專利名稱：一種含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑，屬于生物制藥領(lǐng)域。具體地說涉及金屬硫蛋白的新用途，即一種以金屬硫蛋白為主要成份的試劑，用于血液灌流治療時(shí)對(duì)人體血液細(xì)胞的保護(hù)，以及由細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或減少引起疾病的細(xì)胞療法中對(duì)相應(yīng)所培養(yǎng)、擴(kuò)增細(xì)胞，或于相應(yīng)組織、器官所移植、增生細(xì)胞的保護(hù)。這些由細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或減少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、老年癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、心衰竭、突發(fā)性血小板減少癥、心臟術(shù)后急性腎損傷、化療藥物引起的血細(xì)胞減少癥、肺纖維化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨壞死癥、肝炎、再生障礙性貧血、骨折、癱 瘓、大腦損傷修復(fù)、急性心肌梗塞、軟骨損傷等。
背景技術(shù)：
細(xì)胞的損傷或減少是多種疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵致病機(jī)理。如神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性物質(zhì)6-羥基多巴胺(6-0HDA)引起神經(jīng)細(xì)胞對(duì)該毒物的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致位于中腦部位"黑質(zhì)"中的多巴細(xì)胞發(fā)生病理性改變，結(jié)果引起相應(yīng)多巴細(xì)胞損傷、死亡以及數(shù)量減少，多巴胺的合成量降低、對(duì)乙酰膽堿的抑制功能降低、乙酰膽堿的興奮作用相對(duì)增強(qiáng)，從而發(fā)生帕金森病癥狀；又如抗腫瘤藥物順鉬等在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞特別是骨髓造血細(xì)胞也有殺傷作用，造成血細(xì)胞減少癥白細(xì)胞減少會(huì)使機(jī)體抵御外來感染能力降低，紅細(xì)胞減少會(huì)造成貧血，血小板減少則可導(dǎo)致機(jī)體了出血等。長期以來，西方醫(yī)學(xué)倡導(dǎo)“對(duì)抗療法”治療疾病細(xì)菌感染消滅細(xì)菌，病毒感染消滅病毒，血管堵塞消除堵塞，器官損壞切除器官等。其實(shí)很多疾病的康復(fù)高度依據(jù)人自身的免疫系統(tǒng)和再生機(jī)制。人體自身具有一定的自我修復(fù)功能。如感冒后吃感冒藥物僅僅消除了頭暈、發(fā)熱、咳嗽等癥狀，主要還是靠人體內(nèi)免疫細(xì)胞去消滅感冒病毒。創(chuàng)傷后傷口經(jīng)過抗菌、消炎等處理不再感染，可是以后的傷口愈合，則需要人體自身干細(xì)胞遷移到此處，通過自身再生細(xì)胞修復(fù)受傷組織。人體內(nèi)這兩種非常重要的細(xì)胞一免疫細(xì)胞和干細(xì)胞在疾病治療中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用免疫細(xì)胞像是抵御身體內(nèi)外致病原的侵襲，干細(xì)胞則起到對(duì)病灶的緊急救援與損傷修復(fù)。許多藥物治療主要是借助對(duì)人體自身免疫細(xì)胞和干細(xì)胞這兩大細(xì)胞體系的調(diào)動(dòng)。但是，在同樣多的情況下，不管是否使用外界藥物，人體自身干細(xì)胞或免疫細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量、功能是有限的；或者說其數(shù)量、質(zhì)量、功能不足以治療很多組織、器官損傷疾病。這就需要利用細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增等專門的技術(shù)處理甚至基因修飾，以得到足夠數(shù)量、質(zhì)量、功能的免疫細(xì)胞，以及分化或未分化的干細(xì)胞。醫(yī)生可以用培養(yǎng)好的結(jié)構(gòu)與功能正常的免疫細(xì)胞、未分化干細(xì)胞、或已衍生分化干細(xì)胞當(dāng)作“藥物”輸送給患者，以修復(fù)細(xì)胞受損或減少的組織與器官；經(jīng)過專門處理的以上細(xì)胞到達(dá)受損組織臟器的一種途徑是通過人體靜脈注射、血液循環(huán)，以治療神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病、肺纖維化、肝硬化、糖尿病等細(xì)胞嚴(yán)重受損或減少的疾病。細(xì)胞療法方興未艾。例如，人們新近開發(fā)的生物免疫細(xì)胞療法，主要根據(jù)細(xì)胞與分子免疫學(xué)原理，通過細(xì)胞因子，誘發(fā)人體自身樹突狀抗原提呈細(xì)胞(DC)產(chǎn)生殺傷細(xì)胞(CIK)，殺滅乙肝病毒，阻止肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌進(jìn)程。