 ；W0 98/56414 ；W0 99/12565 ；W0 99/11241)。已經(jīng)描述了其他油乳劑佐劑，如油包水乳劑(美國專利號5，422，109 ;EP 0480982B2)和水包油包水(water-in-oi 1-in-water)乳劑(美國專利號 5，424，067 ；EP 0480981B)。這種佐劑的實例包括 MF59、AF03、AF04、AF05、AF06 及其衍生物。備選地，佐劑可以是皂苷、脂質(zhì)A或其衍生物、免疫刺激寡核苷酸、烷基葡萄糖酰胺磷酸酯。水包油乳劑或其組合。皂苷的實例包括QuiI A及其經(jīng)純化的片段如QS7和QS21。給藥途徑本發(fā)明的疫苗組合物的給藥或共同給藥可以通過經(jīng)皮、皮下、肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射實現(xiàn)?？梢允褂贸Ｒ?guī)皮下注射器或安全注射器如可購自Becton DickinsonCorporation (Franklin Lakes, NJ, USA)的那些或射流式注射泵(jet injector)來給藥疫苗組合物。對于皮內(nèi)給藥，可以采用常規(guī)皮下注射器，使用Mantoux技術(shù)，或也可以被采用專門的皮內(nèi)遞送設(shè)備如BD Soluvia 微注射系統(tǒng)(Becton Dickinson Corporation,Franklin Lakes, NJ, USA)。給藥方案、
在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含登革的四種血清型的疫苗登革組合物與MMR疫苗一起共同給藥于有免疫力的哺乳動物。在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含登革的四種血清型的疫苗登革組合物與單價麻疹疫苗一起共同給藥于有免疫力的哺乳動物。在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含登革的四種血清型的疫苗登革組合物與MMRV疫苗一起共同給藥于有免疫力的哺乳動物。術(shù)語共同給藥是指在3天、2天、24小時、12小時、6小時、3小時、2小時、I小時、30分鐘、15分鐘內(nèi)或同時將組合物給藥于個體。在一個實施方案中，在一個實施方案中，有免疫力的哺乳動物是年齡小于48、36或24個月的人。在一個實施方案中，本發(fā)明提供多步給藥方案。在Ttl時刻進(jìn)行登革疫苗組合物和單價麻疹、MMR或MMRV疫苗組合物的起始的共同給藥，并且可以在Ttl后的約1、2、3、4、5、
6、7、8或9個月的日期通過登革的四種血清型的疫苗登革組合物的第二次給藥的給藥來加強。在一個實施方案中，此起始共同給藥事件可以通過如下給藥來補充在Ttl后的約1、2、
3、4、5、6、7、8或9個月的日期的登革的四種血清型的疫苗登革組合物的第二次給藥(在被稱為T1的日期給藥此第二次給藥)以及在T1后的約1、2、3、4、5、6、7、8或9個月的日期的 登革的四種血清型的疫苗登革組合物的第三次給藥(在被稱為T2的日期給藥此第三次給藥)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供這樣的給藥方案，其中在T1和T2之間的中間時間點，哺乳動物被給藥以包含白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原(本文中稱為"組合(combo)")疫苗的疫苗組合物。在T1后的約1、2、3、4、5或6個月的日期給藥該組合疫苗，然后繼之以在T2給藥四價疫苗登革組合物。在如本文所示例的本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)以下步驟，針對登革的四種血清型、流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹對人進(jìn)行免疫(I)在Ttl時刻，給人在一只手臂中皮下注射0. 5ml體積的CYD DEN12、3、4血清型中每種的量為IO5+1 CCID5tl的四價疫苗并且在另一支手臂中皮下注射以MMR疫苗。兩次注射在3個小時內(nèi)進(jìn)行。在一個實施方案中，該人在Ttl時刻的年齡小于36個月。在一個實施方案中，MMR 疫苗是 Trimo vax (Sanofi Pasteur Lyon FR)。(2)在Ttl后的約六個月(T1時刻)，接受了上述初始免疫的相同的人接受體積為
0.5ml的四價疫苗登革組合物的第二次皮下給藥，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN
1、2、3、4血清型中每種的量為1055+1CCID50 0在此時刻不需要給藥MMR疫苗。(3)在1\后的約六個月(T2時刻)，接受了上述初始免疫的相同的人接受體積為
0.5ml的四價疫苗登革組合物的第二次皮下給藥，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN
