專利名稱：一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子－組織蛋白酶b抑制因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，具體涉及一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是指水解蛋白質(zhì)的酶，是維持人體正常生理功能的關(guān)鍵分子。根據(jù)水解蛋白質(zhì)的部位不同，可以將蛋白酶分為外肽酶和內(nèi)肽酶，外肽酶從蛋白質(zhì)的羧基端或氨基端水解蛋白質(zhì)，內(nèi)肽酶從蛋白質(zhì)的中間水解蛋白質(zhì)。內(nèi)肽酶又根據(jù)活性中心的氨基酸殘基分為半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，其中，半胱氨酸蛋白酶又包括數(shù)十種不同的蛋白酶。在正常生理代謝中，蛋白酶主要參與食物和體內(nèi)蛋白質(zhì)的水解，如胃蛋白酶和腸道中的胰蛋白酶水解食物蛋白為人體提供氨基酸；溶酶體蛋白酶參與細(xì)胞內(nèi)非必需的蛋白質(zhì)水解，使氨基酸得以循環(huán)利用；蛋白酶還參與酶原活化，保持體內(nèi)必需的蛋白水解平衡，如纖溶酶原激活因子tPA使纖溶酶原活化成纖溶酶，水解纖維蛋白，防止或治療血栓引起的心腦血管疾病。但在疾病狀態(tài)下，蛋白酶會(huì)異常表達(dá)，導(dǎo)致蛋白水解異常，最典型的例子是急性胰腺炎時(shí)，胰腺破裂，胰液及其中的胰蛋白酶外流，水解正常組織，成為繼心肌梗死和腦血管意外后的第三大高致死性急病。另一個(gè)典型例子是腫瘤，目前已經(jīng)證明腫瘤的發(fā)生和惡化是由于某些蛋白酶異常高表達(dá)引起的。
大多數(shù)腫瘤死亡并不是由于原發(fā)腫瘤死亡，而是由于腫瘤轉(zhuǎn)移到身體的其它部位引起的死亡。惡性腫瘤細(xì)胞具有如下特征，可以從原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落并轉(zhuǎn)移到鄰近組織、血管和淋巴，可以進(jìn)入血管作遠(yuǎn)距離遷移，然后再出血管，遷移到周圍組織并形成新的腫瘤，形成新的血管以支持腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。正常細(xì)胞是由細(xì)胞間基質(zhì)蛋白包括彈性蛋白和膠原蛋白形成的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)固定在組織內(nèi)的，這些基質(zhì)蛋白在組織重建、受傷康復(fù)和胚胎發(fā)育中被水解，癌細(xì)胞在從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移時(shí)也必須水解這些蛋白質(zhì)，一系列蛋白酶參與了這個(gè)過(guò)程，包括尿激酶-血纖溶酶原激活因子、半胱氨酸蛋白酶中的組織蛋白酶B和組織蛋白酶L、金屬蛋白酶中的膠原酶等。其中，組織蛋白酶B的高表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致某些腫瘤發(fā)生和惡化轉(zhuǎn)移的重要因素，例如乳腺癌，膀胱癌。研究認(rèn)為組織蛋白酶B的含量可以作為癌癥病人的預(yù)后指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B是某些腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的最關(guān)鍵的第一步-即水解細(xì)胞間基質(zhì)的關(guān)鍵酶。組織蛋白酶B屬于半胱氨酸蛋白酶，在正常情況下位于溶酶體內(nèi)，參與胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解，為機(jī)體提供可循環(huán)使用的氨基酸。在腫瘤細(xì)胞中，組織蛋白酶B高表達(dá)，遷移到細(xì)胞表面和釋放到胞外，水解細(xì)胞間基質(zhì)，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞遷移。有研究表明，用組織蛋白酶B的抗體或組織蛋白酶B的抑制因子可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。
許多藥物都是酶抑制因子，這些抑制因子可以分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子，競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子直接占據(jù)酶活性中心，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制因子結(jié)合于酶的其它部位但會(huì)影響酶的催化活性。用蛋白酶抑制因子治療疾病最著名的例子是艾滋病治療。艾滋病毒需要將蛋白質(zhì)前體剪切成有功能的各種蛋白質(zhì)，參與病毒的復(fù)制，剪切蛋白質(zhì)前體的是一種天冬氨酸蛋白酶，可以特異性地水解苯丙氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-脯氨酸之間的肽鍵，這是目前已知的人類蛋白酶所不能水解的肽鍵。當(dāng)人們發(fā)明了該蛋白酶的抑制因子后，使艾滋病病人的死亡率降低了70％，成為艾滋病防治的最大新聞，使艾滋病治療有了希望。
蛋白酶抑制因子包括化合物和肽類抑制因子，生物體內(nèi)的蛋白酶抑制因子(Proteinase Inhibitor，PI)是對(duì)蛋白酶有抑制活性的一類小分子蛋白質(zhì)，屬于肽類抑制因子，普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)，它們能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶。動(dòng)物體內(nèi)的蛋白酶抑制因子的功能是調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白酶活性，從而控制體內(nèi)蛋白水解平衡。許多農(nóng)作物如大豆、小麥、玉米、番茄和馬鈴薯中都有高含量的蛋白酶抑制因子，一般儲(chǔ)存于種子和塊莖內(nèi)，在某些植物的貯藏器官中，其含量占總蛋白的10％，是植物抵御害蟲嚙食和病原體侵染的主要分子。另外，植物葉片受到機(jī)械損傷或經(jīng)化學(xué)物質(zhì)處理后，也會(huì)產(chǎn)生大量蛋白酶抑制因子。目前已知的植物蛋白酶抑制因子可以分為十大類，許多具有抗癌功能的蔬菜和水果如谷物、馬鈴薯、南瓜等都含有蛋白酶抑制因子，與它們的抗癌功能有一定的關(guān)系。
