專利名稱：Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物新用途技術領域，具體涉及一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的應用。
背景技術：
自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的年發(fā)病率約6 16/100000人，約占腦卒中總發(fā)病率的6 8%，顱內(nèi)動脈瘤破裂是自發(fā)性SAH的主要原因。腦血管疫攣(cerebral vasospasm, CVS)是蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后常見而危險的并發(fā)癥，?？梢饑乐氐哪X組織缺血或遲發(fā)性缺血性腦損害，甚至導致腦梗死，是致死或致殘的主要原因之一。有研究表明，動脈瘤性SAH發(fā)病后，約30%-70% 的患者產(chǎn)生血管造影顯示的血管痙攣，其中20% 30%的患者出現(xiàn)臨床癥狀，雖經(jīng)積極治療，有癥狀的患者中仍有32% 67%出現(xiàn)腦梗死，最終15% 20%會因卒中致殘或因缺血而死亡。近年來國內(nèi)外學者在血管痙攣和SAH的治療方面取得了一定的進展，使腦血管痙攣的病死率和致殘率大為降低。但目前引起腦血管痙攣的確切發(fā)病機制仍未明確，各種治療方法均不甚理想，因此如何防治CVS是降低SAH后致殘率和致死率的關鍵。動脈瘤性SAH后CVS的確切病理機制目前仍不十分清楚，治療上也因此缺乏針對性。臨床上對于SAH后CVS的防治方法主要有手術清除血凝塊、腦脊液持續(xù)外引流等預防措施和3H治療、鈣離子拮抗劑的應用等治療措施，但效果均不理想。由于CVS是多因素、多種機制綜合作用的結(jié)果，因而防治的關鍵在于能夠同時針對不同的機制逆轉(zhuǎn)其發(fā)生和發(fā)展的過程?，F(xiàn)階段亟需一種能夠控制動脈瘤性SAH后CVS的治療手段來減輕腦血管痙攣的影響。Cystatin C是一種低分子量、堿性非糖化蛋白質(zhì)，分子量為13. 3KD,由120個氨基酸殘基組成，等電位9. 3，由CST3基因編碼，為半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員，也稱為胱抑素C，Y-微量蛋白及Y-后球蛋白，可由機體所有有核細胞產(chǎn)生，無組織學特異性，產(chǎn)生率恒定。Cystatin C廣泛存在于人類的體液中,在腦脊液中濃度最高,約占2 4%，是血液中的5. 5倍。Cystatin C在生理條件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。腦脊液中的Cystatin C主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和脈絡叢。Cystatin C因其分子量小，能自由通過腎小球濾過膜，幾乎完全被腎小管重吸收且不被分泌，其血中濃度不受炎癥、肌肉量、腎小管分泌因素的影響，因此，能替代肌酐成為一種新的反映GFR的理想標志物而在臨床上得到了廣泛的應用。除此之外，Cystatin C在生理條件下的重要功能是抑制內(nèi)源性的半胱氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B、H、L和二肽基肽酶等)的活性。它在機體中有著廣泛的生物學作用，可以阻止死亡細胞或惡性細胞漏出的細胞內(nèi)酶對周圍組織的破壞，并具有促生長活性、炎癥下調(diào)、抗病毒、抗細菌等功能。它參與了眾多各式各樣的疾病的進程，如腫瘤、腎病、糖尿病、癲癇、神經(jīng)變性疾病等。有研究證明它在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護功能如遺傳性大腦淀粉樣血管病、短暫性前腦缺血、腦梗塞和癲癇癥等。Tizon等實驗證明，夕卜源性Cystatin C通過抑制哺乳動物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路誘導自曬,從而對小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元起到保護作用，而Cystatin C的神經(jīng)保護作用可被3_MA (3-甲基腺嘌呤，一種自噬阻斷劑)阻斷，認為Cystatin C通過誘導自曬在腦保護中起重要作用。目前針對SAH后自噬的作用主要集中在早期腦損傷方面，但CystatinC對顱內(nèi)血管痙攣是否有防治作用，目前尚無相關文獻報道。本發(fā)明因此而來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種Cystatin C在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的新用途，揭示了一種蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的新治療途徑。為了解決現(xiàn)有技術中的這些問題，本發(fā)明提供的技術方案是