12、3、4血清型中每種的量為IO5+1 CCID50 0在此時刻不需要給藥MMR疫苗。本發(fā)明還提供基本根據(jù)上述三步時間表的備選的免疫時間表，該免疫時間表在T1和丁2之間的中間時間點加入額外的利用"組合"疫苗的免疫。優(yōu)選地，在T1(給藥第二劑DEN-1、2、3、4組合物)后的約3個月的時間點，給相同的人肌肉內(nèi)注射"組合"疫苗。在一個實施方案中，組合疫苗是在0. 5ml的體積中除了賦形劑和氫氧化鋁佐劑還包含以下各項的藥物制劑至少30IU白喉類毒素、至少40IU破傷風(fēng)類毒素，約25微克百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)百日咳類毒素和絲狀血細(xì)胞凝集素抗原、約40DU失活的I型脊髓灰質(zhì)炎病毒、約40DU失活的I型脊髓灰質(zhì)炎病毒、約8DU失活的2型脊髓灰質(zhì)炎病毒、約32DU失活的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒和約10微克的與破傷風(fēng)毒素綴合的b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的多糖。組合疫苗可以是Pentaxim (Sanofi Pasteur,LyonFR)。在組合疫苗給藥(T2)后的約三個月的時間點，相同的人接收體積為0.5ml的四價疫苗登革組合物的第三次皮下給藥，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN I至4血清型中每種的量為IO5+1 CCID500在此時刻不需要給藥MMR疫苗。在上述給藥方案期間選擇的時間點以及在其后限定的時間點從人身上采集血液樣品。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的說明和技術(shù)的教導(dǎo)，將來自這種樣品的血清分離并評估針對在給藥方案中被給藥的抗原的中和抗體的存在。疫苗登革組合物、MMR疫苗和/或"組合"疫苗的加強給藥可以在上述給藥方案后給予以在該哺乳動物中保持可靠的免疫保護(hù)。這種加強給藥可以發(fā)生在約I年、2年、3年、4年、5年、10年或更長的時間點。
免疫試劑盒根據(jù)另一方面，本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種試劑盒以實現(xiàn)針對登革熱的四種血清型病毒、流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含關(guān)于提出的免疫方法所述的疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒因此包括包含容納組合物或疫苗的多種容器的盒并且有利地包括說明冊，所述說明冊包含用于給藥所述組合物或疫苗的有用信息。術(shù)語容器包括常規(guī)密封小瓶和預(yù)填充的注射器。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明因此涉及用于針對登革血清型1、2、3和4以及(I)麻疹或(2)麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹或(3)麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和VZV的免疫的試劑盒，所述試劑盒包括盒，所述盒至少包含分別容納單價麻疫、三價MMR或四價MMRV疫苗的(a)第一容器，以及容納四價登革疫苗的(b)第二容器?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的試劑盒的疫苗組合物包括本文中關(guān)于本發(fā)明的免疫方法所述的疫苗組合物。如果疫苗組合物以凍干形式提供，則該試劑盒將有利地包含至少一個額外的容器，所述至少一個額外的容器容納可用于使適于通過皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下或肌肉內(nèi)給藥而給藥的凍干的疫苗組合物重建的溶液。藥用稀釋劑和載體可用于重建。根據(jù)特別的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含四價疫苗，所述四價疫苗包含IO5+1 CCID50 的 Chimerivax DEN-U2,3 和 4。其中在使用前封裝有藥物制劑的容器可以包括氣密容器，所述氣密容器封裝有一定量的適于其藥物有效劑量或有效劑量的倍數(shù)的凍干制劑或包含制劑的溶液。藥物制劑封裝在無菌容器中，并且氣密容器被設(shè)計成保持藥物制劑的無菌性直到使用。任選地，該容器可以結(jié)合給藥工具和或使用說明。給藥工具的實例可以包括用于腸胃外給藥的注射器或促進(jìn)皮內(nèi)給藥的遞送系統(tǒng)。藥物劑型給藥的疫苗組合物的體積將取決于給藥的方法。在皮下注射的情況中，該體積通常為0. I至I. 0ml，優(yōu)選約0. 5ml。給藥所有血清型I至4的最佳時期是在對登革熱病毒的潛在暴露之前約I至3個月。本發(fā)明的組合物可以作為針對登革熱病毒感染的預(yù)防性治療給藥于成人和兒童。目標(biāo)人群因此包括對于登革熱病毒是首次的(nai_ve)(即之前未被免疫)或非首次的人。也可以例如在上次給予免疫后的6個月至10年，例如6個月、I年、3年、5年或10年，使用血清型I至4的登革熱疫苗病毒的加強給藥。