大豆中已經(jīng)報(bào)道的蛋白酶抑制因子屬于絲氨酸蛋白酶抑制因子。大豆(Glycine max)中的蛋白酶抑制因子主要存在于種子的子葉中，尤以子葉外側(cè)含量豐富，約占總蛋白的6％。大豆中的Kunitz胰蛋白酶抑制因子KTI，分子量為21,000道爾頓，由181個(gè)氨基酸殘基組成，含2個(gè)二硫鍵，活性中心在第63個(gè)氨基酸(精氨酸)和第64個(gè)氨基酸(異亮氨酸)之間。Kunitz胰蛋白酶抑制因子主要抑制胰蛋白酶，對(duì)糜蛋白酶只有微弱的抑制作用。該抑制因子的活性中心和胰蛋白酶結(jié)合非常緊密，形成不可逆復(fù)合物。大豆的Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子BBI，分子量為8,000道爾頓，由71個(gè)氨基酸殘基組成，含有7個(gè)二硫鍵，有2個(gè)不同的活性中心即第16個(gè)氨基酸(賴氨酸)和第17個(gè)氨基酸(絲氨酸)殘基之間及第43個(gè)氨基酸(亮氨酸)和第44個(gè)氨基酸(絲氨酸)殘基之間，分別與胰蛋白酶和糜蛋白酶結(jié)合。目前經(jīng)檢索，未見從大豆中純化組織蛋白酶B抑制因子的研究報(bào)道，也沒(méi)有從大豆或豆粕中直接純化組織蛋白酶B抑制因子的技術(shù)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法。利用本發(fā)明的方法可以純化得到了一種分子量為10kDa的組織蛋白酶B抑制因子。
本發(fā)明涉及的從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括如下步驟(1)取大豆或豆粕研磨成粉，使其顆粒直徑為10μm～50μm，(2)溶入緩沖液中攪拌15小時(shí)～24小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，50％硫酸銨沉淀，(3)將上述沉淀溶解在剛浸沒(méi)量的緩沖液中，于10倍體積的緩沖液中透析18小時(shí)～24小時(shí)，(4)透析后的溶液經(jīng)8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，
(5)將步驟(4)的上清液緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分，(6)將所述收集液緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上，先用200ml緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用100ml緩沖液對(duì)100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集，得到組織蛋白酶B抑制因子。
其中，所述豆粕是指提取大豆油后的殘?jiān)?br> 其中，所述緩沖液優(yōu)選是10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl緩沖液或20mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液。
其中，步驟(2)或(4)所述離心條件優(yōu)選是10,000rpm離心10min。
其中，步驟(5)所述排阻層析柱優(yōu)選是Sephadex G-75或Superdex排阻層析柱。
其中，步驟(6)所述離子交換柱優(yōu)選是DEAE-Toyopearl或CM-Sepharose離子交換柱。
其中，步驟(4)透析后的溶液還可以先經(jīng)蛋白酶或無(wú)機(jī)酸水解處理后，再進(jìn)行下續(xù)步驟。
其中，上述的無(wú)機(jī)酸優(yōu)選是鹽酸。
其中，所述步驟(5)或(6)的順序可以前后交換。
其中，依據(jù)步驟(1)至(6)的方法還可以得到組織蛋白酶L、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶的抑制因子。
利用本發(fā)明的方法純化得到組織蛋白酶B抑制因子，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)分子量為10kDa，從100克大豆或豆粕中可以純化到5mg～10mg組織蛋白酶B抑制因子。用蛋白酶或無(wú)機(jī)酸水解后的純化產(chǎn)物分子量小于10kDa。
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)利用本發(fā)明的方法純化得到組織蛋白酶B抑制因子的藥理作用作進(jìn)一步的說(shuō)明。
組織蛋白酶B抑制因子的活性檢測(cè)方法方法(1)取50μl待檢測(cè)的抑制因子樣品，加入10U組織蛋白酶B，加6μl乙酸buffer(0.1mol/L，pH3.6)調(diào)節(jié)pH成酸性，37℃溫育15min，加入200μl 1％牛血紅蛋白(0.1mol/L乙酸buffer，pH3.6)做底物，37℃溫育1h，加入0.5ml 5％TCA終止反應(yīng)，10,000rpm離心10min，取200μl上清液加入250μl 1mol/L NaOH，加2ml C液(2％NaCO30.5％酒石酸鈉鉀0.5％無(wú)水硫酸銅50∶0.5∶0.5)， 加200μl福林酚，混勻后靜置10分鐘，檢測(cè)750nm光吸收值。對(duì)照同樣處理，但用等量的Tris-HCl緩沖液替代抑制因子樣品(Zhao et al，2002)。