目前的抗病毒藥物治療，其作用是抑制病毒復(fù)制，消除或減輕肝臟的炎癥、壞死來阻延疾病的進(jìn)展，但對(duì)于有些患者而言，單純采用藥物并沒有阻止其病情的發(fā)展，問題主要出在自身的免疫系統(tǒng)，也就是自身免疫細(xì)胞不清除病毒，醫(yī)學(xué)上稱為“免疫耐受”，導(dǎo)致乙肝的久治不愈。只有打破免疫耐受，恢復(fù)人體免疫細(xì)胞的功能，激活和不斷增強(qiáng)自身免疫功能殺傷病毒的能力，才能從根源上得到有效治療。而具有免疫殺傷作用的特異性細(xì)胞T淋巴細(xì)胞(CTL)，可對(duì)HBV進(jìn)行精確性、特異性、靶向性、主動(dòng)性攻擊，殺滅體內(nèi)HBV病毒。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的樹突狀抗原提呈細(xì)胞-殺傷細(xì)胞技術(shù)可望將患者自身血液中的單個(gè)核細(xì)胞通過專門的細(xì)胞采集設(shè)備提取出來，在體外經(jīng)過培養(yǎng)，使其增殖、分化成具有特異性殺傷活性的細(xì)胞，恢復(fù)其對(duì)乙肝病毒的殺傷功能，再回輸?shù)交颊咦陨眢w內(nèi)，可以起到免疫重建、增強(qiáng)自體免疫功能的作用。另一項(xiàng)成功的細(xì)胞療法已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床治療人們用一種細(xì)胞治療修復(fù)損傷的膝關(guān)節(jié)，其技術(shù)是取自體受累關(guān)節(jié)的正常軟骨細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增培養(yǎng)3-4周，再植入損傷膝關(guān)節(jié)。
可是，細(xì)胞療法仍存在很多技術(shù)難題需要攻克，主要是衍生分化或未分化干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等體外擴(kuò)增效率低。例如，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)的成功率低至萬分之一，十萬個(gè)細(xì)胞中成功4-5個(gè)，且耗時(shí)很長。有關(guān)研究人員使用轉(zhuǎn)錄因子將iPS的誘導(dǎo)效率提高很多，但所用的轉(zhuǎn)錄因子含致癌基因，用于治療將存在極大的安全隱患。移去該致癌基因轉(zhuǎn)錄因子后，效率又回到原來的萬分之一水平。骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(bone marrow stromalcells-derived neural stem cells,BMSCs-d-NSCs)因其取材相對(duì)容易、致瘤風(fēng)險(xiǎn)低、避免倫理爭議、可自體移植，更貼近未來臨床應(yīng)用。但因其為非神經(jīng)組織來源，須經(jīng)體外誘導(dǎo)、分化及調(diào)控階段，復(fù)雜的體外條件下細(xì)胞容易發(fā)生細(xì)胞損傷導(dǎo)致衰退和死亡，導(dǎo)致細(xì)胞存活率很低。很顯然，開發(fā)一種普遍有效的防止不同培養(yǎng)階段細(xì)胞衰退、損傷、死亡的方法，是細(xì)胞療法成敗的關(guān)鍵。另一種需要細(xì)胞保護(hù)的普遍情形出現(xiàn)在近年來逐漸得到應(yīng)用的血液灌流療法上。針對(duì)尿毒癥、危重癥、中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等眾多疾病進(jìn)行血液灌流治療時(shí)，為防止微細(xì)吸附劑進(jìn)入末梢血液毛細(xì)管，需將血液灌流器中的吸附劑壓得很實(shí)，這樣，在將肌酐、有機(jī)酚類、胍類、巴比妥類藥物等有毒藥物、農(nóng)藥、膽紅素、嗎啡、內(nèi)毒素、血脂、DNA等毒物從血液中除去時(shí)，會(huì)發(fā)生血流通過吸附劑床層時(shí)經(jīng)受高剪切壓力、原來附著在細(xì)胞表面的內(nèi)在保護(hù)劑脫落等情況，引起細(xì)胞氧化損傷。血液灌流療法的一項(xiàng)重要技術(shù)指標(biāo)是血液細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的存活率。為提高血液灌流療法的效率，需要細(xì)胞保護(hù)劑來保護(hù)，以防止血液細(xì)胞，尤其是血紅細(xì)胞的損傷與死亡。金屬硫蛋白是符合以上兩大類應(yīng)用條件的廣譜保護(hù)劑。金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸基團(tuán)，對(duì)多種重金屬有高度親和性，在一定的酸堿度(pH值)及細(xì)胞氧化-還原電位環(huán)境(可藉細(xì)胞器某處谷胱甘肽有還原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例顯示)條件下易與多個(gè)鎘、鋅等金屬離子結(jié)合的多肽蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物的金屬硫蛋白由約61個(gè)氨基酸組成，含有20個(gè)半胱氨酸和7個(gè)金屬離子。