專利名稱：一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及螺旋藻深加工及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻(Spirulina platensis)是ー種藍藻，具有護肝，抗氧化，防病毒，抗癌和增強免疫力等生理功能.螺旋藻蛋白質(zhì)占其干重的50-70%，是迄今發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)含量最高的物種之一.螺旋藻蛋白質(zhì)組成最接近于世界糧農(nóng)組織( FAO)規(guī)定的標準，包含18種氨基酸，并具有人體必須的全部8種氨基酸，是ー種優(yōu)質(zhì)蛋白源.目前，螺旋藻主要以干粉和片劑形式使用。由于其溶解性有限，不利于人體直接吸收等問題，使其應(yīng)用受到一定的限制。因此，從螺旋藻中分離純化活性肽具有巨大的社會經(jīng)濟效益和廣泛的應(yīng)用前景。生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生物活性的氨基酸聚合物，又稱為功能肽。其結(jié)構(gòu)松散，小至由兩個氨基酸大到由數(shù)百個氨基酸通過肽鍵連接而成。現(xiàn)代營養(yǎng)學表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作用后并不一定以完全游離氨基酸的形式吸收，且主要是低肽的形式吸收，具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。酶水解法獲得生物活性肽已經(jīng)成為エ業(yè)化生產(chǎn)生物活性肽的主要手段。惡性腫瘤已經(jīng)成為我國居民死亡的首要原因之一。目前對腫瘤患者的治療方法主要是化療和放療手段，對人體損傷嚴重。幾十年來，人們一直在探索對人體損傷小治療腫瘤方法，大多從天然動植物中尋找活性高、毒副作用小的廣譜抗腫瘤新藥。迄今為止，發(fā)現(xiàn)多種生物活性肽具有抗腫瘤活性，抗腫瘤肽因其分子量小、腫瘤細胞穿透能力強、提高免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管形成等特點，已經(jīng)成為腫瘤治療研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
為拓展螺旋藻在食品和生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，本發(fā)明的目的是提供ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案
ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，首先采用反復凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后經(jīng)超濾離心管過濾，獲得螺旋藻抗腫瘤多肽。ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，具體包括如下步驟
(I)螺旋藻粉5 50 g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌10 60 min，待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，依此反復凍融ー次以上；然后，采用超聲破碎方法將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來，將樣品置于冰浴中；最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 10000 r/min下離心10 60 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為廣5% (w/v，g/mL)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解；水解后再滅酶，室溫冷卻后將水解液在5000r/min下離心25 min，取上清；然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD、5 KDUO KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述反復凍融次數(shù)為三次。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(I)所述超聲破碎方法為在10^300 W的超聲功率下每超聲5 20 s間隔:TlO s’共超聲1(Γ300次將螺旋藻壁破碎。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法， 步驟(2)所述水解條件是溫度3(Γ60で，pH= 4 9，酶與底物的比2% 7% (w/v，g/mL)，水解5 12 h。上述的ー種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟(2)所述滅酶為在100で水中滅酶 10 min。上述的制備方法，步驟(I廣(2)得到的螺旋藻多肽具有抗腫瘤活性，例如，對人乳腺癌細胞MCF-7和肝癌細胞H印G-2體外生長具有一定的抑制作用。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進ー步的詳細描述，但具體實施方式
不應(yīng)理解為是對本發(fā)明保護范圍的限定。實施例I
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉25 g溶于250 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌30 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在130W的超聲功率下每超聲10 s間隔5 S，共超聲200次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 °C,轉(zhuǎn)速為7000 r/min下離心30 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度45 °C，pH= 6. 5，酶與底物的比1.5%.水解9 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在6000 r/min下離心25 min,取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD、5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。(3)步驟(I) (2)所得的螺旋藻多肽-殼聚糖納米粒進行抗腫瘤活性檢測(使用MTT檢測方法).當濃度為I mg/mL時，0-3 KD, 3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽對人乳腺癌細胞MCF-7體外生長抑制率分別達到2%、12%、14%和11%。當濃度為I mg/mL時，0_3KD,3 -5 KD,5-10 KD和>10 KD多肽對肝癌細胞(HepG_2)體外生長抑制率分別達到19%、12%、13% 和 12%。實施例2
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于200 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌20 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在50 W的超聲功率下每超聲5 s間隔6 S，共超聲200次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 °C,轉(zhuǎn)速為6000 r/min下離心30 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度55 °C，pH= 6，酶與底物的比5%.水解8 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實施例I。實施例3 螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉30 g溶于400 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在150 W的超聲功率下每超聲10 s間隔6 S，共超聲120次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 r/min下離心40 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度50 °C，pH= 9，酶與底物的比6%.水解12h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實施例I。實施例4
螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下
(I)螺旋藻粉40 g溶于700 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌50 min。待其全部溶解后置于-20で冰箱中冷凍80 min中，再置于4で冰箱中解凍，如此反復凍融三次。然后，采用超聲破碎方法，在200 W的超聲功率下每超聲15 s間隔8 S，共超聲150次將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來。為了防止超聲過程中產(chǎn)生的熱量使蛋白質(zhì)變性，將樣品置于冰浴中。最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為6000 r/min下離心50 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再迅速真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉。(2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為2%的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度40 °C，pH=6，酶與底物的比6%.水解8h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在6000 g、4で條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0_3 KD,3-5 KD,5-10KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。檢測方法與結(jié)果基本同實施例I。
權(quán)利要求
1.一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，首先采用反復凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白，然后經(jīng)超濾離心管過濾，獲得螺旋藻抗腫瘤多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，具體包括如下步驟 (1)螺旋藻粉5 50g溶于100 1000 mL Milli-Q水中，常溫下磁力攪拌10 60 min,#其全部溶解后置于-20 °C冰箱中冷凍80 min中，再置于4 °C冰箱中解凍，依此反復凍融一次以上；然后，采用超聲破碎方法將螺旋藻壁破碎，使得蛋白質(zhì)游離出來，將樣品置于冰浴中；最后，將獲得的溶液于溫度4 0C ,轉(zhuǎn)速為5000 10000 r/min下離心10 60 min，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得螺旋藻蛋白質(zhì)粉； (2)以步驟(I)得到的螺旋藻蛋白質(zhì)粉為基礎(chǔ)，配置濃度為f5% (w/v)的螺旋藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶進行水解；水解后再滅酶，室溫冷卻后將水解液在5000 r/min下離心25 min，取上清；然后，在6000 g、4 1條件下經(jīng)截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經(jīng)過3 KD,5 KDUO KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為0-3 KD、3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的螺旋藻多肽水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述反復凍融次數(shù)為三次。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述超聲破碎方法為在1(T300 W的超聲功率下每超聲5 20 s間隔:TlO s,共超聲1(Γ300次將螺旋藻壁破碎。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述水解條件是溫度30 60 °C,pH= 4 9，酶與螺旋藻蛋白溶液的比2% 7%. (w/v)，水解5 12h0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述滅酶為在100 1水中滅酶10 min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，主要采用反復凍融與超聲破碎相結(jié)合的方法提取螺旋藻蛋白，再由木瓜蛋白酶水解螺旋藻蛋白,超濾離心管過濾,獲得分子量大小范圍為0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的螺旋藻多肽,并且,這樣制備的螺旋藻多肽具有抗腫瘤活性,有利于抗腫瘤保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)利用。
文檔編號A61P35/00GK102851344SQ20121031808
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月31日
發(fā)明者張學武, 許平平, 張博超 申請人:華南理工大學