方法(2)用合成的熒光底物Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC檢測(cè)抑制因子對(duì)組織蛋白酶B活性的影響。100μl醋酸鈉緩沖液(100mM，pH4.5或其它適合的pH含0.05％Brij-35，1mM EDTA and 1mM cysteine)，加入Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC至終濃度為0.1mM/l或其它合適的濃度。將10U組織蛋白酶B與待監(jiān)測(cè)的抑制因子混合，用熒光微孔板測(cè)讀儀在25度用355nm波長(zhǎng)激發(fā)光和460nm波長(zhǎng)發(fā)射光檢測(cè)，每20秒一次，共30分鐘(Bown et al.，2004)。
組織蛋白酶B抑制因子的抗腫瘤活性鑒定人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(glioma)，用含10％新生牛血清，pH7.0的DMEM培養(yǎng)液在37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。抑制因子用Tris-HCl緩沖液調(diào)整為0.25mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml三種濃度，無(wú)菌抽濾，每種細(xì)胞設(shè)置5個(gè)處理空白對(duì)照(為培養(yǎng)基和用等體積Tris-HCl緩沖液替代抑制因子)、正常細(xì)胞對(duì)照(用等體積Tris-HCl緩沖液替代抑制因子)、0.025mg/ml，0.05mg/ml和1mg/ml抑制因子，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。將貼壁生長(zhǎng)的Hela細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別用0.25％胰蛋白酶消化至細(xì)胞收縮、細(xì)胞間出現(xiàn)空隙時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，并用含血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，同時(shí)用吸管吹打使細(xì)胞懸起成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(glioma)密度至104個(gè)/ml，以每孔100μl的量傳代于96孔板，次日，細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，吸棄上清液，空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組換10μl buffer A+90μl DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組各孔先加90μl DMEM培養(yǎng)液，再分別加不同濃度抑制因子10μl，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，各孔中加入5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)20μl，然后再培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，每孔加100μl DMSO，10分鐘后紫色沉淀溶解，用酶聯(lián)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)下吸光度值，并以下式計(jì)算存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)存活細(xì)胞百分率＝A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照×100％。抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示大豆組織蛋白酶B抑制因子在0.025～0.1mg/ml終濃度時(shí)，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(glioma)生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)到6～25％和5～20％。
上述實(shí)驗(yàn)證明大豆組織蛋白酶B抑制因子對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(glioma)生長(zhǎng)有顯著抑制效果。因此，該抑制因子有可能進(jìn)一步研究開發(fā)成為抗腫瘤藥物或腫瘤預(yù)防藥物或相關(guān)保健預(yù)防食品的可能。本發(fā)明的技術(shù)方法適合放大生產(chǎn)，利用大豆或制取大豆油后的副產(chǎn)品豆粕均可純化制備該抑制因子，為大豆產(chǎn)品精加工和原料的綜合利用提供了新的途徑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl緩沖液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5，或其它相同功能等緩沖液)中攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)10,000rpm離心10min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl緩沖液中，于10倍體積的Tris-HCl緩沖液中透析過(guò)夜。透析后的溶液經(jīng)10,000rpm離心10min，將上清液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上(Sephadex G-75，或其它功能相同的層析柱)用Tris-HCl緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。將收集液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上(如DEAE-Toyopearl、CM-Sepharose柱或其它功能相同的層析柱)，先用200ml Tris-HCl緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用100ml Tris-HCl緩沖液對(duì)100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術(shù)獲得的產(chǎn)物，按前述活性檢測(cè)方法，檢測(cè)收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE檢測(cè)分子量為10kDa左右，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可以進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤治療藥物或腫瘤預(yù)防藥物。