金屬硫蛋白作為一種應(yīng)激蛋白、抗自由基氧化劑、細(xì)胞鋅離子介導(dǎo)劑等，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝、排鉛補(bǔ)鋅、抗輻射、延緩衰老、保護(hù)人體心肺各器官等多種獨(dú)特有效的生物學(xué)功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，針對(duì)血液灌流時(shí)血液細(xì)胞受損傷，以及細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及細(xì)胞移植后于相應(yīng)組織、器官生長過程中受到的損傷、成活率低等問題，提出一種細(xì)胞保護(hù)劑以及使用該保護(hù)劑用于血液灌流療法，以及治療與嚴(yán)重細(xì)胞損傷或減少的疾病的細(xì)胞移植療法或稱細(xì)胞療法，包括這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及細(xì)胞移植后于相應(yīng)組織、器官前后保護(hù)的方法。這一方法具有如下一種或一種以下具體特征I.本發(fā)明所述的細(xì)胞保護(hù)劑是以金屬硫蛋白為主要有效成份，金屬硫蛋白的濃度為 O. 001 μ M-IOOmM,優(yōu)選濃度為 I μ M-IO μ Μ。2.本發(fā)明所述的金屬硫蛋白可以是天然的、基因重組表達(dá)的、或它們的組合物。3.本發(fā)明所述的金屬硫蛋白包括動(dòng)物、植物等各種來源的金屬硫蛋白提取物、半 成品、各種百分含量比例的粗品、各種純度的純品、各種純度的精品等。4.本發(fā)明所述的金屬硫蛋白尤其包括人源化金屬硫蛋白，即人源化金屬硫蛋白-I (hMT-Ι)、人源化金屬硫蛋白_2 (hMT-2)、人源化金屬硫蛋白_3 (hMT-3)、人源化金屬硫蛋白-4(hMT-4)的一種或兩種以上組合物。5.本發(fā)明所述的金屬硫蛋白包括存在于一切藥物載體上的金屬硫蛋白；這些載體包括脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、柔性納米脂質(zhì)體、聚乙二醇等。6.本發(fā)明所述的基因重組表達(dá)包括但不限于經(jīng)過基因突變、蛋白質(zhì)修飾(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所謂硒金屬硫蛋白)、蛋白質(zhì)融合，以及各種為數(shù)眾多的細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)物。7.本發(fā)明所述的基因重組表達(dá)金屬硫蛋白主要包括人源化金屬硫蛋白，也就是說所表達(dá)的基因?yàn)槿私饘倭虻鞍谆颉?.本發(fā)明所述的基因重組表達(dá)包括由一定的商業(yè)或非商業(yè)化基因重組表達(dá)載體于細(xì)菌、酵母、藻類、昆蟲、病毒、植物、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。9.本發(fā)明所述的商業(yè)或非商業(yè)化基因重組表達(dá)載體包括存在于一定基因表達(dá)載體的可表達(dá)金屬硫蛋白的基因克隆。10.本發(fā)明所述的動(dòng)物包括人以及兔、豬、羊、牛、魚、蝦等可食用動(dòng)物。11.本發(fā)明所述的細(xì)胞包括但不限于來源于骨髓、脊髓、臍帶血、胚胎肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞，以及干細(xì)胞及干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞。12.本發(fā)明所述的干細(xì)胞包括但不限于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血多能干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)等。13.本發(fā)明所述的干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞，其特征在于，所述的干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞包括但不限于血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、粒單細(xì)胞、巨核細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腎細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。14.本發(fā)明所述的細(xì)胞療法包括但不限于干細(xì)胞療法、免疫細(xì)胞療法、細(xì)胞介導(dǎo)的基因療法、基因工程靶向細(xì)胞療法等。15.本發(fā)明所述的血液灌流器吸附劑包括但不限于各種改性或非改性活性炭、各種改性或非改性高分子樹脂、聚苯乙烯樹脂、改性聚苯乙烯樹脂、陽離子樹脂、纖維素樹脂、大孔吸附樹脂、免疫吸附柱、親和吸附柱、瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠等。
