專利名稱：注射用重組卵泡抑素制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵泡抑素，尤其涉及一種注射用重組卵泡抑素制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分別從牛和豬的卵泡液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽，對(duì)卵泡刺激素有較強(qiáng)的抑制作用。卵泡抑素分布較為廣泛，在不同組織中均能檢測(cè)到卵泡抑素。目前發(fā)現(xiàn)卵泡抑素至少有32KD，35KD,39KD三種不同的分子形式。卵泡抑素(Follistatin)作為Activin的結(jié)合蛋白，它可以通過(guò)Activin/Follistatin系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的生殖活動(dòng)。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明，卵泡抑素可以通過(guò)其作用系 統(tǒng)，參與機(jī)體多種生理機(jī)能的調(diào)節(jié)，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、紅細(xì)胞生成和成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)均起重要的作用，具有重要的生物學(xué)意義。卵泡抑素(Follistatin)可用于治療肌肉疾病和病癥，尤其是肌肉組織的增加將有利于治療的疾病，也可用于治療與代謝、脂肪組織及骨變性相關(guān)的疾病和病癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種表達(dá)量高、活性高、純化工藝簡(jiǎn)單的重組卵泡抑素制備工藝；以及一種不含保護(hù)劑和防腐劑、有效期長(zhǎng)的注射用重組卵泡抑素制劑配方。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。根據(jù)上述的制劑，優(yōu)選的，所述制劑以每支計(jì)算包含I. 0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉；1% _5%重量百分比的甘露醇；O. 2%-1%重量百分比的甘氨酸。根據(jù)上述的制劑，優(yōu)選的，所述制劑以每支計(jì)算包含2mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；1%重量百分比的甘露醇；O. 2%重量百分比的甘氨酸。本發(fā)明的目的還通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的上述的制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟(Al)建立菌種庫(kù)取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養(yǎng)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩若干時(shí)間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存；
(A2)種子液培養(yǎng)；從保存的菌種管子用接種環(huán)在kan抗性LB平板上劃線，培養(yǎng)若干時(shí)間，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4-0. 8之間；(A3)發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以一定速度補(bǔ)料，當(dāng)0D600為7-12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)若干時(shí)間后，終止培養(yǎng)；(A4)收集和破碎菌體；收集菌體誘導(dǎo)完的菌液用離心機(jī)離心；破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行碎菌，再用離心機(jī)離心，收集上清液，即粗制重細(xì)卵泡抑素蛋白溶液； (A5)目的蛋白純化將所述上清液通過(guò)親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品；再通過(guò)陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品；(A6)濃縮半成品通過(guò)過(guò)濾系統(tǒng)去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5 %甘露醇和
O.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成品；(A7)冷凍干燥將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理若干時(shí)間，最后進(jìn)行壓蓋、封口處理。根據(jù)上述的制備方法，可選地，所述步驟(Al)進(jìn)一步包括如下步驟(BI)菌種進(jìn)行以下鑒定，鑒定合格后投入生產(chǎn)形態(tài)特征觀察將所述菌種劃線于kan抗性的LB平板，并培養(yǎng)，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長(zhǎng)；表達(dá)量檢測(cè)挑取單克隆菌，接種于l_3ml含kan的LB液體培養(yǎng)基，30_45°C搖床振蕩1-5小時(shí)，檢測(cè)0D600為O. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩3_4小時(shí)后收菌，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)量；質(zhì)粒檢查抽取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(Al)進(jìn)一步包括以下步驟從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩12小時(shí)，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數(shù)管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A2)進(jìn)一步包括以下步驟從保存的菌種管子用接種環(huán)在kan抗性LB平板上劃線，在37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4-0. 8之間，即可用來(lái)接種發(fā)酵培養(yǎng)使用。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A3)中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為