一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應用。優(yōu)選的，所述腦血管痙攣為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣。優(yōu)選的,所述藥物組合物包含藥學上有效量的Cystatin C和藥學上可接受的載體。優(yōu)選的，所述腦血管痙攣為動脈瘤性自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣。本發(fā)明技術方案通過枕大池注藥法來研究半胱氨酸蛋白酶抑制劑CXCystatin C)能否對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦血管痙攣有防治作用，并測定LC3和Beclin-I等自噬指標來研究這種作用與自噬的相關性，以期為探討蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的作用機制及治療提供更多的理論依據(jù)。本發(fā)明通過SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后自噬在基底動脈壁的表達情況，研究經(jīng)枕大池注入半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (Cystatin C，CysC)對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦血管痙攣的干預作用，并分析其與自噬的相關性。本發(fā)明采用五十只SD大鼠隨機分為對照組(A組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(B組)、安慰劑組(C組)、Cystatin C低濃度治療組(DL組)和CystatinC高濃度治療組(DH組),每組10只。各組動物均在全麻下行常規(guī)手術操作，SAH組、安慰劑組和Cystatin C治療組的動物取自體非抗凝股動脈血O. 3ml注入枕大池即一次注血法制作SAH動物模型，而對照組經(jīng)枕大池注入O. 3ml生理鹽水，安慰劑和治療組在枕大池注血前30分鐘分別注入生理鹽水O. Iml和Cystatin C水溶劑O. Iml (其中低濃度和高濃度組劑量分別為2 μ g/0. Iml和10yg/0. 1ml)。各組于術后48小時處死動物取腦基底動脈及周圍腦干組織行病理檢查，測定基底動脈血管內(nèi)徑周長和血管壁厚度，應用自噬標記抗體LC3和Beclin-I對各組基底動脈組織進行免疫組化和Western blot檢測。采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，SAH組和安慰劑組中大鼠基底動脈內(nèi)徑周長較對照組明顯縮短(P
<O. 01)，血管壁厚度明顯增加(P < O. 01)，管腔狹窄，內(nèi)膜皺褶，平滑肌細胞肥大；CysC治療組中基底動脈內(nèi)徑周長增大，管壁增厚程度減輕，與SAH組對比有顯著性差異(P
<O. 01)，在高濃度治療組更明顯，與低濃度組相比有統(tǒng)計學意義(P < 0.05)。免疫組化顯示，在對照組中基底動脈的內(nèi)膜、中膜只可觀察到極少數(shù)的LC3和Beclin-I陽性表達，在SAH和安慰劑組中LC3和Beclin-I陽性的表達增加，在低濃度和高濃度治療組內(nèi)膜和中膜可觀察到大量LC3和Beclin-I陽性表達,外膜也可見到散在的染色信號。Westernblot結(jié)果顯示LC3和Beclin-I在對照組是低表達的，而在SAH組及安慰劑組表達明顯增高，其LC3/GAPDH、Beclin-l/GAPDH值與對照組比較，P < O. 05。而在CysC治療組，LC3和Beclin-I的表達進一步增高，以CysC高濃度組更明顯，與SAH組比較，P < O. 01，與CysC低濃度組相比，P < O. 05。本發(fā)明中，可將本發(fā)明中的Cystatin C采用本領域常規(guī)的方法制備成適用于胃腸道給藥或非胃腸道給藥的藥物制劑，本發(fā)明優(yōu)選將Cystatin C制備成適用于胃腸道給藥的藥物制劑，其制劑形式可以為常規(guī)片劑或膠囊劑或控釋、緩釋制劑。在本發(fā)明中CystatinC藥物組合物的藥物制劑中，根據(jù)不同的制劑形式或制劑規(guī)格，所述組合物在制劑中的含量可以為質(zhì)量計為1°/Γ99%，優(yōu)選為109Γ90%;本發(fā)明所述的藥學上可接受的載體為組合物中制劑使用的輔料可采用本領域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明活性成分發(fā)生反應或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提，所述制劑的制備方法可采用本領域常規(guī)的制備方法進行制備。 本發(fā)明中，組合物的制備方法沒有限制，Cystatin C直接做成制劑，或者分別或/和輔料混合后做成制劑，然后安裝本領域常規(guī)的方式進行包裝，與其他輔料混合制成制劑。本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進行適當?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在哺乳動物體內(nèi)能夠達到有效的血藥濃度為前提。