實施例以下實例用于說明本發(fā)明的實施而非意在限制如以上提供的本發(fā)明的實施的范圍。實施例I :收集和保存血清樣品根據(jù)歐洲關(guān)于動物實驗的指導(dǎo)在猴子上進(jìn)行實驗。在源自毛里塔尼亞的獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))上進(jìn)行免疫。在免疫前將猴子隔離六周。使用0. 5ml疫苗組合物在猴的手臂中對猴子進(jìn)行免疫。在用氯胺酮(ketamine) (Imalgene, Merial)輕度麻醉后,通過穿刺腹股溝靜脈或 隱靜脈收集血液。在每次免疫后的第0天和第28天，采樣5ml血液以便評估抗體應(yīng)答。在冰上收集血液并保存在冰上直到通過在4°C離心20分鐘來分離血清。將血清保存在_80°C直到測試時。實施例2 :測量登革中和抗體在96孔板中，在每孔中，將基本根據(jù)實施例I分離的0. 120ml各種去補體血清加入到0. 480ml稀釋劑(ISCOVE 4% SVF)中。通過將0. 150ml血清轉(zhuǎn)移到0. 450ml稀釋劑中來進(jìn)行因子6的連續(xù)稀釋。將450 ill含2. 71og10 CCID50/ml的病毒稀釋液加入到每孔中以致獲得25 CCID50/孔。將平板在37°C孵育I小時。然后將0. Iml的各個稀釋液分配到96孔板的6個孔中，在所述孔中在實驗開始前VERO細(xì)胞已經(jīng)以8000細(xì)胞/孔的濃度在0.1ml ISCOVE 4% SVF培養(yǎng)基中接種3天。在37°C、在5% CO2的存在下孵育6天后，在4°C使用乙醇/丙酮(70/30)混合物將細(xì)胞固定15分鐘，然后在PBS中洗滌3次并在37°C在0. 05ml抗黃病毒單克隆抗體(mAb 4G2，獲得自ATCC H-Bl 12雜交瘤)的1/2000稀釋液的存在下孵育I小時。然后將平板洗滌兩次并在37°C在0. 05ml與堿性磷酸酶綴合的抗鼠IgG的1/1000稀釋液的存在下孵育I小時。通過加入0. 05ml染色底物BCIP/NBT來顯示溶菌曬斑(lysis plaque)。使用以下定義的Karber公式計算中和抗體效價Log10SN50 = d+f/N(X+N/2)，其中d :表示提供100%中和(即6次重復(fù)為陰性，即未呈現(xiàn)感染跡象)的稀釋f :將稀釋因子表示為Iogltl (例如如果稀釋因子為I 4,則f = 0.6)N:表示重復(fù)/稀釋的數(shù)目(N = 6)X :沒有感染跡象的孔的總數(shù)，除了稀釋d以外。病毒檢測的極限是10SN50(即I. 01og1(lSN50)。用于中和的病毒株是毒株DENl16007,DEN2 1668UDEN3 16562或DEN4 1036。在對照的情況中，重新確定初始病毒稀釋液的效價。在SN50測試中測量的中和效價與在PRNT50測試中常規(guī)測量的中和效價之間的相關(guān)性為log10PRNT50 = log10SN50+0. 2。實施例3確定麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹抗體通過ELISA在MMF疫苗接種28天后收集的血清中測量針對麻疹、風(fēng)疹和流行性腮腺炎的抗體水平。簡言之，將預(yù)吸附有抗原的96孔板暴露于血清。測試樣品中的IgG抗體與預(yù)吸附的抗原結(jié)合?？谷薎gG綴合物與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。除去過量的綴合物并加入比色底物。綴合物的酶組分催化水解反應(yīng)，所述水解反應(yīng)將底物轉(zhuǎn)化并且產(chǎn)生顏色變化。在限定的時間點將反應(yīng)猝滅。顏色的強度與樣品中病毒特異性IgG抗體的活性成比例。包含于樣品中的病毒特異性IgG抗體的活性通過使用參比標(biāo)準(zhǔn)(可自世界衛(wèi)生組織獲得)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)邏輯回歸函數(shù)來進(jìn)行量化。結(jié)果以mIU/mL報告，此測定的定量的下限是 120mIU/mL。實施例4 制備 Chimerivax通過在Vero細(xì)胞中擴增每種血清型來制備每種單價Chimerivax 登革熱疫苗病毒(血清型1、2、3和4)。更具體地，在無血清培養(yǎng)基中在貼壁Vero細(xì)胞中分別制備四種病毒。