16.本發(fā)明所述的血液灌流療法包括但不限于對(duì)尿毒癥、危重癥、中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等疾病的治療，即是通過血液灌流器于體外將這些病人血液中的有毒分子如肌酐、有機(jī)酚類、胍類、巴比妥類藥物等有毒藥物、農(nóng)藥、膽紅素、嗎啡、內(nèi)毒素、血脂、DNA等毒物除去的過程。本發(fā)明的理論依據(jù)是細(xì)胞損傷、凋亡、壞死的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng)。金屬硫蛋白作為一種應(yīng)激蛋白、抗自由基氧化劑、細(xì)胞鋅離子介導(dǎo)劑等，可高效對(duì)抗、淬滅細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝、排鉛補(bǔ)鋅、抗輻射、延緩衰老、保護(hù)人體心肺各器官等多種獨(dú)特有效的生物學(xué)功能。本發(fā)明依據(jù)的是金屬硫蛋白突出的對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，其抗氧化能力是SOD的近5000倍、谷胱甘肽的近10000倍。
本發(fā)明的效果作用是血液細(xì)胞在體外血液灌流療法，或其它細(xì)胞培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞死亡事件中，均有凋亡、壞死兩種機(jī)制的共同參與，并多以凋亡為主。隨時(shí)間延長細(xì)胞凋亡和壞死情況均逐漸增多金屬硫蛋白可以明顯減少體外培養(yǎng)細(xì)胞的損傷、凋亡和壞死。特別是以濃度為I. O μ M、2. O μ M的金屬硫蛋白培養(yǎng)細(xì)胞，更具明顯的抗氧化作用，能夠減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞損傷、凋亡和壞死事件的發(fā)生，更好地改善其存活。含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑在血液灌流療法以及神經(jīng)干細(xì)胞等眾多細(xì)胞的體外培養(yǎng)和移植后細(xì)胞保護(hù)研究與治療中具有廣闊應(yīng)用前景。使用人源化金屬硫蛋白的明顯好處是避免免疫原性，因?yàn)槿梭w細(xì)胞本身就含有該金屬硫蛋白。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，以神經(jīng)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基促其向神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的分化，以O(shè). 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M三種濃度金屬硫蛋白添加培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-d-NSCs)，于37°C的C02孵化箱中培養(yǎng)，分別在1、2、3、4周時(shí)以Annexin V-EGFP/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以同一取材的未添加金屬硫蛋白常規(guī)培養(yǎng)的同期細(xì)胞為對(duì)照，比較各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，各金屬硫蛋白處理組較對(duì)照組活力更為旺盛，增殖速度快，細(xì)胞凋亡和壞死情況減少。培養(yǎng)2周時(shí)各組間凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例均有明顯差異；1μΜ、2μΜ金屬硫蛋白處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組。培養(yǎng)3周時(shí)各組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例差異更顯著；各金屬硫蛋白處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組，且I μ Μ、5μ M處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例也少于O. 5 μ M處理組。這些結(jié)果表明金屬硫蛋白可以減少體外培養(yǎng)BMSCs-d-NSCs的凋亡和壞死，特別是以I. O μ Μ_5. O μ M金屬硫蛋白培養(yǎng)細(xì)胞，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞的凋亡和壞死事件的發(fā)生。實(shí)施例二 取Balb/c小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用血漿凝塊法，將細(xì)胞(2xl05/培養(yǎng)皿)加入含10% 2-巰基乙醇，10%氯化鈣，10%牛血清白蛋白，5%豬血清，10%牛血漿的培養(yǎng)液中，并以O(shè). 5 μ Μ、I μ Μ、5 μ M三種濃度金屬硫蛋白添加培養(yǎng)液于37°C的C02孵化箱中培養(yǎng)，分別在1、2、3、4周時(shí)以Annexin V-EGFP/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以同一取材的未添加金屬硫蛋白常規(guī)培養(yǎng)的同期細(xì)胞為對(duì)照，比較各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，各金屬硫蛋白處理組較對(duì)照組活力更為旺盛，增殖速度快，細(xì)胞凋亡和壞死情況減少。