相對于現(xiàn)有技術中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明通過構建大鼠枕大池一次注血模型，能夠觀察到基底動脈發(fā)生明顯的細胞形態(tài)改變、管壁的增厚以及管腔的狹窄，提示SAH后存在CVS。由于自噬在正常大鼠基底動脈壁的表達是低水平的。而SAH后自噬在基底動脈壁的表達上調(diào)，提示自噬可能參與了 CVS的病理過程。經(jīng)枕大池注入Cystatin C能誘導自噬在基底動脈壁的高表達，對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有防治作用，并且這種作用與Cystatin C濃度存在正相關性。Cystatin C對SAH后腦血管痙攣具有顯著抑制的效果，可以用來改善SAH后腦血管痙攣。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖I為A組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖2為B組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖3為C組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖4為DL組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖5為DH組的大鼠基底動脈血管的HE染色檢查；圖6為各組SD大鼠基底動脈內(nèi)徑周長直方圖(單位μ m);圖7為各組SD大鼠基底動脈管壁厚度直方圖(單位μ m);圖8為各組SD大鼠基底動脈Western blot檢查結(jié)果；圖9為各組SD大鼠基底動脈LC3和Beclin-I表達的變化(/GAPDH)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例Cystatin C對SAH后腦血管痙攣的影響一、試驗I. I實驗對象健康SD大鼠(Sprague-Dawley rat) 50只，雄性，體重300 350g,清潔級，由蘇州大學實驗動物中心提供。喂養(yǎng)條件如下五只一籠，室溫20°C左右，濕度50-60%，通風良好，自由攝食攝水，術前禁食12小時但不禁水。I. 2主要試劑和儀器I. 2. I常規(guī)試劑 Cystatin C( 100 μ g,人尿提純,Enzo Life Sciences,瑞士)、4% 多聚甲醒、PBS 液，安爾碘，DAB顯色劑、生理鹽水、蒸餾水、10%水合氯醛、無水酒精。I. 2. 2HE及免疫組化試劑蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德公司)，內(nèi)有蘇木素染色液和伊紅染色液。二步法兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(上海拜力生物科技有限公司)，主要成分為=A 液(ChemMate EnVision + /HRP), B 液(DAB 緩沖稀釋液)，C 液(DAB 原液)?？笲eclin-I和抗LC3抗體-一抗(北京博奧森生物技術有限公司)。I. 2. 3實驗設備石蠟切片機(Leica 3215，德國)、自動脫水機(Leica 1020，德國)、石蠟包埋機(BMJ-III，中國，常州)、01ympus BX40型光學顯微鏡、圖像攝影軟件(L0GENE-I Path PRT診斷報告工作站)、液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司)、大鼠實驗操作臺(蘇州大學附屬第一醫(yī)院腦神經(jīng)研究室提供)、醫(yī)用冰箱(青島海爾公司)、手術器械一套等。I. 3實驗分組及動物模型的制作I. 3. I實驗分組選擇健康雄性SD大鼠50只，隨機分為A、B、C、DL、DH 5組，每組IO只。A組(對照組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，取O. 3ml生理鹽水緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。B組(SAH組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。C組(SAH+安慰劑組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入生理鹽水O. Iml, 30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。DL組(SAH+低濃度藥物組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入Cystatin C水溶液O. Iml (濃度為2 μ g/0. Iml )，30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。DH組(SAH+高濃度藥物組)暴露環(huán)枕筋膜及股動脈，穿刺枕大池釋放腦脊液O. 3ml，經(jīng)枕大池注入Cystatin C水溶液O. Iml (濃度為10 μ g/0. Iml )，30分鐘后取自體非抗凝股動脈血O. 3ml緩慢注入枕大池，頭低30°俯臥位30min，然后縫合傷口。