然后將通過過濾從細(xì)胞碎片中凈化的病毒收獲物濃縮并通過超濾和層析進(jìn)行純化以去除來自宿主細(xì)胞的DNA。在加入穩(wěn)定劑后，在使用前將疫苗株以冷凍或凍干形式保存然后當(dāng)需要時將其重建。將相同的過程施用于四種嵌合體。實施例5登革MMR血清免疫基本根據(jù)以下程序來實現(xiàn)針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和登革病毒的四種血清型的免疫。使用23G1針在手臂中經(jīng)皮下進(jìn)行四價登革疫苗組合物的初始接種，0. 5ml體積的四價疫苗中CYD DEN I至4血清型中每種的含量為IO5+1 CCID5tl，并且接種包含至少1000CCID5tl麻疹病毒(Schwarz株)、至少5000 CCID5tl流行性腮腺炎病毒(Urabe AM-9株)和至少Ioooccid5q風(fēng)疹病毒(ffistar RA 27/3M)的體積為0. 5ml的MMR疫苗。通過在I小時內(nèi)將每種疫苗組合物的0. 5ml樣品經(jīng)皮下給藥到年齡小于24個月的人類的每個手臂中來完成四價登革疫苗組合物和MMR疫苗的給藥。MMR疫苗可以是Trimovax (Sanofi PasteurLyon FR)。通過在第一次給藥后大約六個月經(jīng)皮下給藥0. 5ml體積的四價疫苗登革組合物來給接種有上述共同給藥的組合物的相同的人第二次接種，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN I至4血清型中每種的量為105+1CCID5(i。在此時不給藥MMR疫苗。在上述第二次皮下給藥四價疫苗登革組合物后大約六個月的時間，通過體積為
0.5ml的四價疫苗登革組合物的皮下給藥來給相同的人第三次接種，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN I至4血清型中每種的量為IO5+1 CCID500在上述給藥方案期間選擇的時間點以及在其后限定的時間點從人身上采集血液樣品。根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的說明和技術(shù)的教導(dǎo)，將來自此類樣品的血清分離并評估針對被給藥的抗原的中和抗體的存在。數(shù)據(jù)顯示針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹病毒和登革病毒的四種血清型的免疫。實施例6登革MMR組合免疫(Combo Immunization)針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、登革病毒的四種血清型以及白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原的免疫基本根據(jù)以下程序來實現(xiàn)。使用23G1針在手臂中經(jīng)皮下進(jìn)行初始的共同給藥，給受試者接種0. 5ml體積的四價疫苗，所述四價疫苗中的CYDDEN I至4血清型中每種的量為IO5+1 CCID50,并且給受試者接種0. 5ml體積的MMR疫苗Trimovax (Sanofi Pasteur),所述 MMR 疫苗包含至少 1000 CCID5tl 麻疫病毒(Schwarz株)、至少5000 CCID5tl流行性腮腺炎病毒(Urabe AM-9株)和至少1000CCID50風(fēng)疹病毒(ffistar RA 27/3M)。通過在I小時內(nèi)將每種疫苗的0. 5ml樣品經(jīng)皮下給藥到年齡小于24個月的人類的每個手臂中來完成四價登革疫苗和MMR疫苗的給藥。通過在第一次給藥后大約六個月經(jīng)皮下給藥0. 5ml體積的四價疫苗登革組合物，接受了上述四價疫苗登革組合物和MMR疫苗的初始共同給藥的相同的人接受登革疫苗組合物的第二次接種，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN I至4血清型中每種的量為IO5+1 CCID50 0在此時不給藥MMR疫苗。在第二次四價登革疫苗給藥后的大約3個月，通過肌肉內(nèi)注射“組合”疫苗來給相同的人接種，所述“組合”疫苗是在0. 5ml的體積中除了賦形劑和氫氧化鋁佐劑還包含以下各項的藥物制劑至少30IU白喉類毒素、至少40IU破傷風(fēng)類毒素，大約25微克博德特氏菌(Bordatella)百日咳類毒素和絲狀血細(xì)胞凝集素抗原、大約40DU失活的I型脊髓灰質(zhì)炎病毒、大約40DU失活的I型脊髓灰質(zhì)炎病毒、大約8DU失活的2型脊髓灰質(zhì)炎病毒、大約32DU失活的3型脊髓灰質(zhì)炎病毒和大約10微克的與破傷風(fēng)毒素綴合的b型流感嗜血菌的多糖。組合疫苗可以是PentaxilTl (Sanofi Pasteur, Lyon FR)。
