專(zhuān)利名稱(chēng)：狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及克隆獲得的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狐貍是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的毛皮獸，其生長(zhǎng)主要受垂體產(chǎn)生和釋放的生長(zhǎng)激素來(lái)控制，在達(dá)到體成熟后，生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生和釋放隨之減少。而生長(zhǎng)激素又受到動(dòng)物本身下丘腦產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素釋放激素和生長(zhǎng)激素釋放抑制激素的雙重控制。其中生長(zhǎng)激素釋放激素促進(jìn)垂體產(chǎn)生和釋放生長(zhǎng)激素，而生長(zhǎng)激素釋放抑制激素則抑制生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生。二者協(xié)調(diào)作用，共同維持狐貍的生長(zhǎng)速度。生長(zhǎng)激素釋放激素在丘腦下部的弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核產(chǎn)生，合成后即經(jīng)軸突運(yùn)輸并分泌到正中隆起，由此經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體。然后刺激腺垂體產(chǎn)生生長(zhǎng)激素。以人的生長(zhǎng)激素釋放激素為例加以說(shuō)明人生長(zhǎng)激素釋放激素的前體是由108個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈，其中N端前20個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，在穿膜時(shí)被切除，經(jīng)過(guò)再加工，成熟的人生長(zhǎng)激素釋放激素含有44個(gè)氨基酸殘基，44肽的順序?yàn)?NH2-Tyr-Ala-Asp-Ala-IIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-A Ia-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Ar g-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-COOH。該成熟蛋白經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)到達(dá)腺垂體，并與分泌GH 的嗜酸性細(xì)胞的膜上GHRH受體(GHRH-RP)結(jié)合，GHRH與受體結(jié)合后先激活一種對(duì)霍亂毒素敏感的(is蛋白，進(jìn)而(is激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使ATP轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP，導(dǎo)致cAMP 水平上升。而cAMP水平的上升又會(huì)促進(jìn)cAMP依賴(lài)性蛋白酶激酶A的調(diào)節(jié)亞基構(gòu)象的改變并活化，促進(jìn)相關(guān)蛋白的磷酸化，進(jìn)而影響到細(xì)胞的活性。cAMP引起的GH分泌有Ca2+依賴(lài)性，當(dāng)GHRH作用到生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞時(shí)，60秒內(nèi)會(huì)使Ca2+的濃度提高，從而促進(jìn)GH分泌。 有證據(jù)表明Ca2+的阻斷可以終止cAMP對(duì)GH的釋放作用。由此可見(jiàn)GHRH對(duì)GH的分泌是通過(guò)cAMP與Ca2+介導(dǎo)的，通過(guò)該過(guò)程調(diào)節(jié)GH的合成與釋放[1]。由于GHRH呈脈沖式釋放， 相應(yīng)的垂體的GH也呈脈沖式波動(dòng)。生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH) —般為44個(gè)氨基酸的多肽，完整的生物學(xué)活性決定于氨基酸的第1- 個(gè)氨基酸，半衰期7-50分鐘，可見(jiàn)其作用時(shí)間之短。不同動(dòng)物的生長(zhǎng)激素釋放激素分子大小略有不同，豬、牛、狗、人和綿羊等幾種動(dòng)物的GHRH蛋白發(fā)揮作用的活性形式是44個(gè)氨基酸殘基的小肽。它們的同源性很高。如下所示狗YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGAKVRL豬YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGARVRL牛YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL人YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL綿羊YADAIFTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQGAKVRL相對(duì)應(yīng)的不同動(dòng)物生長(zhǎng)激素釋放激素的cDNA核苷酸序列的大小也有所不同，人的生長(zhǎng)激素釋放激素最早在1974被分離純化并鑒定出來(lái)β]。目前很多動(dòng)物包括人的生長(zhǎng)激素釋放激素cDNA基因已經(jīng)被克隆并公之于眾。人的cDNA序列為327個(gè)核苷酸，小鼠312，
3大鼠315，狗、牛、豬均為321個(gè)。多數(shù)序列都進(jìn)行了專(zhuān)利保護(hù)。如中國(guó)專(zhuān)利02100065. 4保護(hù)了羊的生長(zhǎng)激素釋放激素的cDNA基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。00813372. 7(超級(jí)活性的豬生長(zhǎng)激素釋放激素類(lèi)似物)保護(hù)了優(yōu)化了的豬GHRH的