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見，從I周培養(yǎng)開始各組間凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例均有明顯差異；I μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組。培養(yǎng)4周時(shí)各組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例也均有明顯差異；各金屬硫蛋白處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組，且I μ Μ、5 μ M處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例也少于O. 5 μ M處理組。這些結(jié)果表明金屬硫蛋白可以減少體外培養(yǎng)造血干細(xì)胞的凋亡和壞死，特別是含I. O μ Μ-5. O μ M金屬硫蛋白的培養(yǎng)液，更具明顯的抗氧化損傷作用，能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞的凋亡和壞死事件的發(fā)生。實(shí)施例三取經(jīng)IV型膠原酶消化法傳代的穩(wěn)定人iPS細(xì)胞，用RT-PCR法檢測(cè)鑒定人iPS多能性基因 0CT4(上游引物 CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC，下游引物 AGAACCACACTCGGACCACATC)、 Sox2 (上游引物 CCCCCGGCGGCAAATGCA，下游引物 TCGGCGCCGGGGAGATACAT)、Nanog (上游引物GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC,下游引物 CCTTCTGCGTCACACCATTG)，并檢驗(yàn)其干細(xì)胞特征。以添加O. 5 μ Μ、1 μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白細(xì)胞保護(hù)劑的iPS干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C的C02孵化箱中培養(yǎng)。同以上實(shí)施例用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡和壞死情況。培養(yǎng)2周時(shí)各組間凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例均有明顯差異；1 μ Μ、5 μ M金屬硫蛋白處理組細(xì)胞凋亡和壞死比例均明顯少于對(duì)照組。培養(yǎng)3周時(shí)各組凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例差異更明顯。這些結(jié)果表明含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑，特別是I. O μ Μ-5. O μ M金屬硫蛋白的培養(yǎng)液，對(duì)iPS細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.一種含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑，其特征在于，以金屬硫蛋白為主要有效成份的試劑及其應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的細(xì)胞保護(hù)劑，其特征在于，所述主要有效成分金屬硫蛋白的濃度為O. OOl μ M-IOOmM,優(yōu)選濃度為I μ M-IO μ M ;所述金屬硫蛋白可以是天然的、基因工程表達(dá)的、或它們的組合物。
3.如權(quán)利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述金屬硫蛋白包括植物動(dòng)物(人以及兔、豬、羊、牛、魚、蝦等一切可食用動(dòng)物)、等各種來源的金屬硫蛋白提取物、半成品、各種百分含量比例的粗品、各種純度的純品、各種純度的精品等。
4.如權(quán)利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述的金屬硫蛋白尤其包括人源化金屬硫蛋白，即人源化金屬硫蛋白-I (hMT-1)、人源化金屬硫蛋白-2 (hMT-2)、人源化金屬硫蛋白-3 (hMT-3)、人源化金屬硫蛋白-4(hMT-4)的一種或兩種以上組合物。
5.如權(quán)利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述金屬硫蛋白包括在細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因工程表達(dá)產(chǎn)物，包括但不限于經(jīng)過基因突變、蛋白質(zhì)修飾(如硒取代硫元素的半胱氨酸、蛋氨酸后的所謂硒金屬硫蛋白)、蛋白質(zhì)融合，以及各種為數(shù)眾多的細(xì)胞工程表達(dá)產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求2所述的金屬硫蛋白，其特征在于，所述的金屬硫蛋白包括存在于一切藥物載體上的金屬硫蛋白；這些載體包括脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體、柔性納米脂質(zhì)體、聚乙二醇坐寸ο