I. 3. 2術前準備SD大鼠，電子稱重儀，安爾碘，手術刀、剪、鑷和拉鉤，lml、5ml注射器，24G靜脈留置套管針，10%水合氯醛，500ml容器+輸液管，托盤，4%中性多聚甲醛，生理鹽水。I. 3. 3手術步驟根據(jù)Gules 法[Gules I, Satoh M, Clower B R, et al. Comparison ofthree rat models of cerebral vasospasm[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol, 2002, 283(6) :H2551_H2559]經(jīng)枕大池一次注血制備大鼠SAH模型手術前12小時對SD大鼠禁食不禁飲，術前4小時禁飲，10 %水合氯醛按
0.4ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，頸枕交界區(qū)和腹股溝區(qū)備皮、消毒。大鼠俯臥位，于枕外隆突以下約0. 5cm正中直切口，鈍性分離，逐步暴露枕骨、環(huán)椎及環(huán)枕膜，大鼠改仰臥位，于腹股溝區(qū)剪開長約Icm大小切口，暴露、分離出股動脈，并置人24G留置針。大鼠改為俯臥位，·用Iml注射器針頭刺破環(huán)枕膜并稍稍向前推進至枕大池，回抽并釋放清涼腦脊液約0. 3m,用Iml注射器采集0. 3ml未抗凝股動脈血后即緩慢注入枕大池。注射完畢后用明膠海綿封堵穿刺孔，用慶大霉素沖洗傷口并逐層縫合。然后，大鼠頭低位30°約30min，以利于血液廣泛分布于顱底蛛網(wǎng)膜下隙中。模型制作完畢。各組除枕大池注射內(nèi)容物不同外，其它步驟都一致。將實驗動物保溫復蘇后給予喂水喂食。并進行一般情況與行為學觀察。I. 4標本采集各組實驗動物均于術后48h，腹腔注射10%水合氯醛過量麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠臺上，開胸暴露心臟，經(jīng)心尖向升主動脈插管灌注，后剪開右心耳，先用生理鹽水250ml加壓沖洗約20分鐘至沖洗液變?yōu)闊o色，再用250ml 4%中性多聚甲醛溶液灌注，至動物四肢抽搐，變硬。斷頭取腦。每組10只標本中隨機選擇5只取基底動脈部位存放于液氮罐中用于Westernblot檢測，另5只取腦干標本在4%多聚甲醒溶液中固定24小時，固定后冠狀切取包括基底動脈中上段腦組織3mm，石蠟包埋后，作HE染色及免疫組化分析。I. 5HE 染色主要試劑是蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(武漢博士德公司)，內(nèi)有蘇木素染色液和伊紅染色液。HE染色步驟(I)將石蠟切片在二甲苯脫蠟10分鐘，2次。(2)切片脫蠟后，依次過100%，100%，95%，90%，85%的酒精至水，每缸各10分鐘。(3)流水沖洗切片3分鐘后，在蘇木素燃料中染色3分鐘，再用流水沖洗2分鐘。(4) I %鹽酸酒精分化20秒，再流水沖洗3分鐘。(5) 10%的稀氨水溶液中反藍30秒，蒸餾水沖洗I分鐘。(6)在伊紅溶液中染色3分鐘，流水沖洗I分鐘。(7)依次過 85%，90%，95%，100%，100% 的酒精脫水。(8)在二甲苯溶液中透明2分鐘，3次，后用流水沖洗I分鐘。(9)用封片膠封片。I. 6免疫組化染色檢測LC3和Beclin_l
ChemMate EnVision + /HRP/DAB,兔 / 鼠二步法染色步驟(I)常規(guī)脫蠟水化將已在烤箱中干燥過的石蠟切片浸于二甲苯中10分鐘，三次。取出切片置于100%無水乙醇中10分鐘兩次；依次置入90% — 70%各級酒精各3分鐘。取出置于蒸餾水中。(2)抗原修復切片置于10mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH6. O)中，微波爐加熱(溫度95°C ) 30min,自然冷卻至室溫，PBS液沖洗3次，每次3分鐘。(3)取出蒸餾水中的切片，甩掉并擦干切片上組織周圍的液體，平放于濕盒中，滴加3%過氧化氫，避光孵育15分鐘。蒸餾水沖洗，再將切片置入PBS緩沖液中，浸泡5分鐘，三次。取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(4)滴加100微升抗Beclin-I和抗LC3親和純化兔抗體(一抗)于組織上，室溫孵 育30分鐘。用PBS沖洗切片3次，每次3分鐘，取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(5)滴加 100 微升 A 液(ChemMateTMEnVision + /HRP) (二抗)于組織上，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3分鐘。取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體，平放于濕盒中。(6)滴加預備好的顯色劑DAB工作液100微升。室溫孵育30分鐘。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。(7)各級酒精(70%_100%)脫水，每級3分鐘。取出切片置入二甲苯5分鐘，三次。(8)用封片膠封片。