核苷酸和氨基酸序列。03822291. 4 (GHRH類(lèi)似物)保護(hù)了優(yōu)化了的人GHRH的核苷酸序列和氨基酸。200610017214. 5保護(hù)了促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)、提高仔豬免疫力的GHRH藥物及制備方法。200510061609. 0保護(hù)了一種能促進(jìn)人體長(zhǎng)高的GHRH藥物及其制劑。200710068659. 0保護(hù)了鹿茸促生長(zhǎng)釋放因子(DEER GHRF)提取及其制備方法。CN1615151 (用于治療慢性病個(gè)體的質(zhì)粒介導(dǎo)的補(bǔ)充)和CN1649496 (改變個(gè)體的瘦體重和骨特性的組合物和方法)保護(hù)了根據(jù)不同動(dòng)物基因序列進(jìn)行了優(yōu)化的GHRH的人工序列。CN1635898對(duì)具有超級(jí)活性的豬生長(zhǎng)激素釋放激素類(lèi)似物進(jìn)行了保護(hù)。美國(guó)專(zhuān)利7，351，815和7，361，642均對(duì)犬的生長(zhǎng)激素釋放激素的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了保護(hù)。早在1997年，Draghia-Akli等通過(guò)肌肉注射豬GHRH表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)豬體重增加的效果[3]后續(xù)的實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了同樣的結(jié)果[4’5’6]。在狗[7]、綿羊[8]體內(nèi)也獲得了較成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種克隆獲得的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素cDNA及其應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，我們根據(jù)其他動(dòng)物GHRH的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物上游引物為(如 SEQ ID No. 5 所示)5' ATGCCACTCTGGGTGTTC 3'，下游引物為(如 SEQ ID No. 6 所示)5' TCATCCTTGGGAGTTCC 3'。然后制備狐貍下丘腦的總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR，最后克隆獲得了狐貍GHRH的cDNA。其全序列如SEQ IDNo. 4所示，其中GHRH成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，它們分別編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID No. 2和 SEQ ID No. 1 所示。根據(jù)本發(fā)明提供的狐貍GHRH成熟肽的cDNA，可以其為目的基因，采用真核表達(dá)載體如常用的PVAX1，將目的基因插入載體中，構(gòu)建成真核表達(dá)載體，肌肉注射入狐貍腿部肌肉中，可獲得狐貍生長(zhǎng)速度加快，體重增加明顯的結(jié)果。也可利用本發(fā)明提供的狐貍GHRH 全序列，將其在常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)，獲得狐貍GHRH，用于制備可促進(jìn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物狐貍的生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒的PCR鑒定圖，其中1 :DL-2000plus Marker (5kb, 3kb, 2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2，3 陰性克隆；4，5 陽(yáng)性克隆。圖2為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19-GHRHS酶切鑒定圖，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, Ikb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 質(zhì)粒 pMD 19-GHRHS ；3 :PCR 鑒定；4 陰性對(duì)照；5 =BamH I 單切；6 =Sph I 單切；7 =Sph I+BamH I 雙切。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAXl-GHRHS酶切鑒定圖，其中1 :DL_2000 Marker (2kb, lkb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp) ；2 :質(zhì)粒 pVAXI-GHRHS ；3 =BamH I 單切；4 : Not I單切；5 :PCR鑒定；6 陰性對(duì)照；7 =Not I+BamH I雙切。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以狐貍GHRH成熟肽的核苷酸序列為目的基因，以pVAXl為真核表達(dá)載體，將目的基因插入載體中，構(gòu)建成真核表達(dá)載體，肌肉注射入狐貍腿部肌肉中，可獲得狐貍生長(zhǎng)速度加快，體重增加明顯的結(jié)果。載體構(gòu)建過(guò)程如下用PCR方法將人生長(zhǎng)激素的信號(hào)肽基因序列與狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素的成熟肽基因序列串聯(lián)，連接到T載體上(pMD19-GHRHS)，再用BamH I和EcoR I 分別雙切T載體上的目的基因和pVAXl空載體。將目的基因克隆入pVAXl載體中，經(jīng)PCR 和測(cè)序鑒定后(參見(jiàn)圖1)，再將PMD19-GHRHS和pVAXl-GHRHS載體進(jìn)行酶切鑒定(參見(jiàn)圖 2和3)。證實(shí)獲得了 pVAXl-GHRHS表達(dá)載體。將純化后的表達(dá)載體以50 μ g-100 μ g/只， 分別注射入20只2-4月齡的幼狐腿部肌肉，在取皮時(shí)稱(chēng)重，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組平均增重高達(dá)800g。