7.如權(quán)利要求2所述的基因工程表達(dá)，其特征在于，所述基因工程表達(dá)產(chǎn)物包括存在于一定基因表達(dá)載體的可表達(dá)的基因克隆，包括由一定的商業(yè)或非商業(yè)化基因重組表達(dá)載體于細(xì)菌、酵母、藻類、昆蟲、病毒、植物、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)。
8.如權(quán)利要求2所述的基因工程表達(dá)，其特征在于，所述基因重組表達(dá)如權(quán)利要求I所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的包括但不限于來源于骨髓、脊髓、臍帶血、胚胎肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞，以及干細(xì)胞及干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞；包括但不限于體外培養(yǎng)細(xì)胞、移植到組織后的細(xì)胞、體外灌流血細(xì)胞等。
9.如權(quán)利要求8所述的干細(xì)胞，其特征在于，所述的所述的干細(xì)胞包括但不限于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血多能干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS)等；所述的干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞，其特征在于，所述的干細(xì)胞衍生分化細(xì)胞包括血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、粒單細(xì)胞、巨核細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腎細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求I所述的細(xì)胞保護(hù)劑的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于血液灌流治療尿毒癥、危重癥、中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎時(shí)對(duì)人體血液細(xì)胞的保護(hù)，以及由細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或減少引起疾病的細(xì)胞療法中對(duì)相應(yīng)所培養(yǎng)、擴(kuò)增細(xì)胞，或于相應(yīng)組織、器官所移植、增生細(xì)胞的保護(hù)。這些由細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或減少引起的疾病包括但不限于帕金森病、急性脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、老年癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、心衰竭、突發(fā)性血小板減少癥、心臟術(shù)后急性腎損傷、化療藥物引起的血細(xì)胞減少癥、肺纖維化、糖尿病、肝硬化、卵巢早衰、白血病、股骨壞死癥、肝炎、再生障礙性貧血、骨折、癱瘓、大腦損傷修復(fù)、急性心肌梗塞、軟骨損傷等。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)血液灌流時(shí)血液細(xì)胞受損傷，以及細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及細(xì)胞移植后于相應(yīng)組織、器官生長過程中受到的損傷、成活率低等問題，向人們公開了一種含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑，以及使用該保護(hù)劑用于血液灌流療法、細(xì)胞療法，包括這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及細(xì)胞移植后于相應(yīng)組織、器官前后保護(hù)的方法。這一含金屬硫蛋白的細(xì)胞保護(hù)劑可廣泛用于血液灌流治療尿毒癥、危重癥、中毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重型肝炎等疾病時(shí)對(duì)人體血液細(xì)胞的保護(hù)，以及由細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷或減少引起疾病的細(xì)胞療法中對(duì)相應(yīng)所培養(yǎng)、擴(kuò)增細(xì)胞，或于相應(yīng)組織、器官所移植、增生細(xì)胞的保護(hù)。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102634479SQ20121002516
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者汪志友 申請(qǐng)人:汪志友