I. 7ffestern blot 檢測 LC3 和 Beclin-1I. 7. I主要儀器玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)、高速離心機(湖南湘儀H1650-W)、分光光度儀(上海欣茂UV-7504)、-20°C低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(上海天能生物)、電泳儀(北京君意JY300C)、多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101)。I. 7. 2主要試劑單去污劑裂解液(北京普利萊生物)、一抗LC3，BECNl (北京博奧森)、預染蛋白(Fermentas)、HRP 二抗(GenScript)、內(nèi)參一抗(GenScript)、0. 01mol/L PBS (pH7. 3) >12%分離膠、6%濃縮校、0. 15mol/LNaCl溶液、5XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、TBST、TBS、TEMED、顯影液、定影液、化學發(fā)光試劑。I. 7. 3ffestern blot 檢測步驟①灌膠與上樣先玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。將12%分離膠，力口入TEMED后立即搖勻即可灌膠。當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。將6%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。取出上樣樣品與5XSDS上樣緩沖液上樣緩沖液按4 :1比例混合，混勻后沸水中煮5min使蛋白變性。加足夠的電泳液后按等量蛋白上樣。電泳，80V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120V，待溴酚蘭跑到膠板底部剛好沒有跑出即可。將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊；同時將電泳液換成轉(zhuǎn)移液。將電流調(diào)整到恒流200mA，轉(zhuǎn)移約I. O小時。取出膜，并做好正反面標記，在TBST中清洗I分鐘，然后用封閉液封閉過夜。用封閉液將對應的一抗稀釋成一定的濃度(I 300)，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為I :3000，然后溫育I. 5小時。用TBST清洗3次，每次5分鐘。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1:5000)，然后溫育I. 5小時。用TBST清洗4次，每次5分鐘。②化學發(fā)光，顯影，定影先將A和B兩種試劑在試管內(nèi)等體積混合，然后加在PVDF膜的正面，溫育大概2分鐘；然后進入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發(fā)光劑。將膠片壓在保鮮膜上，依照發(fā)光的強度選擇不同的曝光時間；將膠片放入顯影液中，出現(xiàn)條帶后，立即放入定影液中，流水沖洗膠片后晾干；對膠片進行掃描，然后用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labw0rks4.6軟件分析目的條帶的灰度值。·I. 8檢驗觀察I. 8. IHE 染色觀察大鼠基底動脈血管內(nèi)徑周長及血管壁厚度基底動脈在40倍光學顯微鏡下照相，采用Image-pix) Plus顯微鏡圖像分析系統(tǒng)計算出血管內(nèi)徑周長及血管壁厚度。通過基底動脈內(nèi)徑周長的比較，判斷血管有無痙攣及痙攣程度。CVS值參照Liszczak法[Liszczak TM, Varsos V G, Black P M, et al. Cerebral arterial constriction after experimentalsubarachnoid hemorrhage is associated with blood components within the arterialwall [J]. J Neurosurg, 1983, 58 (I) : 18-26]，計算如下CVS值=(注血前BA直徑-注血后BA直徑)/注血前BA直徑X 100% ；CVS 的評價方法，參照 Handa 方法[Handa Y, Kabuto M, Kobayashi H, et al. Thecorrelation between immunological reaction in the arterial wall and the timecourse of the development of cerebral vasospasm in a primate model[J]. Neurosurgery, 1991，28(4) :542-549]:無 CVS，CVS 值彡 10% ;輕度 CVS，CVS 值 11-30% ;中度 CVS, CVS值 31-50% ;重度 CVS, CVS 值彡 50%oI. 8. 2免疫組化觀察顯微鏡下觀察并攝像，每張切片在高倍鏡(10X20)視野下觀察基底動脈管壁內(nèi)膜、中膜及外膜的染色情況。