實(shí)施例2將實(shí)施例1中的緩沖液換成pH7.5的磷酸緩沖液(或其它合適的緩沖液)，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子及獲得的產(chǎn)物。詳細(xì)技術(shù)取大豆或豆粕研磨成粉，溶入磷酸緩沖液中(20mmol/L pH7.5)，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)12,000rpm離心8min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在剛浸沒(méi)量的磷酸緩沖液中，于10倍體積的磷酸緩沖液中透析22小時(shí)。透析后的溶液經(jīng)10,000rpm離心13min，將上清液緩慢加到用磷酸緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上(Sephadex G-75)，用磷酸緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。再將收集液緩慢加到磷酸緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上(DEAE-Toyopearl)，先用200ml磷酸緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用100ml緩沖液對(duì)100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術(shù)獲得的產(chǎn)物，按前述活性檢測(cè)方法，檢測(cè)收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE檢測(cè)分子量為10kDa左右，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可以進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤治療藥物。
實(shí)施例3將實(shí)施例1和2中的層析柱換成其它功能相同的層析柱，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子及獲得的產(chǎn)物。詳細(xì)技術(shù)取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl緩沖液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5)，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)10,000rpm離心10min，50％硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl緩沖液中，于10倍體積的Tris-HCl緩沖液中透析過(guò)夜。透析后的溶液經(jīng)10,000rpm離心10min，將上清液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上(Superdex)用Tris-HCl緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。將收集液緩慢加到用Tris-HCl緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上(DEAE-Sepharose)，先用200ml Tris-HCl緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用100ml Tris-HCl緩沖液對(duì)100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。用此技術(shù)獲得的產(chǎn)物，按前述活性檢測(cè)方法，檢測(cè)收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa左右，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可以進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤治療藥物。
實(shí)施例4在實(shí)施例1、2、3的基礎(chǔ)上，改變層析柱的順序，從大豆或豆粕中純化組織蛋白酶B抑制因子并獲得目的產(chǎn)物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入適當(dāng)?shù)木彌_液中，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)離心，硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量緩沖液中，于緩沖液中透析過(guò)夜。透析后的溶液經(jīng)離心，將上清液緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上，先用緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用緩沖液對(duì)NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。將收集液濃縮，緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技術(shù)獲得的產(chǎn)物，按前述活性檢測(cè)方法，檢測(cè)收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa左右，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可以進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤治療藥物。