酵母提取物(Yeast)5g/L蛋白胨(Typtone)10g/L氯化鈉(NaCl)10g/L補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為酵母提取物(Yeast)50g/L蛋白胨(Typtone)100g/L甘油(glycerole)50g/L ；發(fā)酵條件37°C培養(yǎng)，以200ml/小時(shí)速度補(bǔ)料，當(dāng)0D600為7-12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，濃度為O. 5mM，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)后，終止培養(yǎng)。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A4)中，誘導(dǎo)完的菌液用大容量冷凍高速離心機(jī)，5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體；破碎菌體將離心后菌體，用lxPBS、pH7. 4緩沖液懸浮均勻，冰浴條件下使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行碎菌，20分鐘后，用大容量冷凍高速離心機(jī)，10000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集上清即為粗制重組卵泡抑素蛋白溶液。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A5)中，重組蛋白粗純化將粗制的重組蛋白通過(guò)鎳離子親和層析柱，用包含不同濃咪唑的緩沖液進(jìn)行清洗，最終洗脫的為重組蛋白粗制品；重組蛋白精細(xì)純化將重組蛋白粗制品通過(guò)Q-Sepharose陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進(jìn)行清洗，最終洗脫的為重組蛋白精制品。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A6)中，超濾濃縮半成品將重組蛋白精制品通過(guò)Millipore超濾系統(tǒng),去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1%甘露醇和O. 2%甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過(guò)濾器過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成品。根據(jù)上述的制備方法，優(yōu)選的，所述步驟(A7)中，分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品稀釋成合適的濃度，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理，整個(gè)升溫過(guò)程不超過(guò)30°C，24小時(shí)后凍干結(jié)束，進(jìn)行壓蓋，封口處理。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果I、得到的重組卵泡抑素純度> 95%,每一劑量所含重組卵泡抑素為2mg左右，是因?yàn)榕R床最佳用量是50ug/kg ；2、得到的重組卵泡抑素比活性高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，比活性大于7000IU/mg ；3、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物收率高，生產(chǎn)成本低。


參照附圖，本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容將變得更易理解。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的是這些附圖僅僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而并非意在對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成限制。圖中圖I本發(fā)明實(shí)施例I的制備方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式圖I和以下說(shuō)明描述了本發(fā)明的可選實(shí)施方式以教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何實(shí)施和再現(xiàn)本發(fā)明。為了教導(dǎo)本發(fā)明技術(shù)方案，已簡(jiǎn)化或省略了一些常規(guī)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解源自這些實(shí)施方式的變型或替換將在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解下述特征能夠以各種方式組合以形成本發(fā)明的多個(gè)變型。由此，本發(fā)明并不局限于下述可選實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求和它們的等同物限定。實(shí)施例I :圖I示意性地給出了本發(fā)明實(shí)施例的注射用重組卵泡抑素制劑制備方法的流程圖，如圖I所示，所述制備方法包括以下步驟(Al)建立菌種庫(kù)
取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養(yǎng)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩若干時(shí)間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存；(A2)種子液培養(yǎng)；從保存的菌種管子用接種環(huán)在kan抗性LB平板上劃線，培養(yǎng)若干時(shí)間，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4-0. 8之間；(A3)發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以一定速度補(bǔ)料，當(dāng)0D600為7-12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)若干時(shí)間后，終止培養(yǎng)；(A4)收集和破碎菌體；收集菌體誘導(dǎo)完的菌液用離心機(jī)離心；破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行碎菌，再用離心機(jī)離心，收集上清液，即粗制重組卵泡抑素蛋白溶液；(A5)目的蛋白純化將所述上清液通過(guò)親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品；再通過(guò)陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品；(A6)濃縮半成品通過(guò)過(guò)濾系統(tǒng)去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5%甘露醇和
0.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成品；(A7)冷凍干燥將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理若干時(shí)間，最后進(jìn)行壓蓋、封口處理。上述制備方法制得的注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。優(yōu)選的，所述制劑以每支計(jì)算包含
1.0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉；1%-5%重量百分比的甘露醇；O. 2% -I %重量百分比的甘氨酸。實(shí)施例2