其中含人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的上游引物ATGGCTACAGGCTCCCGGAC(如SEQ ID No. 7 所示)；下游引物CTATCAGAGTCGTACCTTTGCT (如 SEQ ID No. 8 所示)；PCR 反應(yīng)條件 950C IOmin, 94°C 30sec，53°C 30sec，72°C 30sec30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；酶切條件37°C。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。參考文獻(xiàn)1. Gracia-Navarro F, Castano JP, Malagon MM, Sanchez-Hormigo A, Luque RM, Hickey GJ, Peinado JR, Delgado Ε, Martinez-Fuentes AJ. Research progress in thestimulatory inputs regulating growth hormone (GH) secretion. Comp BiochemPhysiol B Biochem Mol Biol.2002 132(1) :141-50.2. Currie B. L, Johansson K. N. , Greibrokk T. , Folkers K. , Bowers C. Y. Identification and purification of factor A-GHRH from hypothalami which releasesgrowth hormone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974,60(2) :605_9o3. Draghia-Akli R, Fiorotto ML. A new ρIasmid-mediated approach tosupplement somatotropin production in pigs. J Anim Sci. 2004 82(13_suppl) E264-9。4.陳理銀，郭榮富，相振田，馮宇。豬生產(chǎn)中pGRF基因質(zhì)粒應(yīng)用研究，豬業(yè)科學(xué)， 2006 8 :14-6.5.張勇，周安國(guó)，吳德，朱宇旌，王康寧，楊鳳。仔豬骨骼肌注射pGRF基因質(zhì)粒的促生長(zhǎng)及代謝調(diào)控效應(yīng)研究，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003 34(2) :147-51.6.張利宇，孫寶忠，王敏，種京華。生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)基因質(zhì)粒的研究進(jìn)展，黑龍江畜牧獸醫(yī)，20069 :19-21.7. Draghia-Akli R, Cummings KK, Khan AS, Brown PA, Carpenter RH. Effectsof plasmid-mediated growth hormone releasing hormone supplementation in young, healthy Beagle dogs. J Anim Sci.2003 81(9) :2301-10.8. Meng QY,Chen ZQ,Yu ZQ,Xie QF,Li N. Increased body weight viainjecting myogenic Expression gowth hormone-releasing hormone (GHRH) ρIasmidDNA into sheep. Anim Biotech. 2004 15(2) :175-92.
權(quán)利要求
1.一種狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素，其特征在于，其成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所7J\ ο
2.如權(quán)利要求1所述的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素，其特征在于，包括其前體肽的完整的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.編碼權(quán)利要求1所述的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素的成熟肽的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.編碼權(quán)利要求2所述的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 4 所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述cDNA的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主。
7.權(quán)利要求3或4所述的cDNA在制備可促進(jìn)狐貍生長(zhǎng)的活性物質(zhì)中的應(yīng)用。
8.含有權(quán)利要求1或2所述的狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素的活性物質(zhì)，其可促進(jìn)狐貍生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了狐貍生長(zhǎng)激素釋放激素cDNA基因的全長(zhǎng)核苷酸序列和成熟肽的核苷酸序列以及其分別編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。狐貍的生長(zhǎng)激素釋放激素的cDNA序列是一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，共321個(gè)核苷酸序列，共編碼106個(gè)氨基酸；其成熟肽由132個(gè)核苷酸序列編碼，共編碼44個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明可用于狐貍等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的促生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K38/25GK102399284SQ20101028638
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者劉維全, 劉芃芃, 王吉貴, 齊順章 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)