在組合疫苗給藥后的大約三個月的時間，相同的人接受體積為0. 5ml的四價疫苗登革組合物的第三次皮下給藥，所述四價疫苗登革組合物包含的CYD DEN I至4血清型中每種的量為IO5+1 CCID500在上述給藥方案期間選擇的時間點以及在其后限定的時間點從人身上采集血液樣品。根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的說明和技術(shù)的教導(dǎo)，將來自這樣樣品的血清分離并評估針對被給藥的抗原的中和抗體的存在。數(shù)據(jù)顯示針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹病毒、白喉、百日咳、Hib、破傷風(fēng)和登革病毒的四種血清型的免疫。實施例7麻疹和登革免疫基本根據(jù)上文中實施例5的教導(dǎo)來實現(xiàn)針對麻疹和登革病毒的四種血清型的免疫，不同之處在于用單價麻疹疫苗代替MMR疫苗。實施例8麻疹、登革和組合免疫基本根據(jù)上文中實施例6的教導(dǎo)來實現(xiàn)針對麻疹、登革病毒的四種血清型以及白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原的免疫，不同之處在于用單價麻疹疫苗代替MMR疫苗。實施例9MMRV和登革免疫基本根據(jù)上文中實施例5的教導(dǎo)來實現(xiàn)針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和VZV以及登革病毒的四種血清型的免疫，不同之處在于用四價MMRV疫苗代替MMR疫苗。實施例IOMMRV、登革和組合免疫基本根據(jù)上文中實施例6的教導(dǎo)來實現(xiàn)針對麻疹、流行性腮腺炎、風(fēng)疹和VZV、登革病毒的四種血清型以及白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎和Hib抗原的免疫，不同之處在于用MMRV麻疹疫苗代替MMR疫苗。
權(quán)利要求
1.在哺乳動物中誘導(dǎo)針對登革熱的四種血清型、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒和風(fēng)疹的中和抗體的方法，所述方法包括向所述哺乳動物給藥登革的四種血清型的疫苗登革病毒并且共同給藥MMR疫苗組合物。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述給藥登革的四種血清型的疫苗登革病毒通過給藥四價疫苗病毒組合物來實現(xiàn)。
3.權(quán)利要求I所述的方法， 其中所述給藥登革的四種血清型的疫苗登革病毒通過共同給藥兩種雙價疫苗登革病毒組合物來實現(xiàn)。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述四價疫苗病毒組合物包含Chimerivax DEN-U2,3和4。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中血清型1、2、3和4的登革熱的疫苗病毒的量在IO3至IO6 CCID50的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述MMR疫苗組合物是三價MMR疫苗組合物。
7.針對登革熱、流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹的免疫試劑盒，所述免疫試劑盒包含盒，所述盒至少包含(a)容納三價MMR疫苗的第一容器，(b)容納四價疫苗的第二容器，所述四價疫苗包含登革熱的四種血清型的疫苗病毒。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒，其還包含第三容器，所述第三容器容納用于重建的溶劑。
9.權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其中所述容器是預(yù)填充的注射器。
10.四價登革和三價MMR疫苗病毒在制備用于針對登革、流行性腮腺炎、麻疹和風(fēng)疹病毒進(jìn)行免疫的疫苗中的用途，其中所述四價疫苗包含登革的四種血清型的疫苗病毒，并且在給藥所述MMR疫苗病毒的3天內(nèi)給藥所述四價登革疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供在哺乳動物中誘導(dǎo)針對血清型的登革病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、風(fēng)疹和/或VZV病毒的方法和組合物。
文檔編號A61K39/295GK102740879SQ201180008304
公開日2012年10月17日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者A·布克諾格, D·克勒瓦, R·福拉特 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司