實(shí)施例5在實(shí)施例1、2、3、4的基礎(chǔ)上，先用蛋白酶或無(wú)機(jī)酸水解大豆或豆粕，再純化組織蛋白酶B抑制因子并獲得目的產(chǎn)物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入適當(dāng)?shù)木彌_液中，攪拌過(guò)夜，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)離心，硫酸銨沉淀，沉淀溶解在少量緩沖液中，于緩沖液中透析過(guò)夜。透析后的上清液經(jīng)胰蛋白酶水解或鹽酸水解后，加到用緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上，先用緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用緩沖液對(duì)NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集。將收集液濃縮，緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技術(shù)獲得的產(chǎn)物，按前述活性檢測(cè)方法，檢測(cè)收集有組織蛋白酶B抑制活性的部分，分子量為10kDa或小于10kDa，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用，可以進(jìn)一步開發(fā)成腫瘤治療藥物。
權(quán)利要求
1.一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括如下步驟(1)取大豆或豆粕研磨成粉，使其顆粒直徑為10μm～50μm，(2)溶入緩沖液中攪拌15小時(shí)～24小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀，上清液經(jīng)8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，50％硫酸銨沉淀，(3)將上述沉淀溶解在剛浸沒(méi)量的緩沖液中，于10倍體積的緩沖液中透析18小時(shí)～24小時(shí)，(4)透析后的溶液經(jīng)8,000rpm～14,000rpm離心8min～15min，(5)將步驟(4)的上清液緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的排阻層析柱上，用緩沖液分離并分部收集其中有抑制活性的部分，(6)將所述收集液緩慢加到用緩沖液平衡過(guò)的離子交換柱上，先用200ml緩沖液洗滌柱子以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用100ml緩沖液對(duì)100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脫，分部收集，得到組織蛋白酶B抑制因子。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述豆粕是指提取大豆油后的殘?jiān)?br> 3.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述緩沖液是10mmol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖液或20mmol/L、pH 7.5的磷酸緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(2)或(4)所述離心條件是10,000rpm離心10min。
5.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(5)所述排阻層析柱是Sephadex G-75或Superdex排阻層析柱。
6.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(6)所述離子交換柱是DEAE-Toyopearl或CM-Sepharose離子交換柱。
7.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，步驟(4)透析后的溶液還可以先經(jīng)蛋白酶或無(wú)機(jī)酸水解處理后，再進(jìn)行下續(xù)步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述的無(wú)機(jī)酸是鹽酸。
9.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，所述步驟(5)或(6)的順序可以前后交換。
10.如權(quán)利要求1所述的一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子-組織蛋白酶B抑制因子的方法，其特征是，依據(jù)步驟(1)至(6)的方法還可以得到組織蛋白酶L、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶的抑制因子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從大豆或豆粕中純化制備抗腫瘤因子－組織蛋白酶B抑制因子的方法，包括大豆或豆粕研磨、攪拌、沉淀、透析、排阻層析柱、離子交換柱分離、洗脫、分部收集等步驟；利用本發(fā)明的方法純化制備的大豆組織蛋白酶B抑制因子對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(glioma)生長(zhǎng)有顯著抑制效果，為一步研究開發(fā)成為抗腫瘤藥物或腫瘤預(yù)防藥物或相關(guān)保健預(yù)防食品以及大豆產(chǎn)品精加工和原料的綜合利用提供了新的途徑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1682903SQ20051004253
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日
發(fā)明者趙小凡, 王金星 申請(qǐng)人:山東大學(xué)