結(jié)果判斷標準棕色或棕黃色為陽性染色。以無染色為陰性(_)，輕度或局部染色為( + )，全層重度或強烈染色為(+++)，介于兩者之間為(++)。I. 8. 3ffestern blot 結(jié)果觀察用GAPDH為內(nèi)對照，以陽性條帶與內(nèi)對照光密度比值作為陽性條帶的相對表達。I. 9統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用均數(shù)土標準差(X土S)表示，使用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多組比較用單因素方差分析(one way AN0VA),兩兩比較在總體方差齊的條件下,選用LSD及Dunnett-t法進行分析。P〈0. 05為有統(tǒng)計學意義，P〈0. 01為統(tǒng)計學差異顯著。二、結(jié)果2. I動物存活情況
對照組動物全部成活，SAH組、安慰劑組及高濃度藥物組中分別有2、2、1只大鼠在注血過程中心跳、呼吸停止，經(jīng)心肺按壓無效死亡，死亡原因考慮為注血過程過快或針頭穿刺過深損傷腦干所致。死亡后動物隨機補充至各組。2. 2動物狀態(tài)及行為學觀察術后第一天各組實驗動物精神狀態(tài)比較差，術后第二天對照組動物精神狀態(tài)及食欲恢復正常。而SAH組、安慰劑組、藥物處理組動物仍有不同程度的萎靡，毛發(fā)蓬松，頭低位蜷縮狀，活動及飲食減少，小部分大鼠可出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)球結(jié)膜下出血。2. 3標本病理學檢查2. 3. I大體觀察對照組大鼠腦表面及血管周圍均未見到積血，未見手術損傷；SAH組、安慰劑組、Cystaitin C處理組均可見在腦干腹側(cè)、基底池、顱底腦表面大量積血，其中以SAH組、安慰 劑組明顯。2. 3. 2基底動脈HE染色結(jié)果，如圖I 圖5所示①形態(tài)學光鏡下，對照組基底動脈結(jié)構正常，管腔呈圓形或橢圓形，管壁較薄，血管內(nèi)膜光整，未見管壁皺褶，管腔面積大，內(nèi)徑長，內(nèi)皮細胞排列整齊，結(jié)構層次清楚，無腫脹、壞死、脫落，內(nèi)彈力層平整，血管平滑肌呈扁平狀；SAH組和安慰劑組基底動脈管壁皺褶，管腔不規(guī)則，收縮明顯，管壁增厚，管腔面積小，直徑短，內(nèi)皮細胞腫脹、變形，部分壞死、脫落，內(nèi)彈力膜迂曲，厚薄不均，部分中膜變厚，平滑肌細胞排列紊亂；Cystatin C處理組基底動脈管壁有皺褶，但收縮較輕，管腔圓滑，內(nèi)彈力膜結(jié)構完整，可見少量內(nèi)皮細胞腫脹、變形，多數(shù)平滑肌細胞排列尚整齊。②血管內(nèi)徑周長的變化與對照組相比，SAH組、安慰劑組基底動脈管腔明顯狹窄，P < O. 01，內(nèi)徑周長分別為633. 43±47· 53 μ m，630. 35±31· 01 μ m，表現(xiàn)為中度 CVS。CysC低濃度和高濃度治療組基底動脈內(nèi)徑周長分別為724. 06 土 26. 78 μ m, 814. 16 土 24. 58 μ m，表現(xiàn)為輕度CVS。與SAH組及安慰劑組相比，治療組管腔狹窄程度明顯減輕，其中CysC低濃度治療組與SAH組相比，P < O. 05 ；CysC高濃度治療組與SAH組相比，P < O. 01。CysC高濃度治療組與低濃度治療組相比，管腔狹窄程度進一步減輕，P < O. 05，但仍較對照組狹窄，P
<O. 01。見表 2-1，圖 6。③動脈壁厚度變化SAH組、安慰劑組血管壁明顯增厚，與對照組相比，P < O. 01。而CysC治療組使血管增厚程度明顯減輕，與SAH組相比，P < O. 01。CysC高濃度治療組與低濃度治療組相比，血管增厚程度進一步減輕，兩者比較，P < O. 05，但管壁仍厚于對照組，P < O. 01。見表 1，圖 7。表I各組大鼠基底動脈內(nèi)徑周長、動脈壁厚度(X土S，μπι)以及CVS程度的比較
權利要求
1.一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應用。
2.根據(jù)權利要求I所述的應用，其特征在于所述腦血管痙攣為蛛網(wǎng)膜下腔出血后發(fā)生的腦血管痙攣。
3.根據(jù)權利要求I所述的應用，其特征在于所述藥物組合物包含藥學上有效量的Cystatin C和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Cystatin C在制備用于治療腦血管痙攣的藥物組合物中的應用。通過動物實驗證實Cystatin C能誘導自噬在基底動脈壁的高表達，對SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有防治作用，并且這種作用與Cystatin C濃度存在正相關性。Cystatin C對SAH后腦血管痙攣具有顯著抑制的效果，可以用來改善SAH后腦血管痙攣。
文檔編號A61P9/10GK102895658SQ20121030136
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權日2012年8月23日
發(fā)明者王中, 陳罡, 劉一之, 蔡紅法 申請人:蘇州大學附屬第一醫(yī)院