根據(jù)實(shí)施例I所述的制劑及制備方法的應(yīng)用例，在該應(yīng)用例中，所述制備方法具體過(guò)程為(Al)菌種庫(kù)的建立從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩12小時(shí)，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數(shù)管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存。每批生產(chǎn)菌種應(yīng)進(jìn)行以下鑒定后，鑒定合格后防可投入生產(chǎn)，具體方式為形態(tài)特征觀察將上述菌種劃線于kan抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長(zhǎng)。表達(dá)量檢測(cè)挑取單克隆菌，接種于2ml含kan的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床振蕩3小時(shí)，檢測(cè)0D600為O. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩3_4小時(shí)后收菌，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)量。質(zhì)粒檢查抽取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。(A2)種子液培養(yǎng)從保存的生產(chǎn)菌種，接種于含有kan抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4之間，即可用來(lái)接種發(fā)酵培養(yǎng)使用。(A3)發(fā)酵培養(yǎng)3. I發(fā)酵用培養(yǎng)基成份3. I. I基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基溶液(I升)酵母提取物(Yeast) 5g蛋白胨(Typtone)IOg氯化鈉(NaCl)IOg3. 1.2補(bǔ)料培養(yǎng)基溶液(I升)酵母提取物(Yeast)50g蛋白胨(Typtone)IOOg甘油(glycerole)50g3. 2發(fā)酵罐的滅菌和種子液的接種往IOL發(fā)酵罐中加入6升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，蒸汽滅菌，121°C維持20分鐘，冷卻發(fā)酵罐溫度到發(fā)酵溫度后，再按I : 10接入種子液。發(fā)酵條件發(fā)酵溫度和時(shí)間37°C培養(yǎng)，以200ml/小時(shí)的速度添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，當(dāng)0D600為7時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，濃度為O. 5mM，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)后，終止發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基總量約7升通氣量保持發(fā)酵液中溶氧大于40%攪拌速度250rpm酸堿度6·5-7·0發(fā)酵要求整個(gè)發(fā)酵過(guò)程必須無(wú)菌操作，發(fā)酵完畢，必須清洗發(fā)酵罐內(nèi)壁和攪拌器。(A4)收集菌體發(fā)酵終止后，放出菌液，在大型冷凍離心機(jī)上以5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體，離心上清液舍棄，將濕菌體稱重，-20°C保存。菌體破碎取濕菌體，用IxPBS緩沖液按I : 10比例懸浮(菌體與緩沖液比例為
I 20)，冰浴條件下用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破菌，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。(A5)重組卵泡抑素蛋白的分離純化卵泡抑素蛋白粗制品的制備及初步純化菌體裂解后，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素粗制品。將卵泡抑素蛋白粗制品通過(guò)Ni離子層析柱結(jié)合蛋白，再用含有不同濃度咪唑的緩沖液處理，去除大部分雜蛋白，得到初步純化的卵泡抑
素蛋白。卵泡抑素蛋白粗制品的精細(xì)純化從此步驟開(kāi)始，所有配制緩沖溶液所需的水、無(wú)機(jī)鹽試劑和相關(guān)容器需為無(wú)熱源或醫(yī)用級(jí)。將上一步驟得到的初步純化的卵泡抑素蛋白，經(jīng)過(guò)平板超濾系統(tǒng)處理，除去溶液中的鹽分并適當(dāng)縮小體積，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含O. 5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集卵泡抑素蛋白，此步驟是為了進(jìn)一步純化目的蛋白并去除蛋白溶液中的內(nèi)毒素。(A6)超濾濃縮半成品將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱洗脫得到的蛋白溶液，用Millipore超濾濃縮系統(tǒng)，去除多余的鹽和水，將蛋白溶液濃縮至合適的體積，力口入1%甘露醇和O. 2%甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過(guò)濾器過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成
品O(A7)分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品用超純水稀釋到濃度為2mg/ml，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理，整個(gè)升溫過(guò)程不超過(guò)30°C，24小時(shí)后凍干結(jié)束，進(jìn)行壓蓋，封口處理，保存于4°C。最終每支針劑含有2mg的重組卵泡抑素凍干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸組成，使用前用Iml注射用水溶解。分裝,凍干,壓蓋,封口的處理的過(guò)程都必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，凍干后的制品水份含量低于3%，同機(jī)一次凍干的制品作為一批。根據(jù)上述制備方法制得的制劑，以每支計(jì)算包含2. 0mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；1%重量百分比的甘露醇；O. 2%重量百分比的甘氨酸。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例I達(dá)到的益處在于得到的重組卵泡抑素純度> 95% ;得到的重組卵泡抑素比活性高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，比活性大于7000IU/mg ;生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物收率高,生產(chǎn)成本低。實(shí)施例3:根據(jù)實(shí)施例I所述的制劑及制備方法的應(yīng)用例，在該應(yīng)用例中，所述制備方法具體過(guò)程為(Al)菌種庫(kù)的建立從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩12小時(shí)，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數(shù)管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存。每批生產(chǎn)菌種應(yīng)進(jìn)行以下鑒定后，鑒定合格后防可投入生產(chǎn)，具體方式為形態(tài)特征觀察將上述菌種劃線于kan抗性的LB平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長(zhǎng)。表達(dá)量檢測(cè)挑取單克隆菌，接種于2ml含kan的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床振蕩3小時(shí)，檢測(cè)0D600為O. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩3_4小時(shí)后收菌，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)量。質(zhì)粒檢查抽取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。 (A2)種子液培養(yǎng)從保存的生產(chǎn)菌種，接種于含有kan抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 8之間，即可用來(lái)接種發(fā)酵培養(yǎng)使用。(A3)發(fā)酵培養(yǎng)3. I發(fā)酵用培養(yǎng)基成份3. I. I基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基溶液(I升)酵母提取物(Yeast) 5g蛋白胨(Typtone)IOg氯化鈉(NaCl)IOg3. 1.2補(bǔ)料培養(yǎng)基溶液(I升)酵母提取物(Yeast)50g蛋白胨(Typtone)IOOg甘油(glycerole)50g3. 2發(fā)酵罐的滅菌和種子液的接種往IOL發(fā)酵罐中加入6升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，蒸汽滅菌，121°C維持20分鐘，冷卻發(fā)酵罐溫度到發(fā)酵溫度后，再按I : 10接入種子液。發(fā)酵條件發(fā)酵溫度和時(shí)間37°C培養(yǎng)，以200ml/小時(shí)的速度添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，當(dāng)0D600為12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，濃度為O. 5mM，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)后，終止發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基總量約7升通氣量保持發(fā)酵液中溶氧大于40%攪拌速度250rpm酸堿度6·5-7·0發(fā)酵要求整個(gè)發(fā)酵過(guò)程必須無(wú)菌操作，發(fā)酵完畢，必須清洗發(fā)酵罐內(nèi)壁和攪拌器。(Α4)收集菌體發(fā)酵終止后，放出菌液，在大型冷凍離心機(jī)上以5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體，離心上清液舍棄，將濕菌體稱重，-20°C保存。菌體破碎取濕菌體，用IxPBS緩沖液按I : 10比例懸浮(菌體與緩沖液比例為I 20)，冰浴條件下用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破菌，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。(A5)重組卵泡抑素蛋白的分離純化卵泡抑素蛋白粗制品的制備及初步純化菌體裂解后，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素粗制品。將卵泡抑素蛋白粗制品通過(guò)Ni離子層析柱結(jié)合蛋白，再用含有不同濃度咪唑的緩沖液處理，去除大部分雜蛋白，得到初步純化的卵泡抑
素蛋白。卵泡抑素蛋白粗制品的精細(xì)純化從此步驟開(kāi)始，所有配制緩沖溶液所需的水、無(wú)機(jī)鹽試劑和相關(guān)容器需為無(wú)熱源或醫(yī)用級(jí)。將上一步驟得到的初步純化的卵泡抑素蛋白，經(jīng)過(guò)平板超濾系統(tǒng)處理，除去溶液中的鹽分并適當(dāng)縮小體積，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含O. 5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集卵泡抑素蛋白，此步 驟是為了進(jìn)一步純化目的蛋白并去除蛋白溶液中的內(nèi)毒素。(A6)超濾濃縮半成品將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱洗脫得到的蛋白溶液，用Millipore超濾濃縮系統(tǒng)，去除多余的鹽和水，將蛋白溶液濃縮至合適的體積，力口入5%甘露醇和I %甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過(guò)濾器過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成
品O(A7)分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品用超純水稀釋到濃度為2mg/ml，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理，整個(gè)升溫過(guò)程不超過(guò)30°C，24小時(shí)后凍干結(jié)束，進(jìn)行壓蓋，封口處理，保存于4°C。最終每支針劑含有2mg的重組卵泡抑素凍干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸組成，使用前用Iml注射用水溶解。分裝,凍干,壓蓋,封口的處理的過(guò)程都必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，凍干后的制品水份含量低于3%，同機(jī)一次凍干的制品作為一批。根據(jù)上述制備方法制得的制劑，以每支計(jì)算包含5. 0mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；5%重量百分比的甘露醇；I %重量百分比的甘氨酸。上述實(shí)施例僅是示例性地給出了時(shí)間、轉(zhuǎn)速、含量等參數(shù)的數(shù)值，如每支制劑含有的重組卵泡抑素的凍干粉的量為2、5mg，當(dāng)然還可以是其它處于數(shù)值范圍內(nèi)的數(shù)值，如Img0這對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，實(shí)施效果是可以預(yù)料到的，是能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的的。
權(quán)利要求
1.一種注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含 重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制劑，其特征在于所述制劑以每支計(jì)算包含 I.0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉； 1% _5 %重量百分比的甘露醇； O.2% -I%重量百分比的甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制劑，其特征在于所述制劑以每支計(jì)算包含2mg±0.2mg重組卵泡抑素的凍干粉； 1%重量百分比的甘露醇； O.2%重量百分比的甘氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟 (Al)建立菌種庫(kù) 取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養(yǎng)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩若干時(shí)間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存； (A2)種子液培養(yǎng)；從保存的菌種管子用接種環(huán)在kan抗性LB平板上劃線，培養(yǎng)若干時(shí)間，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4-0. 8之間； (A3)發(fā)酵培養(yǎng)； 在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以一定速度補(bǔ)料，當(dāng)OD600為7-12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)若干時(shí)間后，終止培養(yǎng)； (A4)收集和破碎菌體； 收集菌體誘導(dǎo)完的菌液用離心機(jī)離心； 破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行碎菌，再用離心機(jī)離心，收集上清液，即粗制重組卵泡抑素蛋白溶液； (A5)目的蛋白純化 將所述上清液通過(guò)鎳離子親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品； 再通過(guò)陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進(jìn)行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品; (A6)濃縮半成品 通過(guò)過(guò)濾系統(tǒng)去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5 %甘露醇和O.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成品； (A7)冷凍干燥 將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理若干時(shí)間，最后進(jìn)行壓蓋、封口處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(Al)進(jìn)一步包括如下步驟 (BI)菌種進(jìn)行以下鑒定，鑒定合格后投入生產(chǎn) 形態(tài)特征觀察將所述菌種劃線于kan抗性的LB平板，并培養(yǎng)，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長(zhǎng)；表達(dá)量檢測(cè)挑取單克隆菌，接種于l_3ml含kan的LB液體培養(yǎng)基，30-45°C搖床振蕩1-5小時(shí)，檢測(cè)0D600為O. 4-0. 6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振蕩3_4小時(shí)后收菌，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)量；質(zhì)粒檢查抽取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜是否—致。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法其特征在于所述步驟(Al)進(jìn)一步包括以下步驟從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆菌于LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩12小時(shí)，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15% ;用滅菌后的I. 5ml EP管分裝數(shù)管，保存于_70°C冰箱；傳代3次后，菌種應(yīng)重新激活培養(yǎng)保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A2)進(jìn)一步包括以下步驟從保存的菌種管子用接種環(huán)在kan抗性LB平板上劃線，在37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至0D600為O. 4-0. 8之間，即可用來(lái)接種發(fā)酵培養(yǎng)使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A3)中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酵母提取物(Yeast) 5g/L蛋白胨(Typtone) 10g/L氯化鈉(NaCl)10g/L補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為酵母提取物(Yeast) 50g/L蛋白胨(Typtone) 100g/L甘油(glycerole) 50g/L ；發(fā)酵條件37°C培養(yǎng)，以200ml/小時(shí)速度補(bǔ)料，當(dāng)0D600為7_12時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，濃度為0. 5mM,繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4小時(shí)后，終止培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A4)中，誘導(dǎo)完的菌液用大容量冷凍高速離心機(jī)，5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體；破碎菌體將離心后菌體，用lxPBS、pH7. 4緩沖液懸浮均勻，冰浴條件下使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)進(jìn)行碎菌，20分鐘后，用大容量冷凍高速離心機(jī)，10000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集上清即為粗制重組卵泡抑素蛋白溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A5)中，重組蛋白粗純化將粗制的重組蛋白通過(guò)鎳離子親和層析柱，用包含不同濃咪唑的緩沖液進(jìn)行清洗，最終洗脫的為重組蛋白粗制品；重組蛋白精細(xì)純化將重組蛋白粗制品通過(guò)Q-Sepharose陰離子交換柱,用包含不同濃度Nacl的緩沖液進(jìn)行清洗，最終洗脫的為重組蛋白精制品。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A6)中，超濾濃縮半成品將重組蛋白精制品通過(guò)Millipore超濾系統(tǒng)，去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入I %甘露醇和O. 2 %甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過(guò)濾器過(guò)濾，即制成重組卵泡抑素半成品。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A7)中， 分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品稀釋成合適的濃度，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行凍干處理，整個(gè)升溫過(guò)程不超過(guò)30°C，24小時(shí)后凍干結(jié)束，進(jìn)行壓蓋，封口處理。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了注射用重組卵泡抑素制劑配方和制備工藝，每支制劑含a)1.0-5.0mg重組卵泡抑素的凍干粉；b)1％-5％甘露醇；c)0.2％-1％甘氨酸。本發(fā)明還公開(kāi)了上述制劑的制備方法及該制劑的用途。本發(fā)明具有表達(dá)量高，活性高，純化工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K47/18GK102920992SQ20121037780
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者楊威威, 雷振松, 劉瑩, 朱振洪, 陳展志 申請(qǐng)人:杭州康邦生物醫(yī)藥科技有限公司